Molekulare Diagnostik Hans Nitschko
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- Brit Brauer
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Transkript
1 Molekulare Diagnostik Hans Nitschko
2 Nachweis viraler Erreger durch molekularbiologische Methoden Antikörpernachweise Nachweis antigenspezifischer T-Zellen Neutralisationsteste Nachweis Therapie-resistenter Viruspopulationen Infektionsketten
3 Nachweismethoden Indirekte (Serologische) Nachweismethoden ELISA µ-capture ELISA Immunfluoreszenztest (IFT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Western Blot (WB) Neutralisationstest (NT)) Direkte Nachweismethoden Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Quantitative PCR Antigennachweis (ELISA) Antigennachweis (Schnelltest) Virusisolierung Antigennachweis nach Virusinfektion in der Zellkultur Sequenzierung Elektronenmikroskopie
4 ELISA
5 ELISA Testprinzip 1. Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte ELISA1
6 ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation ELISA2
7 ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper ELISA3
8 ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation ELISA4
9 AntigenNachweis Antigen Nachweis
10 Antigen-Schnelltest Testprinzip 1. Mit Antikörper beschichtetes Röhrchen Antigen-ELISA1
11 Antigen-Schnelltest Testprinzip 2. Inkubation mit Patientenmaterial Antigen-ELISA2
12 Antigen-Schnelltest Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper Antigen-ELISA3
13 Antigen-Schnelltest Testprinzip 4. Substratinkubation Antigen-ELISA4
14 ELISA Mikrotiterplatte
15 µ-capture ELISA Testprinzip 1. Anti-IgM beschichtete Mikrotiterplatte µ Capture1
16 µ-capture ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation µ Capture2
17 µ-capture ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antigen µ Capture3
18 µ-capture ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation µ Capture4
19 PCR, RT- PCR, q-pcr
20 TaqMan 5 -nuclease assay -principle Pol R Q Pol R Q Amplification R R Pol Q Pol Q HBV-polymerase gene human DNA, different targets
21 HN April 2001 Sensitivity of HBV-TaqMan
22 Precision of assay 4000, 2000, 1000, 500 Geq. / ml 2-fold replicat es HN April 2001
23 HN April 2001 Linearity of HBV-TaqMan
24 Sequenzierung
25 Sequenzierung LMU Bestimmung der Basenabfolge in einer Nukleinsäure = GOLDSTANDARD Einsatzfelder: Genotypisierung Resistenzbestimmung Infektionsketten Verifizierung von PCR-Produkten Detektion von Mutanten SNP (single nucleotide polymorphism)...
26 Sequenzierung Ablauf Seq.Ablauf PCR Sequenzierreaktion Elektrophorese Auswertung
27 Sequenzierung Testprinzip ds DNA 5 GCATATGTCAGTCCAG 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 Sequ. Testprinzip primer annealing 5 GCAT 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 excess datp, dttp, dctp, dgtp ddatp Taq ddttp Taq ddctp Taq ddgtp Taq 5 GCATA 5 GCATAT 5 GCATATGTC 5 GCATATG 5 GCATATGTCA 5 GCATATGT 5 GCATATGTCAGTC 5 GCATATGTCAG 5 GCATATGTCAGTCCA 5 GCATATGTCAGT 5 GCATATGTCAGTCC 5 GCATATGTCAGTCCAG electrophoresis
28 Sequenzierung LMU Halbe PCR 30-fache Amplifikation DNA Puffer cycle sequencing HN Feb 2004
29 Sequenzierung LMU Methodik Auftrennung der Extensionsprodukte nach Länge Primer (Probleme: 70% DNA, 10% Inhib., 10% Primer, 10% Cycling u.a.)
30 Sequenzierung LMU Plattenformat (line tracking) HN Feb 2004
31 Sequenzierung LMU Elektropherogramm HN Feb 2004
32 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät Laserebene HN Feb 2004
33 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät HN Feb 2004
34 Beckman Coulter LMU CEQ Kapillaren, 100 Basen/10 min Erste Peaks nach 20 min HN Feb Mikrotiterplatten
35 Kapillar- Sequenzierung Gele gießen entfällt Kein manueller Probenauftrag Kein line tracking Kein cross talk Keine Platten- Reinigung Variabler Volumeneinsatz während des Laufs Hoher Durchsatz LMU
36 Kapillar- Sequenzierung II LMU HN Feb 2004
37 Sequenzierung LMU Proben- Einzug (im nl- Maßstab) durch Anlegen von Spannug HN Feb 2004
38 HBV-Genom LMU Zirkuläre DNA 4 Gene: S surface P polymerase C core X x-gen HN Feb 2004
39 Lamivudine Therapie 1. HBV Sequenz HBV Sequenz
40 HBV Sequenz ierung HBV Sequenzen eines Patienten unter LamivudinTherapie
41 Sequenzierung Polymorphismus an Position 552 der HBV-Polymerase Übergang von Wildtyp M zu resistenter Mutante I sense antisense ATG = Met (M), ATT = Ile (I) HN April 2001
42 Sequenzierung Auswertung HBV Auswertung Blutentnahme (vor Lamivudin) (unter Lamivudin) Aminosäure (Position 552) Nukleinsäure-Triplet Resistenzmutation (ja/nein)? M ATG nein I ATT ja; 400-fach
43 Sequenzierung LMU HN Feb 2004
44 Sequenz: HBsAG-conformation HBs3 HBs HBs1 C 110 C 124 C C C HBs2 C 139 C C N G 145 G>R (vaccine escape) HBs HN April
45 Sequenz: HBsAG-vaccine escape 130 C 124 C C C 139 C N G HN April mutations associated with vaccine failure
46 Sequenz: HBsAG-diagnostic failure mutations Diagnostic failures 130 C C 124 C C 139 C N G 145 C HN April of 5: no obvious aa changes
47 Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010
48 Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010
49 Sequenzierung HIV LMU PR RT HN Feb 2004
50 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
51 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
52 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
53 Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
54 Immunfluoreszenz Test Immunfluoreszenz Test
55 RFLP Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
56 RFLP Analyse
57 HCV-RFLP DrdI BsmaI BsrI Sau3A HinfI Schnell & billig Ø Ø Ø Ø Ø?
58 Western Blot Analyse
59 FACS Analyse Fluorescence activated cell sorting
60 Renal transplant recipients II LMU Clinically asymptomatic: O Mononucleosis like symptoms:
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