Athanasios Makristathis. Klinische Abteilung für Mikrobiologie Klinisches Institut für Labormedizin

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1 Molekulare H. pylori-diagnostik im Stuhl; Erfahrungen im pädiatrischen Bereich Athanasios Makristathis Klinische Abteilung für Mikrobiologie Klinisches Institut für Labormedizin 1

2 Molekulare Verfahren und Stuhl H. pylori wird mit dem Stuhl ausgeschieden Möglichkeit einer nicht-invasiven Diagnostik (Antigen, DNA) Erregernachweis Nachweis des Resistenzverhaltens gegenüber Antibiotika Nachweis von Virulenzfaktoren Epidemiologie (Übertragungsquellen, -wege)

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5 Real-time PCR FRET-Prinzip Hohe Sensitivität und Spezifität, letztere gegeben durch Primer + Sonde(n) Geringe Kontaminationsgefahr Rasches Ergebnis

6 biprobe real-time PCR mit anschließender Schmelzkurvenanalyse Spezifische fluoreszierende Hybridisierungs-Sonde + SYBR green I A. Real-time PCR Amplifikation der Zielsequenz auf der 23S rdna B. Schmelzkurvenanalyse Erhitzen auf 95 C - Denaturierung des PCR-Produktes Schnelles Kühlen auf 35 C - Sonde bindet an Zielsequenz und durch den Einbau von SYBR green I beginnt zu fluoreszieren Langsames Erhitzen Bei der Schmelztemperatur (Tm) dissoziiert die Sonde - Maximum an Fluoreszenzabfall 100%-ige Homologie Sonde schmilzt bei ihrer Tm! Keine 100%-ige Homologie Sonde schmilzt bei einer niedrigeren Tm! Mutation

7 Schmelzkurvenanalyse Interpretation des Ergebnisses 54 C; CLA-res. Genotyp (A2142G oder A2143G) Mischinfektion mit CLA-empf. und CLA-res. Genotypen 63 C; CLA-empf. Genotyp (Wildtyp) Interne Kontrolle H. pylori-negativer Stuhl

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9 Nachweis der H. pylori-infektion Biopsie Stuhl Sensitivität (%) Spezifität (%) PPV (%) NPV (%) Nachweis der Clarithromycinresistenz Biopsie Stuhl Sensitivität (%) Spezifität (%) PPV (%) NPV (%) 94 92

10 H. pylori ClariRes Assay vs. Amplified-IDEIA- HpStAR bei 108 Patienten Nachweis der H. pylori-infektion aus Stuhl H. pylori-pos.: 33 (30,5%) CLA-R: 19 (57,6%)/13 (68,4%) Amplified-IDEIA- HpStAR H. pylori ClariRes Assay Sensitivität (%) 93,9 97 Spezifität (%) 98,7 100 PPV (%) 96,9 100 NPV (%) 97,4 98,7 H. pylori ClariRes Assay: Nachweis der CLA-Resistenz Biopsie Stuhl Sensitivität (%) 94,7 94,7 Spezifität (%) PPV (%) NPV (%) 93,3 92,9

11 Vergleich H. pylori ClariRes Assay vs. Amplified- IDEIA-HpStAR bei 214 pädiatrischen Stühlen Test-Übereinstimmung: 95,8% Prävalenz: 16,8% Stuhlprobe Amplified-IDEIA- HpStAR H. pylori ClariRes Assay UBT/Serologie SA9(S)NT pos neg neg/- SA18(S) neg pos pos/pos SA20 pos neg neg/neg SA43(R)NT neg pos pos/- SA59(CAL03) pos neg neg/- SA79(S)NT pos neg neg/- SA98 pos neg pos/pos SA109(S)NT pos neg neg/- SA155 pos neg neg/neg Test Amplified-IDEIA- HpStAR H. pylori ClariRes Assay Sensitivität 94,4% 97,2% Spezifität 96,6% 100% PPV 85% 100% NPV 98,8% 99,4%

12 2006: Routineeinsatz der Stuhl-PCR bei Kindern Dyspeptische Kinder des St.Anna Kinderspitals Signifikant höhere Dyspepsierate bei H. pylori infizierten vs. nicht infizierten Kindern Untersuchung des Infektionsstatus; bei Warnsymptomen ÖGD Maßgeschneiderte H. pylori Trippeleradikationstherapie

13 2006: Routineeinsatz der Stuhl-PCR bei Kindern Dyspeptische Kinder des St.Anna Kinderspitals Signifikant höhere Dyspepsierate bei H. pylori infizierten vs. nicht infizierten Kindern Untersuchung des Infektionsstatus und der Resistenz gegenüber Crarithromycin; bei Warnsymptomen ÖGD Maßgeschneiderte H. pylori Tripeleradikationstherapie

14 2009: Vergleich Stuhl-PCR vs. gold standard" Retrospektive Analyse bei 143 Patienten Infektionsrate: 55,9%; hoher Patientenanteil mit Migrationshintergrund (72,7%), Selektions-Bias! Primäre CLA-Resistenzrate: 45,1%; Selektions-Bias!

15 Patienten mit Dyspepsie Untersuchungsschema am St.Anna Kinderspital maßgeschneiderte H. pylori Tripeltherapie

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17 Andere Studien 100 pädiatrische Patienten H. pylori-infiziert: 46 Sensitivität H. pylori-nachweis: 63% CLA-Resistenznachweis: 100% Spezifität: 100% 217 pädiatrische Patienten H. pylori-infiziert: 45 (20,7%) Sensitivität H. pylori-nachweis: 69% CLA-Resistenznachweis: 83,3% Spezifität: 100%

18 Prä-Analytik und Laborpraxis Material möglichst frisch, Lagerung bei 4 C, schneller Transport Stuhlprobe einfrieren (-20 C) falls Analyse nicht innerhalb von 24 h möglich (Lagerung bei 4 C) Einmalig auftauen DNA-Extrakt bei 4 C lagern Doppelansatz in der PCR (WICHTIG)

19 Preisvergleich in Real-time PCR (H. pylori ClariRes Assay): 130 Stuhlantigentest (Amplified-IDEIA-HpStAR): C-Atemtest: 62 Gastroskopie + Kultur: 290 Gastroskopie + Kultur + Antibiogramm: 350

20 Schlussfolgerungen Gute diagnostische Genauigkeit der real-time Stuhl- PCR auch bei Kindern Einzige nicht-invasive Methode der Clarithromycin- Resistenzbestimmung Im Vergleich zur invasiven Diagnostik wesentlich billiger; kein Nachteil für den Behandlungserfolg bei Kindern im Rahmen der test and treat Strategie

21 Vielen Dank