Molekulargenetische Charakterisierung von SO 4. -reduzierenden Bakterien (SRB) aus Bergbaustandorten

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1 Institut für Biowissenschaften, AG Umweltmikrobiologie Innovationsforum GEOBIOTECHNOLOGIE GeoBio2011: Workshop 2 Sulfatreduktionsprozesse im Bergbau Molekulargenetische Charakterisierung von SO reduzierenden Bakterien (SRB) aus Bergbaustandorten J.H. Fair (Greenpeace) Sanierung P. Radke (LMBV) Dipl. nat. Claudia Gniese Dresden, 03. November

2 Das Problem saure Grubenwässer = AMD (acid mine drainage) Verwitterung sulfidischer Minerale z.b. Pyrit FeS 2 + 3,5 O 2 + H 2 O Fe SO H + Versauerung Grundwasser Biosphäre chemische Sanierung biologische 2

3 Biologische Sanierung z.b. durch Stimulation von sulfatreduzierenden Bakterien (SRB) Prozessstrategen sollten bekannt sein! 10 µm Brysch et al Wer? Identifizierung 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels 3. Wie? Kultivierung/Optimierung (Labor) 4. Wie? Anwendung und Monitoring (Feld) 3

4 Beispiel: Sanierung mit autotrophen SRB Verringerung der DOC-Fracht Stimulation autotropher SRB mit H2+CO2 Dr. S. Wagner Porenwasser = AMD (Bilek & Wagner 2008) Festbett = Sand 4

5 1. Wer? Identifizierung Molekulargenetische Analyse: Klonbankanalyse Filtration über 0.22µm -80 C Flüssig- oder Feststoffproben DNA-Extraktion genspezifische PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Vervielfältigung 5

6 1. Wer? Identifizierung Molekulargenetische Analyse: Klonbankanalyse Filtration über 0.22µm -80 C Flüssig- oder Feststoffproben DNA-Extraktion genspezifische PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ribosomale RNA (16S rrna): 16S rrna Gen = 16S rdna universell verbreitet konservierte und variable Bereiche hinreichende Länge (16S rrna = 1540 Nukleotide) spezifisches PCR-Produkt 6

7 1. Wer? Identifizierung Klonbankanalyse Restriktion spezifisches PCR-Produkt Ligation Plasmid Multiple Cloning Site Wachstum Transformation/Klonierung in E. coli Blau-Weiß-Detektion 7

8 1. Wer? Identifizierung Klonbankanalyse Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) 1. PCR mit Plasmiden der Klone 2. PCR-Produkte schneiden Größenstandards Agarose-Gelelektrophorese 4. Auswertung Sequenzierung 8

9 1. Wer? Identifizierung Klonbankanalyse Desulfovibrio (99%) 1. Wer? Identifizierung 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels 9

10 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels Klonbankanalyse CO 2 +H 2 Desulfovibrio sp. clone B4 Gattung Desulfovibrio anaerob Sulfatreduktion heterotroph (organische Substrate) Acetat + CO 2, wenn H 2 (einige Stämme) 10

11 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels Klonbankanalyse CO 2 +H 2 72% Desulfovibrio sp. Porenwasser 6% Desulfobacterium sp. 5% Desulfosporosinus sp. 3% unc. eubac. WCHB1-03 2% sulfate-reduc. bac. STP23 weitere 8% (z.b. 2% Acetobacterium sp.) 76% Desulfovibrio sp. Festbett 11% Desulfosporomusa sp. 3% Desulfosporosinus sp. 3% unc. bac. clone IA-23 weitere 5% (z.b. 1% Acetobacterium sp.) Gattung Desulfovibrio anaerob Sulfatreduktion heterotroph (organische Substrate) Acetat + CO 2, wenn H 2 (einige Stämme) 11

12 Biologische Sanierung z.b. durch Stimulation von sulfatreduzierenden Bakterien (SRB) 1. Wer? Identifizierung 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels 3. Wie? Kultivierung / Optimierung (Labor) 4. Wie? Anwendung und Monitoring (Feld) geringe bakterielle Diversität nahezu gleiche Verteilung in Porenwasser und Festbett Dominanz von Desulfovibrio sp. Kommensalismus zwischen Acetobacterium sp. und Desulfovibrio sp. 12

13 3. Wie? Kultivierung / Optimierung (Labor) Anaerobentopf (30 C, H 2 /CO 2, 80:20) Gelrite Verdünnungsreihe I II VIII µl Gelrite Kolonie 28d a b ( c ) CO 2 +H 2 13

14 3. Wie? Kultivierung / Optimierung (Labor) Anaerobentopf (30 C, H 2 /CO 2, 80:20) Gelrite Verdünnungsreihe I II VIII µl Gelrite Kolonie 28d a b ( c ) CO 2 +H 2 neue Verdünnungsreihe 32d frisches Medium Probe für TRFLP 48d 36d Kolonie von Festmedium 100 µl 34d Probe für FISH 14

15 Biologische Sanierung z.b. durch Stimulation von sulfatreduzierenden Bakterien (SRB) 1. Wer? Identifizierung 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels 3. Wie? Kultivierung / Optimierung (Labor) 4. Wie? Anwendung und Monitoring (Feld) Kommensalismus zwischen Acetobacterium sp. und Desulfovibrio sp. Sanierung mit CO 2 + H 2 möglich 15

16 4. Monitoring FISH (Fluorescence in situ Hybridization) Fixierung PFA oder EtOH Hybridisierung EUB 338 / SRB 385 rrna Gegenfärbung mit DAPI (4, 6-diamino- 2-phenylindole) DNA Detektion Detektion Epifluoreszenzmikroskop 16

17 Phasenkontrast EUB 338 SRB 385 Desulfovibrio und Acetobacterium 10 µm Brysch et al.,

18 4. Monitoring TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) 1. PCR 2. Restriktion 3. Analyse Denaturierung Primeranlagerung Strangverlängerung Denaturierung 25-30x Beckman Coulter CEQ

19 4. Monitoring TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) Dye Signal clone B7 AluI restricted Desulfovibrio sp Auswertung Fragmentdatenbank aus Klonbankanalyse Size (nt) P5 filter AluI restricted Desulfovibrio sp Dye Signal Screening ähnlicher Proben Size (nt) 19

20 Biologische Sanierung z.b. durch Stimulation von sulfatreduzierenden Bakterien (SRB) 1. Wer? Identifizierung 2. Was? Ableitung des Stoffwechsels 3. Wie? Kultivierung / Optimierung (Labor) 4. Wie? Anwendung und Monitoring (Feld) 20

21 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 21