Disclosure. Helmut H. Popper acts as a consultant at the advisary boards of. Helmut H. Popper has got unrestricted research grants from

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2 Disclosure Helmut H. Popper acts as a consultant at the advisary boards of Astra Zeneca Eli Lilly Hofmann La Roche Boehringer Ingelheim Helmut H. Popper has got unrestricted research grants from Eli Lilly Astra Zeneca The data presented here are in no connection with any grants or benefits from these companies and there are no conflicts of interests to be declared 2

3 Bekannte / unbekannte genomische Veränderungen des NSCLC

4 Warum EGFR?

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6 Welche Methoden können wir anwenden Bestimmung EGFR Status 1) Immunhistochemie: Proteinexpression 2) Hybridisierung: Gen Amplifikation/Polysomie FISH / CISH 3) Mutationsanalysen Punktmutationen (aktivierend Exons 18 21) Deletionen (in Exon 19) Methoden: PCR und Sequenzierung Real Time Assays

7 EGFR: Immunhistochemie Vorteil Einfach Schnell durchführbar Rasche Auswertung Korrelation mit der Morphologie Nachteil Präanalytische Faktoren (Fixation / Fixationszeit) Sensitivität unterschiedlicher Antikörper/Kits heterogene EGFR Expression Subjektive Auswertung fehlende Standards Wird ein Revival erleben für die Therapie mit Cetuximab! Entscheidend ist ein score von > 200

8 EGFR Expression kein prädiktiver Marker beim NSCLC (für EGFR Inhibitortherapie) Keine Korrelation zwischen Immunhistochemie und dem Therapieansprechen! Hirsch FR et al., J Clin Oncol 21: ,2003, Capuzzo F et al., J Natl Cancer Inst 97: , 2005, Parra HS et al., British Journal of Cancer (2004) 91, , Gupta R et al., Modern Pathology 22: , 2009 EGFR Dako pharmdx (FDA approved)

9 EGFR Mutationsanalyse heute IHC mit mutationsspezifischen Antikörpern für del Exon19 und Punktmutation L858R Die Deletion ist sehr spezifisch für del15

10 EGFR: FISH Vorteil Farbintensität easy read out Rasche Auswertung Nachteil Fluoreszenmikroskop Ausbleichen des Signals Keine Morphologie Kosten, wegen der beschränkten Haltbarkeit der Reagenzien Alternative: CISH

11 EGFR CISH Chromogenic in situ Hybridisierung Nachweis von Gen Kopienzahl FFPE Gewebeschnitte Kit / homemade ; Bsp. Kit. Spot Light EGFR Probe, Zymed Invitrogen; ZytoDot Spec EGFR Probe Kit, Zytovision Könnte im Kontext mit EGFR IHC für Cetuximab Bedeutung bekommen

12 EGFR Polysomie CISH FISH

13 EGFR Amplifikation CISH FISH

14 Methoden für die Detektion von EGFR Mutationen in Lugenkarzinomen Technique Sensitivity (% mutant DNA) Mutations identified Direct sequencing 25 Known and new PCR-SSCP 10 Known and new TaqMan PCR 10 Known only Loop-hybrid mobility 7,5 Known only shift assay Cycleave PCR 5 Known only PCR-RFLP and length 5 Known only analysis MALDI-TOF MS based 5 Known only genotyping PNA-LNA PCR clamp 1 Known only Scorpions ARMS 1 Known only dhplc 1 Known and new Single-molecule 0.2 Known and new sequencing Mutant-enriched PCR 0.2 Known only SMAP 0.1 Known only Pao W. and Ladanyi M, Clinical Cancer Research 13, 4954, September 1, 2007

15 Bekannte EGFR Mutationen

16 Wie häufig sind diese Mutationen? Shighematsu et al. J Natl Cancer Inst. 97:339 46, lung cancer patients. Frequency of exon 19 deletions + mutations at codon 858: 85% Marchetti et al. J Clin Oncol. 23:857 65, lung cancer patients. Frequency of exon 19 deletions + mutations at codon 858: 92% Shighematsu and Gazdar, Int. J. Cancer. 118: , 2006 (Review). More than 2000 lung cancer patients. Frequency of exon 19 deletions +mutations at codon 858: 85% Yamamoto, et al. Lung Cancer. 63:315 21, 2009 (Review) lung cancer patients. Frequency of exon 19 deletions + mutations at codon 858: 91% Sharma SV, et al. Nat Rev Cancer. 7:169 81, 2007 (Review). Frequency of exon 19 deletions + mutations at codon 858: 85 90% Tanaka et al. Int J Cancer. 126:651 5, lung cancer patients. Frequency of exon 19 deletions + mutations at codon 858: 95%

17 Wie sollten die Mutationen an die Klinik berichtet werden? Aus dem Adenokarzinom wurde ein Areal mit 50% Tumoranteil makrodisseziert. Es konnten 120 ng DNA extrahiert werden; Eine Mutationsanalyse wurde durchgeführt (Methode: DXS kit/sanger Sequenzierung/Pyrosequenzierung). Welche Mutationen können mit der Methode erkannt werden. Eine Mutation wurde im Exon19 gefunden: deletion (E746 A750). Diagnose: Mittelgradiges papilläres Adenokarzinom mit einer aktivierenden Mutation im Exon 19 (E746 A750). Diese EGFR Mutation spricht sehr gut auf EGFR Inhibitortherapie an (TKI)

18 Gibt es Resistenzen? Es gibt zwei wichtige hauptsächlich vorkommende resistenzmutationen und eine weitere umstrittene: T790M und G796A; S768I Sind assoziiert mit Gefitinib/Erlotinib Resistenz Sequist et al, JCO 26, 2442, 2008 Uramoto et al, AnticancerRes 27, 2297, 2007

19 Workflow: EGFR Sequencing NSCLC patient tissue ~10 consecutive sections 4 5 µm on slides Pathologist marks the tumor area on the H&E stained slide, tumor content ~60% DNA Extraction PCR home made Protocol, Kit (Qiagen, Ambion) PCR (Forward und Reverse Primers) Exon 18, Exon 19, Exon 20, Exon 21 Sequencing of PCR Products Comparison with wt Sequence

20 Time line for mutation tests

21 EGFR Mutationsanalyse heute SCORPIONS ARMS (DxS kit)

22 EGFR Mutationsanalyse heute SCORPIONS ARMS (DxS kit) LightCycler Assay

23 EGFR Mutationsanalyse heute SCORPIONS ARMS (DxS kit) LightCycler Assay Microarray

24 EGFR Mutationsanalyse heute SCORPIONS ARMS (DxS kit) LightCycler Assay Microarray Direct Sequencing

25 EGFR Mutationsanalyse heute SCORPIONS ARMS (DxS kit) LightCycler Assay Microarray Direct Sequencing Pyrosequencing

26 Methods of mutation analysis Pyrosequencing: 1. Extract DNA 2. Amplification and isolation of single stranded PCR amplicons on Streptavidin Sepharose 3. Injection of enzymes: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase and Apyrase and substrates: Adenosine 5 phospho sulfate (APS), Luciferin 4. Pyrosequencing: The first (dntp) deoxyribonucleotide triphosphate is added 5. DNA polymerase catalyzes addition of the dntp to the Sequencing Primer, if it is complementary to the base. 6. Each incorporation releases Pyrophosphate (Ppi) equimolar to the amount of incorporated nucleotide.

27 Methods of mutation analysis Pyrosequencing ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of APS. ATP drives the luciferase mediated conversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional to the amount of ATP. The light is detected by CCD sensors and seen as a peak (light signal) in the Pyrogram. The height of the peak is proportional to the number of nucleotides incorporated Apyrase continuously degrades unincorporated nucleotides and ATP.

28 Beispiel einer L858R Punktmutation aus cytologischem Material (Ausstriche)

29 454 Sequencing System

30 454 Sequencing System

31 454 Sequencing System

32 454 Sequencing System

33 Pyrosequencing Sulfurylase Luciferase

34 Ergebnisse 487 Mutationen in 79 Patienten

35 Ergebnisse

36 Publizierte vs. neue Mutationen

37 Fallbeispiele

38 Methodenvergleich

39 Grenzen des Deep-Sequencings Cut off Bestimmung Wo liegen die Grenzen der Detektierbarkeit? 2 positive Reads ausreichend! 5 positive Reads ausreichend! Wang et al., Genome Res. 2007

40 Grenzen des Deep-Sequencings Thomas et al., Nature Medicine 2006

41 Klinische Relevanz Cut off Bestimmung bei Aktivierenden Mutationen Sensitivität der bisherigen Methoden ausreichend? Cut off Bestimmung bei Resistenzmutationen Sensitivere Methoden erforderlich!

42 Evergreens M825I/ R832H Mit aktivierende Mutation assoziiert? Intensivierung der Aktivierung? H773P, H773N und Q787Q: Ethnologische Variation (mitteleuropäisch)? Phänotypische Variation? Fehler im Genomprojekt?

43 Methoden am Limit? Alle konventionellen Methoden mit zu geringer Sensitivität Sanger zeigt hohe Variabilität in unterschiedlichen Instituten Diskrepanz erschwert direkten Vergleich Troubleshooting bei IHC dringend notwendig!

44 Resistenzmutationen T790M & S768I vor TKI Behandlung Hypothese bestätigt Sensitive Methode für Routine nötig! Individualisierung der Therapie nötig!

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