Induktion der β-galaktosidase von Escherichia coli

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1 Induktion der β-galaktosidase von Escherichia coli 1. Einleitung Das Bakterium Escherichia coli ist in der Lage verschiedene Substrate für seinen Stoffwechsel zu nutzen. Neben Glucose und Acetat kann es auch das Disaccharid Lactose verwerten. Die für den Lactosestoffwechsel benötigten Enzyme werden gemeinsam als so genanntes lac-operon reguliert. Das Operon umfasst einen lac-promotor, einen lac-operator sowie die Strukturgene für die Enzyme β-galaktosidase (lacz), Lactosepermease (lacy) und Transacetylase (laca). Zur Regulation der Enzymexpression unterliegt das gesamte lac-operon sowohl einer positiven, als auch einer negativen Kontrolle. Abb. 1 Bestandteile des Lac-Operons Wenn keine Lactose im Nährmedium vorhanden ist, werden die Enzyme des Lactosestoffwechsels durch den lac-repressor (laci), der in der DNA vor dem Lac- Operon codiert ist, unterdrückt. Der Repressor bindet an die Operatorregion des lac-operons und verhindert die Transkription der Strukturgene. Ist Lactose (β-d- Galactosyl-β-1,4-D-Glucose) im Medium vorhanden, wird diese von der β- Abb. 2 Lactose Galactosidase zu Allolactose (β-d- Galactosyl-β-1,6-D-Glucose) umgesetzt, welche dann als Induktor für die Expression der Strukturgene des lac-operons wirkt. Der Induktor bindet an den Repressor woraufhin sich dessen Konformation ändert und eine Bindung an den Operator nicht Seite 1 von 6

2 mehr möglich ist (negative Regulation). Zur endgültigen Expression der Enzyme des Lactosestoffwechsels bedarf es aber auch eines positiven Regulationssignals. In einem glucosefreien Medium bildet die Zelle cyclisches AMP (camp), das als Hungersignal wirkt. camp bildet mit dem Genaktivatorprotein CRP (camp Rezeptor Protein) einen Komplex, der an dem Promotor bindet und damit die Expression der Strukturgene ermöglicht. Die Bildung von camp wird durch das Phosphotransferasesystem (PTS) kontrolliert. Abb. 3 Phosphotransferasesystem von E.coli Um Glucose in die Zelle aufnehmen zu können, wird diese über eine Enzymkaskade, die man als PTS bezeichnet, phosphoryliert. Als Phosphat-Donor dient Phosphoenolpyruvat, dass das Phosphat auf das Enzym E I überträgt. Von E I aus wird das Phosphat über HPr und E III auf E IIA übertragen. E IIA überträgt das Phosphat dann auf Glucose, welche als Glucose-6-Phosphat in die Zelle aufgenommen wird. Diesen Transportmechanismus bezeichnet man als Gruppentranslokation, da das Substrat während der Aufnahme in die Zelle chemisch verändert wird. In einem glucosehaltigen Medium liegt das Enzym E IIA hauptsächlich dephosphoryliert vor. Dieser Zustand wirkt sowohl auf die Adenylat-Cyclase, als auch auf die Lactosepermease hemmend. Es kann also weder camp gebildet werden (durch die Adenylat-Cyclase) noch Lactose in größerem Umfang in die Zelle transportiert werden (durch die Lactosepermease). Seite 2 von 6

3 Ist im Medium keine Glucose vorhanden, liegt das Enzym E IIA meist im phosphorylierten Zustand vor. Dieser Zustand aktiviert die Adenylat-Cyclase und camp kann gebildet werden. Das gebildete camp kann jetzt mit CRP zu einem Komplex zusammentreten und die Expression der Enzyme des lac-operons aktivieren (natürlich muss auch das zweite Signal des Induktors vorhanden sein). Bei Fehlen von Glucose wird außerdem die Hemmung der Lactosepermease aufgehoben und Lactose kann in die Zelle aufgenommen werden (im Symport mit H + -Ionen). Um zu gewährleisten, dass der Stoffwechsel wirklich nur bei Fehlen von Glucose auf Lactoseverwertung umschaltet, muss camp kontinuierlich aus der Zelle entfernt werden. Wenn es zu einer Akkumulation von camp kommen würde, würden die Enzyme des Lactosestoffwechsels auch bei Vorhandensein von Glucose aktiviert werden können und somit ein ungünstigeres Substrat verwertet werden. Wenn die Lactose in die Zelle aufgenommen wird, wird sie durch die β-galactosidase in Glucose und Galactose gespalten. Glucose kann direkt den Hexoseabbauwegen zugeführt werden. Galactose muss vor dem Abbau erst zu Glucose isomerisiert werden. Damit das System funktionieren kann, muss in der Zelle ständig eine geringe Anzahl der Enzyme des Lactosestoffwechsels expremiert werden. Wäre dies nicht der Fall, könnte Lactose weder in die Zelle aufgenommen werden, noch könnte sie in Allolactose umgesetzt werden und als Induktor wirken. Wenn das lac-operon aktiviert wird, kann die Konzentration der Enzyme in der Zelle um den Faktor 1000 steigen. Bei Kultivierung von E.coli in Medien die Glucose und Lactose enthalten, tritt eine so genannte Diauxie auf. Damit bezeichnet man einen doppelten Wachstumscyclus bzw. ein zweiphasiges Wachstum, das dadurch bedingt ist, dass zuerst sämtliche im Medium enthaltene Glucose verstoffwechselt wird, bevor die Enzyme des Lactosestoffwechsels gebildet werden. Erst danach wird die Lactose als Substrat genutzt. Die Diauxie ist mit den oben ausgeführten Regulationsmechanismen des lac-operons leicht zu erklären. Im vorliegenden Versuch soll die Induktion des lac-operons über das Enzym β- Galactosidase untersucht werden. Dazu werden unter entsprechenden Bedingungen gezüchtete Vorkulturen mit einem induzierenden (Lactose) und einem nicht Seite 3 von 6

4 induzierenden (Glucose) Medium gezüchtet. Außerdem wird ein Medium verwendet, das sowohl Glucose als auch Lactose enthält. Nach ca. zweistündiger Inkubation wird über die OD 578 die gebildete Zellmasse (Zellzahl) bestimmt. Danach wird die Aktivität der β-galactosidase ermittelt. Dazu werden die Zellen mit Detergenzien permeabilisiert ohne dass die β-galactosidase geschädigt wird. Als Nachweisreagenz dient σ-nitrophenyl-β-galactosid (ONPG), ein Strukturanalogon der Lactose, dass durch die β-galactosidase in Galactose und σ- Nitrophenol gespalten wird. Abb. 4: Spaltung des ONPG durch die β-galactosidase Das gebildete σ-nitrophenol ist gelb gefärbt und kann photometrisch bei 420nm gemessen werden. 2. Material und Methoden Die ausführliche Versuchsbeschreibung sowie die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen sind im Skript (Versuch 6) zu finden. 3. Ergebnisse Zur Berechnung der Enzymaktivität der β-galactosidase wurde die Optische Dichte der Versuchskulturen im Photometer bei 578nm bestimmt. Tab. 1: Bestimmung der OD 578 der Versuchskulturen Blindwert (BW) = 0,050 OD 578 Glucose Lactose Glucose + Lactose unverdünnt-bw 0,474 0,455 0,476 verdünnt-bw 0,29-0,24 Verdünnungsfaktor 2-2 Endwert 0,58 0,455 0,48 Lagen die ermittelten Werte über 0,5 wurde eine entsprechende Verdünnung durchgeführt. Seite 4 von 6

5 Die Aktivität der β-galaktosidase wurde ebenfalls photometrisch bestimmt. Gemessen wurde die Absorption des σ-nitrophenols bei 420nm. Tab. 2: Bestimmung der Aktivität der β-galactosidase Glucose Lactose Glucose + Lactose Inkubationszeit 30min 3min 30min Blindwert 0,051 0,058 0,048 E420 (1) 0,057 0,51 0,319 E420 (2) 0,055 0,483 0,319 E420 (3) 0,056 0,482 0,317 Mittelwert (1-3) 0,056 0,492 0,318 Mittelwert-BW 0,005 0,434 0,270 Miller Units Von den jeweils drei ermittelten Werten wurde der Mittelwert gebildet und der Blindwert abgezogen. Zur Berechnung der Enzymaktivität in Miller-Units wurde folgende Formel verwendet: 1000 * (E 420 Probe E 420 BW ) Aktivität (Miller-Units) = Zeit [min] * V Probe [ml] * (OD 578 Probe OD 578 Medium ) Die Berechnung der Miller-Units soll am Beispiel des Lactose Ansatzes demonstriert werden: 1000 * (0,492 0,058) Aktivität (Miller-Units) = = * 0,2 * (0,505 0,05) 4. Diskussion Die Ergebnisse des Versuches entsprachen vollkommen unseren Erwartungen. Wenn E. coli in einem Medium kultiviert wird, dass als C-Quelle ausschließlich Glucose enthält, ist die Aktivität der Enzyme des Lactoseabbauweges sehr gering. Es werden nur äußerst geringe Mengen der Enzyme gebildet, die dazu dienen, Lactose im Medium zu erkennen um bei Bedarf auf den Lactosestoffwechsel umschalten zu können (siehe auch Einleitung). Eine Kultivierung mit lactosehaltigem Medium ohne Glucose führt zu einer Aktivitätssteigerung der Enzyme um mehr als das tausendfache. Lactose bzw. Allolactose aktiviert zusammen mit dem in Abwesenheit von Glucose gebildeten Seite 5 von 6

6 camp-crp-komplex die Produktion der Enzyme des lac-operons. Somit kann Lactose gespalten und die Monomere in den Hexosestoffwechsel eingebracht werden. Wird dem Nährmedium sowohl Glucose als auch Lactose zugesetzt, beginnt E. coli zuerst mit der Verwertung der Glucose. Erst wenn die Glucose komplett verbraucht ist, wird vollständig auf den Lactosestoffwechsel umgeschaltet, da erst dann das positive camp-crp Signal auf das lac-operon einwirken kann. Wie in der Einleitung ausgeführt wurde, bezeichnet man dieses zweiphasige Wachstum als Diauxie. Dennoch findet auch schon während der Glucoseverwertung eine stärkere Produktion der Enzyme des Lactosestoffwechsels statt, die als eine erhöhte Enzymaktivität (in Miller-Units) im Versuch erkannt werden konnte. 5. Literatur Schlegel: Allgemeine Mikrobiologie, 1992 Skript zum Praktikum Internet Seite 6 von 6