Testmethoden der Molekularpathologie. im Vergleich

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1 Testmethoden der Molekularpathologie im Vergleich Andreas Bösl (Feldkirch) Gerlinde Winter (Graz) Testmethoden der Molekularpathologie PCR Fragmentanalyse Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese Sequenzierung Didesoxysequenzierung nach Sanger Pyrosequenzieren Next Generation Sequencing Mutationsanalytik Restriktionsenzyme, HRM, ARMS-PCR Frühjahrstagung der ÖGP

2 PCR Polymerase Chain Reaction Denaturierung Annealing Elongation Wahl der Testmethode: Verteilung der relevanten Mutationen Hotspot-Mutation (BRAF) größere Zahl von Mutationen (KIT) Ausgangsmaterial: Operationspräparate, Biopsien Ausbeute an DNA bei der Extraktion Anteil an Tumorzellen im Gewebe Vorsicht bei weniger als 10% Tumorzellen! Möglichkeit der Tumorzellanreicherung Manuelle Makrodissektion, Laser Mikrodissektion Abdeckung des Testbereichs und Sensitivität des Tests Frühjahrstagung der ÖGP

3 Verteilung der relevanten Mutationen Frühjahrstagung der ÖGP Verteilung der relevanten Mutationen Frühjahrstagung der ÖGP

4 Verteilung der relevanten Mutationen Hotspot Mutationen BRAF Codon 600 NRAS Codons 12/13, 61 Frühjahrstagung der ÖGP Verteilung der relevanten Mutationen Große Zahl an Mutationen: Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Komplexe Mutationen 4

5 Analyse von Mutationen - Didesoxysequenzieren Punktmutationen: GTT>GAT c T>A p. V559D missense mutation Deletionen: c. 1669_1674del6 p. W557_K558del inframe deletion 5

6 Analyse von Mutationen - Didesoxysequenzieren Pyrosequenzieren 6

7 Pyrosequenzieren Eines der 4 Desoxyribonucleotidtriphosphate (dntp) wird zugegeben Die DNA Polymerase baut dieses Nukleotid im Anschluss an den Sequenzierprimer in den Strang ein, wenn das Nukleotid passt, d.h. komplementär zum Gegenstrang ist. T T T T T T T T T T T T T T Beim Einbau eines Nukleotids wird Pyrophosphat freigesetzt, das löst eine Kaskade enzymatischer Reaktionen aus. Am Ende der Kaskade wird Luciferin in Oxyluciferin umgewandelt, das als Lichtblitz detektiert wird. Analyse von Mutationen - Pyrosequenzieren 7

8 Didesoxysequenzieren - Pyrosequenzieren Methode Reichweite Sensitivität Limitierungen Wichtig! Didesoxy - sequenzieren Pyro - sequenzieren in FFPE bis ~ 600nt ideal 30nt max. 100nt ca. 20% Tuz. ca. 5% Tuz. Qualität der DNA (Fixierung) und inhibierende Substanzen (Melanin) Durch Enzym und Substrate und auch durch Abbauprodukte der Reaktion Doppelansätze Doppelansätze Real-Time basierte Testsysteme verschiedene kommerzielle Systeme verschiedene Testanbieter unterschiedliche Detektionsverfahren Scorpion-ARMS-Primer Taq-Man-Sonden, etc.) 8

9 Real-Time basierte Testsysteme Signifikanter Anstieg der Fluoreszenz (oberhalb der Grundfluoreszenz) Quantification cycle (Cq) Crossing point (Cp) Threshold cycle (Ct) Hohe Target-Konzentration Frühe Fluoreszenzzunahme niedriger Ct Real-Time basierte Testsysteme Verschiedene Sonden- und Detektionsformate Sequence-independent formats like SYBR Green I Sequence specific detection formats Hydrolysis Probes like Universal ProbeLibrary Probes 9

10 Real-Time basierte Testsysteme Sequence Independent Assay Format SYBR Green I Hydrolysis Probe Format Fluorescence is quenched Fluorescence is not quenched High Resolution Melting Wasserstoffbrückenbindungen 10

11 High Resolution Melting Änderung des Schmelzverhaltens Single Nucleotide Polymorphism (SNP s) detektierbar Abweichung 0,04 C (Software-gestützte Auswertung) High Resolution Melting 11

12 High Resolution Melting wildtype Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes High Resolution Melting 42bp-Duplikation Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes 12

13 High Resolution Melting wildtype 42bp-Duplikation Software-basierte Darstellung des spezifischen Schmelzpunktes 13

14 frühe Detektion von Tumoren in der Medizin wenig Tumorgewebe weitere Aufschlüsselung der Signalwege mehr zu bestimmende Gene/ Tumor hohe Anforderung an Personal und Detektionssysteme Ersten Sequenzierungen in den 1970er (Belgien, Ghent) Frederick Sanger (UK, Cambridge) entwickelte 1975 die Kettenabbruch-Methode (Sanger Methode) Seit 2005 gibt es die nächste Generation der Sequenzierung (Roche/454 Pyrosequenzierung, Illumina/Solexa & Applied Biosystems/SOLiD) 14

15 Sequencing by synthesis: Einzelsträngiges DNA Molekül ATP, TTP, CTP, GTP Polymerase: synthetisiert den Doppelstrang DNA Vorbereitung Shotgun oder Amplikon Emulsions-PCR Klonale Amplifikation Vorbereitung Sequenzierung Laden der Picotiter Platte Tag 1 Tag 1 & ü.n. Tag 2 Pyrosequenzierung 1 DNA Fragment = 1 Bead = 1 Read Datenausprozessierung und Analyse Ergebnisse als Flowgram 15

16 Sequenzielles Fluten der Picotiter Platte mit Basen (TACG); 200x Komplementäre Nukleotide generieren beim Einbau ein Lichtsignal CCD Kamera erkennt Lichtsignal Signalstärke ist proportional zur Anzahl eingebauter Nukleotide 16

17 Etablierte 454 Technologie: Pyrosequenzierung > gelesene DNA- Stücke/Lauf Lange Leseweiten: bp (in Entwicklung: 1000 bp) Durchsatz: ~ 35 Mio. bp Genauigkeit: 99,99% Bioinformatische Tools Vorteile: viele Gene können simultan analysiert werden geringer Verbrauch an Nukleinsäuren hohe Sensitivität und Spezifität breites Einsatzsmöglichkeit Feststellung von Genmutationen Analyse des Transkriptoms (RNA Sequenzierung), um Genexpression zu bestimmen Crime Scene Investigation virale/bakterielle Diagnostik Frühjahrstagung der ÖGP

18 Vorteile: Geringere Kosten durch den höheren Durchsatz Zeitersparnis Hohe Genauigkeit/Auflösung (klonale Amplifikation durch hohe Coverage) Nachteile: Fehlende Automatisation verschiedener Arbeitschritte Personalbindung Anschaffungskosten Bioinformatik (zentrale Bedeutung) viele Informationen ohne momentane klinische Relevanz ( Panelentwicklung notwendig) Frühjahrstagung der ÖGP

19 Vielen Dank 19