RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems

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1 RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems Wenyan Jiang, David Bikard, David Cox, Feng Zhang, and Luciano A. Marraffini Nature Biotechnology, 31, , 2013 Nadja Kleisch Biotechnologie, 4tes Semester, , Universität des Saarlandes 1

2 Inhaltsverzeichnis Einleitung CRISPR-Cas System duale-rna:cas9 Ziele der Arbeit Ergebnisse Genom-Editing mithilfe dualer-rna:cas9 Zielansprüche der dualen-rna:cas9 Genom-Editing in S. pneumoniae Genom-Editing in E. coli Zusammenfassung 2

3 Einleitung 3

4 CRISPR-Cas System CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Abschnitte sich wiederholender DNA, die im Erbgut von vielen Bakterien und Archaeen auftreten Länge variiert zwischen 23 und 47 bp Sequenzen wechseln sich ab mit Spacern, Teile von Fremd- DNA im CRISPR-Bereich (21 bis 72 bp) Resistenzmechanismus gegen das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide CRISPR Spacer 4

5 CRISPR-Cas System Teil 1: 1) Phage transferiert doppelsträngige DNA 2) Cas-Proteine (CRISPR-associated) prozessieren und integrieren DNA in CRISPR-Bereiche Teil 2: 1) Anfangssequenz eines CRISPR- Bereiches agiert als Promotor Transkription des gesamten CRISPR-Bereiches 2) mithilfe des Cas-Komplexes wird es in Einzelteile (crrna) zerlegt 3) zusammen mit Cas-Proteinen können sie DNA bzw. RNA erkennen und schneiden 5

6 CRISPR-Cas System Besonderheit: auch über homologe Rekombination eingefügte Spacer- Sequenzen, lösen bei Bakterien den Resistenzmechanismus aus werden Spacer-Sequenzen entfernt keine Reaktion Idee: System um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden und z. B. andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle einfügen Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen 6

7 duale-rna:cas9 CRISPR Spacer Cas9 ist eine doppelsträngige DNA Endonuklease benötigt eine PAM gleich stromabwärts der Zielregion als Erkennungssequenz kann als Ribonukleoproteinen bestimmte RNA-Sequenzen binden und mit deren Hilfe gezielt DNA schneiden pre-crrna crrna/tracrrna Duplex crrna/tracrrna Hybrid Cas PAM crrna tracrrna Prototspacer = CRISPR associated = protospacer-adjacent motif = CRISPR RNA = trans acting RNA = Zielregion Hybrid dient als Guide für Cas9 7

8 Ziel der Arbeit Einführung eines CRISPR-Cas System, das als Ziel chromosomale DNA schneidet, führt zum Zelltod mithilfe der duale-rna:cas9 kann gezielt chromosomale DNA geschnitten werden Ziel: markerlos Mutationen ins Genom einbringen indem der Zelle ein Editing Template zur Verfügung gestellt wird durch Integration des Editing Templates über homologe Rekombination können die Zellen, den Zelltod umgehen 8

9 Ergebnisse 9

10 Genom-Editing mithilfe dualer-rna:cas9 DNA aus dem Stamm Streptococcus Pneumonoie crr6 wird in die Stämme R6 8232,5 und R6 370,1 transformiert Stamm Genotyp Aufgabe S. Pneumoniae crr6 S. Pneumoniae R6 8232,5 S. Pneumoniae R6 370,1 enthält duale RNA:Cas9-basierte CRISPR-System enthält DNA aus Bakteriophage im srta chomosomalen Lokus enthält eine Punktmutation in der PAM-Region, die im srta Lokus integriert ist schneidet DNA aus Bakteriophage φ8232,5 wird von dualer-rna: Cas 9 geschnitten nicht anfällig für das duale- RNA:Cas9 Erwartung: R6 8232,5 keine Transformanten R6 370,1 Transformanden 10

11 Ergebnis sowohl R6 8232,5 als auch R6 370,1 Transformanden wurden generiert genetische Analyse ergab, dass der srta Lokus mit Bakteriophagen DNA durch homologe Rekombination ausgetauscht wurde Integration des Wildtyp srta Lokus aus crr6 Überprüfung: Genom-Editing ist möglich 11

12 Zielansprüche der dualen-rna:cas9 gezielte Änderungen im Genom nur möglich: wenn Cas 9 im Editing Template keine Zielsequenz erkennt z.b. Gendeletion und Substitution Problem: Einzelbasenmutation nur eine Mutation in der PAM-Region oder manche Mutationen innerhalb des Protospacers führt zum nicht erkennen durch Cas9 Muster der PAM-Region sind nicht bekannt nicht jedes Muster dient als Erkennungssequenz 12

13 Analyse der PAM-Region befindet sich direkt stromabwärts vom Protospacer Länge 5 bp Möglichkeiten Ziel: Identifikation/Bewertung der PAM-Sequenzen, die von Cas9 erkannt werden Durchführung: randomisierte Sequenzen wurden hinter dem Protospacer angefügt und in crr6 und R6 Zellen transformiert Ermittlung Verhältnisses von crr6 zu R6 Zellen 13

14 Genom-Editing in S. pneumoniae Strategie: Konstruktion eines Stamms crr6k, in den man leicht neue Spacer einfügen kann um Aktivität zu messen soll eine Mutation ins ß-Galactosidase Gen (bgaa) eingebracht werden um dieses Gen auszuschalten, wird beim Editing Template sowohl die PAM-Sequenz als auch die Protospacer Sequenz mutiert. 14

15 Genom-Editing in S. pneumoniae Editing Template wird zusammen mit Targeting Konstrukt in crr6rc Zellen transformiert mit den Editing Templates konnten 10x mehr Transformaden generiert werden als wie mit der Kontrolle (Wildtyp DNA) 15

16 Genom-Editing in E. coli E. coli erhält ein plasmid-basiertes CRISPR-Cas System Ziel: Punktmutation von A nach C im rpsl Gen führt zu einer Streptomycin Resistenz, gut zur Effizienzmessung Mutation wird über Editing Template W542 (Oligonukleotid) eingebracht als Kontrolle wurde CRISPR:0 Konstrukt Co-transformiert, enthält keine Spacer Name Komponenten Resistenz pcas9 Plasmid Gene für tracrrna, Cas9, Chloramphenicol pcrispr:rpsl CRISPR + Spacer, codieren für Wildtyp Allel von rpsl Kanamycin 16

17 nur Streptomycin Resistente Zellen nach der Transformation des pcrispr::rpsl Plasmid Rekombination wird durch duale-rna-cas9 induziert wesentlich weniger Kanamycin-resistente Kolonien, die das pcrispr::rpsl Konstrukte tragen als die das Kontroll-Konstrukt tragen Effizienz nicht hoch 17

18 Zusammenfassung CRISPR-Cas System kann zum Genome Editing verwendet werden Vorteile: multiplex Editing ist möglich keine Selektionsmarker nötig schnell und effizient wenn CRISPR-System bereits vorhanden Nachteile: plasmid-basiertes CRISPR-Cas Systeme noch nicht ausgereift hoher Hintergrund Deletion des Spacers 18

19 Literaturverzeichnis Jiang W 1, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. (Jan 2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems Nat Biotechnol Mar;31(3): doi: /nbt Epub 2013 Jan 29 Horvath, P.; Barrangou, R. (2010). "CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea". Science 327 (5962): Kramer, Dan (Feb 2013). "Editing Genomes with the Bacterial Immune System". Scitable (Nature). Retrieved 6 April Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N et al. (Feb 2013). "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems". Science 339 (6121): doi: /science PMC PMID Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE et al. (Feb 2013). "RNAguided human genome engineering via Cas9". Science 339 (6121): Sander JD, Joung JK (Apr 2014). "CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes". Nature Biotechnology 32 (4): doi: /nbt PMID

20 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Fragen? 20