Tätersuche durch Molekularbiologie

Transkript

1 Klinische Mikrobiologie Hygiene im Operationssaal 7. März 2016 Tätersuche durch Molekularbiologie PD Dr. med. Dr. phil. Adrian Egli Leiter Abteilung Klinische Mikrobiologie & Applied Microbiology Research

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3 Agenda Wie identifizieren wir Keime im Labor? Welche Resistenzmechanismen sind wichtig? Was gibt es für diagnostische Möglichkeiten? Zusammenfassung 3

4 Fallbeispiel: Polytrauma im Ausland Männlicher Patient mit Motorradsturz im Mai 2015 in Serbien Schweres Polytrauma: Tibiaschaftfraktur links HWK7 und BWK12 Fraktur Rippenserienfraktur mit respiratorischer Insuffizienz Scapulafraktur rechts Radiusfraktur links Leberriss Erstversorgung in Belgrad Spondylodese und Plattenosteosynthesen an mehreren Frakturstellen Verlegung an das Universitätsspital Basel für die weitere Versorgung 4

5 Fallbeispiel: multiple Frakturen 5

6 Fallbeispiel: polymikrobieller Infekt Wundinfekt an mehreren Lokalisationen mit Fremdmaterial/ Implantaten Proteus mirabilis Acinetobacter baumanii Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Escherichia coli Enterobacter cloacae 6

7 Fallbeispiel: Resistenzen 7

8 Vorlesung Normalflora; Adrian Egli

9 Fallbeispiel: Sammelsurium an Resistenzen Wundinfekt an mehreren Lokalisationen Proteus mirabilis: NDM (Mo1), OXA-48 (Mo2) Acinetobacter baumanii: OXA-23 (Mo1), OXA-24 (Mo2) Klebsiella pneumoniae: NDM (Mo1), OXA-48 & CTXM-1 (Mo2) Pseudomonas aeruginosa: Porinverlust Staphylococcus aureus: MRSA Escherichia coli: plasmidische AmpC (Mo1), NDM (Mo2) Enterobacter cloacae: AmpC + Porinverlust (Mo1), NDM (Mo2) Gefundene Resistenzmechanismen: AmpC CTXM-1 MRSA NDM und OXA-23, -24, -48 Porinverlust 9

10 IDENTIFIKATION VON BAKTERIEN Hygiene im Opera4onssaal; Adrian Egli 10

11 Moderne Keimidentifikation im Labor Bisher: Kultur -> Gram Färbung & biochemische Identifikation (bunte Reihe) Vorteil: Goldstandard Nachteil: Zeit, Kosten Heute: Massenspektrometrie (MALDI-TOF) VITEK 2 Identifikation 11

12 MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionziation - Time Of Flight Die Flugzeit von Protein der Bakterien korreliert mit dem Gewicht. Die Gewichtsanalyse (Massenspektrum) gibt ein charakteristisches Muster. Dierig, Frei, et Egli, J Ped Inf Dis

13 Kolonie auswählen und aufnehmen 13

14 Auf Metallplatte auftragen 14

15 Matrixsubstanz dazugeben 15

16 Laden 16

17 MALDI-TOF Proteinprofil mit Datenbank abgleichen Insgesamt mehr als 3500 bakterielle und fungale Spektren gespeichert. Identifikation der Spezies innert Sekunden 17

18 Neue Möglichkeiten der Massenspektrometrie Direkt von Patientenmaterial: Urin z.b. Inigo et al. J Clin Microbiology 2016 Positive Blutkulturen z.b. Egli et al. Transpl Infect Dis 2015 Gelenkspunktate z.b. Peel et al Diagn Microbiol Infect Dis 2015 Bestimmung der Antibiotikaresistenz z.b. Jung et al Eur J Clin Microbio Infect Dis 2014 Typisierung (Ähnlichkeitsanalyse von Bakterien) ESBL E. coli z.b. Egli et al. Plos one 2014 MRSA clonal complex z.b. Ostergaard et al. Int J Med Microbiol

19 RESISTENZMECHANISMEN Hygiene im Opera4onssaal; Adrian Egli 19

20 Multidrug-resistant Pathogens: ESKAPE Erreger Resistenz E Enterococcus faecium VRE S Staphylococcus aureus MRSA K Klebsiella pneumoniae ESBL, KPC, A Acinetobacter baumannii Carbapenem resistent P Pseudomonas aeruginosa MDR E Enterobacter Species AmpC, ESBL, MDR Boucher et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! Clin Infect Dis 2009, 48(1):

21 Welche Resistenzmechanismen gibt es? Peleg AY et Hooper DC, N Engl J Med

22 Welche Resistenzmechanismen gibt es? Peleg AY et Hooper DC, N Engl J Med

23 Resistenzentwicklung in der Schweiz BAG Bulletin 39, September 2015; anresis.ch 23

24 Resistenzentwicklung in der Schweiz BAG Bulletin 39, September 2015; anresis.ch 24

25 Resistenzentwicklung am Universitätsspital Basel Schweiz USB BAG Bulletin 39, September 2015; anresis.ch; Egli et al. unpublished data Steigung E. coli: ± Erwartung: 20% Resistenz im Jahre

26 Aktuelle Resistenz Trends: Stürmische Zeiten erwarten uns! Good News: MRSA und VRE Wolken ziehen davon Bad News: Zunehmender Regen: ESBL Der nahende Hurrikan: Carbapenemasen 26

27 Diagnostische Möglichkeiten Phänotypisch Wachstum von Bakterien Genotypisch Nachweis der DNA Brilliance ESBL Eazyplex SuperBug 27

28 ESBL und Carbapenemasen: Genotypisch Isothermale Amplifikation: DNA Polymerase bei 66 C -> dadurch keine Zyklen -> viel schneller! Eazyplex SuperBug SuperBug CRE SuperBug Complete A KPC x x x NDM x x x OXA-23 x x OXA-40 x x OXA-48 x x x OXA-58 OXA-181 x x VIM x x x CTX-M-1 CTX-M-9 x x x SuperBug Complete B 28

29 ESBL direkt aus dem Urin: isothermal Amplifikation mit SuperBug CRE Table. Spiked specimen Hinic V et al. J Micro Methods 2015, in press Klinische Proben 29

30 Intrinsische Carbapenemasen Stenotrophomonas maltophilia Elizabethkingia meningoseptica Chryseobacterium indologenes Burkholderia cepacia Empedobacter brevis Aeromonas hydrophila Diese Spezies müssen nicht Carbapenemasen untersucht werden 30

31 Die vielen Gesichter von OXA-48: Ein Problem bei phänotypischen Tests Drei Klebsiella pneumoniae alle mit OXA-48 -> sehr unterschiedliche Phenotypen Poirel, Potron, et Nordmann, JAC

32 Carbapenemasen Genotypisch Eazyplex SuperBug B KPC + + NDM + + VIM + + OXA IMP-1 + OXA OXA-23 + OXA-40 + Xpert Carba-R Xpert Carba-R eazyplex 32

33 Validierungsstudie eazyplex SuperBug complete B Hinic et al. SGM 2015 poster 33

34 Fallbeispiel 34

35 Fallbeispiel PORIN VERLUST 35

36 Regulation der Poren als Resistenzmechanismus Peleg AY et Hooper DC, N Engl J Med

37 Porinverlust ESBL/AmpC und Porinverlust (OmpK35/K36) Molekülgrösse Ertapenem > Imipenem/Meropenem Ladung des Antibiotikums Ertapenem g/mol Meropenem g/mol Imipenem g/mol 37

38 Proteomics in der Bakteriologie: Detektion von Poren in der Bakterienmembran Shotgun-proteomics Hoang et al, Plasmid 43, 59-72, (2000); Kollaboration mit Prof. Dirk Bumann, Biozentrum, Uni Basel 38

39 Porinverlust in der Membran von Pseudomonas aeruginosa Massenspektrometrie direkt aus dem Sputum Detektion von Poren in der Membran Kollaboration mit Prof. Dirk Bumann, Biozentrum, Uni Basel 39

40 Zusammenfassung Moderne Identifikation beruht auf Massenspektrometrie. Viele weitere Anwendungsmöglichkeiten in der nahen Zukunft. ESBL und Carbapenem resistente Keime nehmen rasch zu. Rasches und günstiges Screening wird essentiell sein für ein optimiertes und effektives Antibiotic Stewardship. Aktuelle phänotypische Screeningmethoden sind zu langsam für ein effizientes Management. PCR ist zwar schnell aber (noch) teuer (Assaykosten). 40

41 Danke für ihre Aufmerksamkeit! Kontakt: PD Dr. med. Dr. phil. Adrian Egli Leiter der Abteilung Klinische Mikrobiologie, Universitätsspital Basel Forschungsgruppenleiter: Applied Microbiology Research, Department Biomedizin, Universität Basel Website Diagnostik: Website Forschung:

42 Vorlesung Normalflora; Adrian Egli