Molekulare Diagnostik Hans Nitschko

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1 Molekulare Diagnostik Hans Nitschko

2 Nachweis viraler Erreger durch molekularbiologische Methoden Antikörpernachweise Nachweis antigenspezifischer T-Zellen Neutralisationsteste Nachweis Therapie-resistenter Viruspopulationen Infektionsketten

3 Nachweismethoden Indirekte (Serologische) Nachweismethoden ELISA μ-capture ELISA Immunfluoreszenztest (IFT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Western Blot (WB) Neutralisationstest (NT)) Direkte Nachweismethoden Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Quantitative PCR Antigennachweis (ELISA) Antigennachweis (Schnelltest) Virusisolierung Antigennachweis nach Virusinfektion in der Zellkultur Sequenzierung Elektronenmikroskopie

4 ELISA

5 ELISA Testprinzip 1. Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte ELISA1

6 ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation ELISA2

7 ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper ELISA3

8 ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation ELISA4

9 AntigenNachweis

10 Antigen-Schnelltest Testprinzip 1. Mit Antikörper beschichtetes Röhrchen Antigen-ELISA1

11 Antigen-Schnelltest Testprinzip 2. Inkubation mit Patientenmaterial Antigen-ELISA2

12 Antigen-Schnelltest Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper Antigen-ELISA3

13 Antigen-Schnelltest Testprinzip 4. Substratinkubation Antigen-ELISA4

14 ELISA Mikrotiterpl ELISA Mikrotiterplatte

15 υ-capture ELISA Testprinzip 1. Anti-IgM beschichtete Mikrotiterplatte µcapture1

16 υ-capture ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation µcapture2

17 υ-capture ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antigen µcapture3

18 υ-capture ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation µcapture4

19 PCR, RT- PCR, q-pcr

20 TaqMan 5 -nuclease assay -principle Pol R Q Pol R Q Amplification R R Pol Q Pol Q HBV-polymerase gene human DNA, different targets

21 HN April 2001 Sensitivity of HBV-TaqMan

22 Precision of assay 4000, 2000, 1000, 500 Geq. / ml 2-fold replicates HN April 2001

23 HN April 2001 Linearity of HBV-TaqMan

24 Sequenzierung

25 Sequenzierung LMU Bestimmung der Basenabfolge in einer Nukleinsäure GOLDSTANDARD Einsatzfelder: Genotypisierung Resistenzbestimmung Infektionsketten Verifizierung von PCR-Produkten Detektion von Mutanten SNP (single nucleotide polymorphism)...

26 Sequenzierung Ablauf Seq.Ablauf PCR Sequenzierreaktion Elektrophorese Auswertung

27 Sequenzierung Testprinzip ds DNA 5 GCATATGTCAGTCCAG 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 Sequ. Testprinzip primer annealing 5 GCAT 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 excess datp, dttp, dctp, dgtp ddatp Taq ddttp Taq ddctp Taq ddgtp Taq 5 GCATA 5 GCATAT 5 GCATATGTC 5 GCATATG 5 GCATATGTCA 5 GCATATGT 5 GCATATGTCAGTC 5 GCATATGTCAG 5 GCATATGTCAGTCCA 5 GCATATGTCAGT 5 GCATATGTCAGTCC 5 GCATATGTCAGTCCAG electrophoresis

28 Sequenzierung LMU Halbe PCR DNA Puffer 30-fache Amplifikation cycle sequencing HN Feb 2004

29 Sequenzierung LMU Methodik Auftrennung der Extensionsprodukte nach Länge Primer (Probleme: 70% DNA, 10% Inhib., 10% Primer, 10% Cycling u.a.)

30 Sequenzierung LMU Plattenformat (line tracking) HN Feb 2004

31 Sequenzierung LMU Elektropherogramm HN Feb 2004

32 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät Laserebene HN Feb 2004

33 ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät HN Feb 2004

34 Beckman Coulter LMU CEQ Kapillaren, 100 Basen/10 min Erste Peaks nach 20 min HN Feb Mikrotiterplatten

35 Kapillar- LMU Sequenzierung Gele gießen entfällt Kein manueller Probenauftrag Kein line tracking Kein cross talk Keine Platten- Reinigung Variabler Volumeneinsatz während des Laufs Hoher Durchsatz

36 Kapillar- Sequenzierung II LMU HN Feb 2004

37 Sequenzierung LMU Proben- Einzug (im nl- Maßstab) durch Anlegen von Spannug HN Feb 2004

38 Clincical course of HBV infection Acute Hepatitis B 90% 10% Recovery Chronic Hepatitis B Liver Cirrhosis Liver Carcinoma

39 HBV-Genom LMU Zirkuläre DNA 4 Gene: S surface P polymerase C core X x-gen HN Feb 2004

40 Lamivudine Therapie 1. HBV Sequenz HBV Sequenz

41 HBV Sequenz ierung HBV Sequenzen eines Patienten unter LamivudinTherapie

42 Sequenzierung Polymorphismus an Position 552 der HBV-Polymerase Übergang von Wildtyp M zu resistenter Mutante I sense antisense HN April 2001 ATG = Met (M), ATT = Ile (I)

43 Sequenzierung Auswertung HBV Auswertung Blutentnahme (vor Lamivudin) (unter Lamivudin) Aminosäure (Position 552) Nukleinsäure-Triplet Resistenzmutation (ja/nein)? M ATG nein I ATT ja; 400-fach

44 Sequenzierung LMU HN Feb 2004

45 Sequenz: HBsAG-conformation HBs3 HBs HBs1 C 110 C C C 139 C 124 C HBs2 C C N G 145 G>R (vaccine escape) HBs HN April

46 Sequenz: HBsAG-vaccine escape 130 C 124 C C C 139 C N G HN April mutations associated with vaccine failure

47 Sequenz: HBsAG-diagnostic failure mutations Diagnostic failures 130 C C 124 C C 139 C N G 145 C HN April of 5: no obvious aa changes

48 Sequenzierung HIV LMU PR RT HN Feb 2004

49 RFLP Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus

50 RFLP Analyse

51 HCV-Clinical features worldwide ~ 170 million infected people incubation 6 12 weeks (2-26 weeks) fulminant hepatitis extremely rare 15%: spontaneous virus elimination 25%: chronic, asymptomatic carrier 60%: chronic hepatitis (transaminases ) ~ 30% of chronic hepatitis patients develop liver cirrhosis within years; hep.cell. carcinoma: unclear correlation therapy: Interferon-α / Ribavirin / success is genotype dependant: Type 1 + 4:, type 2 + 3: HN July 2002

52 Schnell & billig HCV-RFLP ØØ Ø Ø Ø? DrdI BsmaI BsrI Sau3A HinfI

53 Immunfluoreszenz Test

54 FACS Analyse Fluorescence activated cell sorting

55 Renal transplant recipients II LMU Clinically asymptomatic: O Mononucleosis like symptoms:

56 EBV viral load in PBMC and Plasma LMU EBV genomes/ug PBMC DNA EBV genomes/100 ul plasma HN Jan 2004

57 Western Blot Analyse

58 LMU CMV Hohe Viruslast M460I Störung Der Ganciclovir Monophosphorylierung Therapie- Resistenz? UL97 Phosphotransferase HN Feb 2004