Labordiagnostik bei Infektion

Transkript

1 Stefan Borgmann Labordiagnostik bei Infektion Klinikum Ingolstadt

2 Labordiagnostik bei Infektionen 2 Serologische Marker - CRP - Prokalzitonin (PCT) Mikrobiologische Diagnostik - Direktkultur - Abstriche - Bunte Reihen - MALDI-TOF - PCR

3 CRP & PCT als Infektmarker 3 Hinweis auf Infektion? CRP Prokalzitonin (PCT)

4 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: Leber IL-6 Entzündung: - Tumor - Trauma - Infektion - Autoimmun 4 Fettzellen Makrophagen IL-6 CRP

5 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: Leber IL-6 CRP IL-6 CRP 5 Fettzellen Makrophagen MΦ CRP Zelltrümmer Phosphocholin N + O O P OH OH

6 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: Leber IL-6 CRP IL-6 CRP 6 Fettzellen Makrophagen MΦ CRP Zelltrümmer Phosphocholin N + O O P OH OH

7 CRP & PCT als Infektmarker CRP Synthese: Leber IL-6 7 Fettzellen Makrophagen IL-6 CRP CRP CRP Phosphocholin N + O O P OH OH

8 CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen??? PCT Gen(e) CALC 1: CGRP* / Kalzitonin / Katakalzin CALC 2: CGRP*-2 CALC 3:??? CALC 4: Amylin CGRP: Calcitonin gene related peptide*

9 CRP & PCT als Infektmarker Splicen mrna PCT Gen(e) CALC 1: CGRP* / Kalzitonin / Katakalzin Prozessierung Aminosäuren CGRP: Calcitonin gene related peptide*

10 CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen??? PCT Gen(e) CALC 1: Kalzitonin Synthese - Kompliziert - Wissenschaftliche Überraschungen möglich

11 CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen??? PCT Gen CALC 1: Prä-Pro-Kalzitonin Pro-Kalzitonin C-Zellen Schilddrüse Kalzitonin

12 CRP & PCT als Infektmarker PCT Syntheseort: Neuroendokrine Zellen??? PCT Gen CALC 1: Prä-Pro-Kalzitonin Pro-Kalzitonin? Niere = Darm > Lunge >>> Rest = Kein PCT PCT = Systemische Infektion

13 CRP & PCT als Infektmarker Bakterielle Infektion PCT Anstieg / Peak Abtötung Bakterien 6-8 h HWZ h PCT [ng/ml] % - 30% 30 40% 10 15% Verlauf [Tagen] Rückgang 25-35% pro 24 h 0,68 ng/ml

14 CRP & PCT als Infektmarker Anstieg / Peak Bakterielle Infektion PCT CRP Abtötung Bakterien 6-8 h HWZ h 6-12 h HWZ h PCT [ng/ml] % - 30% 30 40% 10 15% Verlauf [Tagen] Rückgang 25-35% pro 24 h 0,68 ng/ml Rückgang langsamer - abhängig vom Ausmaß Schädigung Gewebe 3-4 Tage

15 Zusammenfassung I [CRP] : Ausmaß der Entzündung / Schädigung CRP : Unspezifisch, verschiedene Entzündungen [PCT] : Ausmaß der Infektion & Lokalisation PCT : Bakterielle Infektionen (Ausnahmen!!!) Nicht bei Infektionen der Extremitäten Beteiligung neuroendokrine Zellen

16 Untersuchungsmaterialien 16??????

17 Untersuchungsmaterialien 17

18 Untersuchungsmaterialien 18 Flüssig- Medium

19 Untersuchungsmaterialien 19 Flüssig- Medium

20 Untersuchungsmaterialien Flüssig- Medium 10 ml* 20 Flüssig- Medium *

21 Untersuchungsmaterialien 21 Flüssigmedium

22 Untersuchungsmaterialien Proben-Röhrchen: 22 Beschickung durch Chirurgin Flüssigmedium

23 Untersuchungsmaterialien 4 cm ml Flüssigmedium

24 Untersuchungsmaterialien 24 Abstrich

25 3-Ösenausstrich Abstrichtupfer mit Bakterien 1. Flüssig- Medium 3-Ösenausstrich

26 3-Ösenausstrich Sterile Öse Flüssig- Medium 3-Ösenausstrich

27 3-Ösenausstrich Frische Öse Flüssig- Medium 3-Ösenausstrich

28 3-Ösenausstrich C 37 C 20%O 2 0%O 2 Beimpfte Kulturplatte Aerobe Bakterien Anaerobe Bakterien Flüssig- Medium 3-Ösenausstrich

29 3-Ösenausstrich C 37 C 20%O 2 0%O 2 Beimpfte Kulturplatte Aerobe Bakterien Anaerobe Bakterien

30 3-Ösenausstrich 30 Getrübte Bouillon Konfluierendes Bakterienwachstum Bakterienkolonie

31 3-Ösenausstrich Nach Anreicherung ++ Kein Wachstum + Semiquantitative Beurteilung der Bakterienmenge

32 3-Ösenausstrich Nach Anreicherung ++ Kein Wachstum Punktat + Blutkulturflasche

33 3-Ösenausstrich Nach Anreicherung ++ Kein Wachstum + Nach Anreicherung

34 3-Ösenausstrich Nach Anreicherung ++ Kein Wachstum + Nach Anreicherung Bakterien +++ +

35 Gramfärbung Aerob / Anaerob 35 Gram positiv Gram- Färbung Stäbe Kokken Gram negativ 1. Anfärben, blaue Farbe 2. Entfärbung, Alkohol 3. Gegenfärben, rote Farbe Stäbe Kokken Stäbe Kokken

36 Bakterielle Zellwand 36 Zytoplasma Plasmamembran Gram positiv Periplasmatischer Raum Peptidoglykan Gram negativ Äußere Membran Antibiotika-Resistenz - Aztreonam - - Vancomycin* - - Linezolid - - Clindamycin - - Teicoplanin* -

37 Bakterielle Zellwand 37 Zytoplasma Plasmamembran Gram positiv Periplasmatischer Raum Peptidoglykan Gram negativ Äußere Membran Entzündungsreaktion Gram positiv <<< Gram negativ

38 Bakterien - Identifizierung 38 Gattung Spezies Staphylococcus Vorname aureus Nachnahme - Mikroskopisches Präparat (Gram, Ziehl Neelsen, etc.) - Direktanzucht (Kulturplatten, Selektivplatten) - Identifizierung : -- Stoffwechselleistungen (bunte Reihen) -- (Gaschromatographie - Anaerobier)

39 Bakterien - Identifizierung 39 Gattung Spezies Staphylococcus Vorname aureus Nachnahme - Mikroskopisches Präparat (Gram, Ziehl Neelsen, etc.) - Direktanzucht (Kulturplatten, Selektivplatten) - Identifizierung : -- Stoffwechselleistungen (bunte Reihen) -- Gaschromatographie (Anaerobier) Kligler API System

40 Bakterien - Identifizierung 40 Gattung Spezies Staphylococcus Vorname aureus Nachnahme Stoffwechselleistungen (bunte Reihen): Über Nacht Kulturen - Zeit-intensiv Kligler API System

41 MALDI-TOF - Identifizierung Optics + I Data acquisition m 1 + m 2 + m MALDI target plate N 2 -Laser Variable-voltage grid m/z Field free drift region Ground grid Source chamber Linear detector

42 MALDI-TOF - Identifizierung Optics + I Data acquisition m 1 + m 2 + m MALDI target plate N 2 -Laser Variable-voltage grid m/z Ground grid Source chamber Dauer pro Messung: 1 min Linear detector

43 MALDI-TOF - Identifizierung 43 C. difficile : 3 verschiedene Stämme (A C)

44 Polymerase Kettenreaktion - PCR 44 Kolonie Spezifisches Gen? Spezies / Resistenz Chromosom

45 PCR: Extraktion DNA 45 Kolonie Spezifisches Gen? Spezies / Resistenz Temperatur Chromosom Thermocycler Zeit

46 PCR - Amplifikation Kolonie Spezifisches Gen amplifiziert Behälter 46 Gel Chromosom Thermocycler Salzlösung

47 PCR - Amplifikation 47 Kolonie Spezifisches Gen amplifiziert - Chromosom Thermocycler +

48 PCR - Amplifikation 48 - Größenstandard Positiv Negativ +

49 PCR - Amplifikation 49 - MRSA PCR + neg. positiv neg. positiv neg.

50 PCR 50 Temperatur G C A T 37 C Zeit

51 PCR: Schmelzen DNA 51 Temperatur G C A T 96 C Zeit Melting

52 PCR: Anlagern der Primer 52 Temperatur G C A T 60 C Primer Zeit Primer lagern sich an Annealing

53 PCR: Anlagern der Primer 53 Temperatur G C A T 60 C Primer Primer Zeit Primer lagern sich an annealing

54 PCR: Verlängerung der Primer 54 Temperatur G C A T 72 C Primer Polymerase Zeit Polymerase verlängert Primer Elongation

55 PCR: Verlängerung der Primer 55 Temperatur G C A T 72 C Primer Zeit Polymerase verlängert Primer Elongation

56 PCR: Verlängerung der Primer 56 Temperatur G C A T Zeit

57 PCR: Verlängerung der Primer 57 G C A T

58 PCR 58 G C A T 96 C 60 C 72 C 96 C. Vervielfältigung Zielsequenz

59 Universelle PCR 59 Thermozykler Sequenzierautomat Konserviertes Gen: Alle Bakterien Chromosom

60 Universelle PCR 60 Thermozykler Sequenzierautomat Konserviertes Gen 16S rrna: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien Chromosom

61 Universelle PCR 61 Thermozykler Sequenzierautomat Konserviertes Gen 16S rrna: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien PCR Produkte identisch

62 Universelle PCR 62 Thermozykler Sequenzierautomat Konserviertes Gen 16S rrna: Alle Bakterien Primer binden bei allen Bakterien PCR Produkte FAST identisch E. coli P. aeruginosa S. aureus

63 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

64 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Plastikbeutel Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

65 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

66 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

67 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Ultraschallbad Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

68 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Biofilm Ultraschallbad Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

69 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Biofilm Ultraschallbad Kultur & eubakterielle PCR Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

70 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Kultur & eubakterielle PCR Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46

71 Universelle PCR 71 Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 10 Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Kultur Staphylokokken Koagulase neg. N = 2 V.a. Infektion N = 5 Proteus mirabilis N = 1 Kein V.a. Infektion N = 5 Steril N = 7

72 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Kultur vom Biofilm 10 Patienten: Bakterielles Wachstum Insgesamt 46 Isolate Leifsonia N = 25 (54,3%) Staphylococcus N = 10 (21,7%) Proteus N = 4 (8,7%) Brevundimonas N = 3 (6,5%)

73 Universelle PCR Patienten: TEP Lockerung 5 : Infektion 5 : Keine Infektion Dempsey et al, Arthr Res Therap 2007, 9:R46 Eubakterielle PCR vom Biofilm 10 Patienten: Bakterieller Nachweis Insgesamt 512 Klone 118 sequenziert Lysobacter N = 52 (44,1%) γ Proteobacterium N = 8 (6,8%) Stenotrophomonas N = 9 (7,6%) Methylobacterium N = 3 (6,5%)

74 Universelle PCR 74 Riggio et al, EJCMID 2010, 29: Patienten. mrna cdna 16S rrna 234 Klone; Lysobacter häufigste Spezies (N = 74; 31,6%) Achermann et al, J Clin Microbiol 2010, 48: Bis 43 Tage nach Beginn Antibiose: PCR positiv Bjerkan et al, J Med Microbiol 2012, 61: Sensitivität: Kultur > PCR Esteban et al, Acta Orthopaedica 2012, 83: Infektionen: PCR erhöht Ausbeute um 10% - Nur PCR pos: Zurück haltende Interpretation

75 Zusammenfassung II 75 Direktmaterial besser als Abstrich - Sensitivität bei großer Probenmenge - Kann große Probenmenge im Labor aufgearbeitet werden? - Chirurg: Abfüllen Direktmaterial in Probenröhrchen MALDI-TOF MS: Beschleunigung / Erweiterung mikrobieller Diagnostik Stellenwert (universelle) PCR: Work in progress

76 Stefan Borgmann Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit