Ein Antibiotikaresistenzmechanismus. Einleitung. Antibiotika werden durch Bakterien und Pilze hergestellt

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1 β-lactamase Ein Antibiotikaresistenzmechanismus Einleitung Antibiotika werden durch Bakterien und Pilze hergestellt Entwicklung eines Schutz- bzw. Resistenzmechanismuses gegen das eigene AB. Übergang des Resistenzmechanismuses auf andere Bakterienarten (häufig durch Plasmide) Schutz- bzw. Resistenzmechanismen folgen häufig zwei Grundprinzipien. Antibiotisch wirksame Moleküle können chemisch verändert werden Veränderung der Zielmoleküle (Biosyntheseenzyme) dieser Antibiotika, so dass das Antibiotikum nicht mehr gebunden werden kann. 1

2 Antibiotika werden unwirksam durch Verbreitung der Resistenzen in Bakterien. Hoher jährlicher Verbrauch der AB: ca Tonnen Ausbreitung der Antibiotikaresistenzen wirkt sich erheblich auf die Behandlung von Krankheiten aus. Etwa dreiviertel aller angewendeten Antibiotika sind vom β-lactamtyp. Jährlicher, weltweiter Verbrauch der AB 2

3 β-lactamase β-lactamase ist ein Enzym, welches Penicillin bindet und für die Spaltung des β- Lactamringes verantwortlich ist. Ist das bla-gen in den Bakterien vorhanden und wird es dort expremiert, so wird das β- Lactamantibiotikum durch die gebildete β- Lactamase inaktiviert. Die β-lactamase spaltet den β-lactamring und bildet dabei eine Säure. Spaltung des β-lactamringes 3

4 Methoden Optische Dichtemessung Titration einer Phenolrotlösung (ph-indiaktor) mit Essigsäure β-lactamase-test Inaktivierung der β-lactamase Antibiotikatest in Lebensmitteln Molekularbiologische Methoden Plasmidisolierung Transformation des Plasmids in E. coli Ergebnisse Erstellen eines β-lactamase-testsystems Basischer ph-bereich (rot) Saurer ph-bereich (gelb) 4

5 Strukturformel von Phenolrot: - Links: basisch - Rechts: sauer Titrationskurve 5

6 Messung der β-lactamase Gram-negative Bakterien A: E. coli ohne puc18 B: E. coli mit puc18 (Amp r ) Plasmidisolierung aus E.coli Linke Spur: E. coli- Stamm Mittlere Spur: E. coli- Stamm mit puc18 Rechte Spur: Längenstandard 6

7 Gram-positive Bakterien Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae 7

8 Lokalisation und Eigenschaften Hohe blaue Balken stehen für eine hohe β-lactamase-aktivität. Hohe rote Balken stehen für keine Ansäuerung des ph-indikators und damit für keine β-lactamase-aktivität. Hitzeinaktivierung C: RT H 2 O Oberer Reihe: nach Inkubation bei den angegebenen Temp. Untere Reihe: Nach 50-minütiger Inkubation bei 37 C 8

9 Hemmung der β-lactamasen β-lactamasen werden bei pharmazeutischen Anwendungen durch Inhibitoren gehemmt: Clavulansäure ist gebräuchlich. Sie ist eine Lactamanaloge Verbindung, die sehr viel fester an β- Lactamasen bindet als ein β- Lactamantibiotikum. Amoxicillin Clavulansäure Hemmung bei E. coli durch Clavulansäure Inkubation T 0 min T 60 min Ansatz Amoxicillin E 430 nm (gelb) 0,672 0,753 T 0 min T 60 min Amoxicillin + Clavulansäure 0,581 0,479 9

10 Hemmung bei Staphylococcus aureus durch Clavulansäure Inkubation T 0 min T 60 min Ansatz Amoxicillin E 430 nm (gelb) 1,078 1,169 T 0 min T 60 min Amoxicillin + Clavulansäure 1,136 1,075 Biologischer Nachweis von Antibiotika in Milch Links Milch mit AB, rechts AB-freie Milch 10

11 Zusammenfassung Ein Test zum Nachweis von β-lactamase wurde gefunden. Der Test beruht auf dem Messen eines Farbumschlags des ph-indikators Phenolrot Es wurde eine unterschiedliche β-lactamase- Aktivität festgestellt. Die Hitzeempfindlichkeit und die Hemmung durch Clavulansäure ist ein Beweis dafür, dass β-lactamase ein Enzym ist. Es muss ein bla- Gen vorhanden sein, damit die β- Lactamase gebildet wird. Dadurch kann eine Enzymaktivität nachgewiesen werden. 11

12 Die β-lactamase-aktivität war in Grampositiven und Gram-negativen Bakterien an die Zellen gebunden. Mit einem Test wurde AB in Lebensmitteln nachgewiesen. Beruht auf der Wachstumshemmung des ABempfindlichen Bacillus stearothermophilus Verbreitung der AB in unserer Umwelt kann durch den Test nachgewiesen werden. Ausblick Die Resistenzbildungen werden durch die große Menge der eingesetzten AB gefördert % der AB werden in der Humanmedizin unnötig eingesetzt, weshalb der Mensch mit verantwortlich für die Resistenzausbreitung ist Verantwortungsbewussterer Umgang mit dem Verbrauch der AB nötig 12

13 Danke für Eure Aufmerksamkeit!? 13