Transkription und Regulation der Genexpression
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- Hans Bäcker
- vor 7 Jahren
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Transkript
1 Transkription und Regulation der Genexpression Dr. Laura Bloch
2 1. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie Laura Bloch 2
3 2. RNA vs. DNA Desoxyribose und Ribose die 2 -OH-Gruppe der Ribose ist bei basichem ph (8,0+) reaktiver als das H-Atom der Desoxyribose Ribose hat zwei Möglichkeiten NTPs zu binden, am 2 - und 3 - OH (erhöhte Fehlerrate) Laura Bloch 3
4 2. RNA vs. DNA (Wiederholung) Desoxyribose und Ribose Uracil in RNA und Thymin in DNA Laura Bloch 4
5 2. RNA vs. DNA (Wiederholung) Desoxyribose und Ribose Uracil in RNA und Thymin in DNA Einzelstrang und Doppelstrang Laura Bloch 5
6 3a. Ort der Transkription
7 3b. Die Phasen der Transkription (Eukaryonten) Initiation Elongation Termination Laura Bloch 8
8 3c. Welche Komponenten werden benötigt? DNA-Matrize DNA-abhängige RNA- Polymerase NTPs (Ribonucleosidtriphosphate) Transkriptionsfaktoren Laura Bloch 9
9 Zusammenfassung 3d. Vergleich Pro- und Eukaryonten Transkription Prokaryonten Eukaryonten Ort Zytoplasma Kern und Mitochondrien RNA- Polymerasen Promotor 1 (bestehend aus α 2 ββ und σ) Pribnow-Box/TATA-Box und -35-Region 3 verschiedene (aus vielen UE) Viele regulatorische Elemente (TATA-Box, BRE, Inr ) Initiation Polymerase mit σ-faktor Initiationskomplex und Transkriptionsfaktoren Termination ρ-abhängig oder Haarnadel Endonuclease/Polyadenylierung oder Terminationssignal mrna Häufig polycistronisch Keine Introns Monocistronisch Mit Introns Laura Bloch 10
10 4. Capping, Spleißen und Poly-A-Schwanz Modifikationen, die bereits während der Transkription erfolgen. Die entsprechenden Faktoren sind mit der RNA-Polymerase assoziiert Laura Bloch 11
11 Capping Laura Bloch 12
12 Spleißen/Splicen Laura Bloch 13
13 Spliceosom Laura Bloch 14
14 Alternatives Splicen Aus einer prä-mrna (hnrna) können durch das Zusammenfügen unterschiedlicher Exons verschiedene mrnas gebildet werden Laura Bloch 15
15 Poly-Adenylierung Laura Bloch 16
16 RNA-Editing und Basenmodifikationen Editing: Cytidin Uridin Adenosin Inosin Basenmodifikationen: Uridin Pseudouridin, Dihydrouridin Guanosin N 2 - Methylguanosin Laura Bloch 17
17 4. Zusammenfassung Laura Bloch 18
18 5. Viele RNA-Moleküle RNA-Typ Funktion Synthese durch mrna (hnrna) rrna Messenger RNA, kodiert für Proteine; Ribosomale RNA; strukturelle Funktion im Ribosom und katalytisch für die Knüpfung von Peptidbindungen RNA-Polymerase II RNA-Polymerase I (18S; 5,8S; 28S) und III (5S) trna Transfer RNA; Adapter zwischen RNA und Aminosäuren bei Translation RNA-Polymerase III snrna Small nuclear RNA; verschiedene Kernprozesse (splicen..) RNA-Polymerase II und III snorna Small nucleolar RNA; Prozessieren von rrnas RNA-Polymerase II und III sirna mirna weitere Short interfering RNA; binden an mrna und führen zu deren Abbau Micro RNA; binden an mrna und verhindern deren Translation bzw. führen zu deren Abbau Unterschiedliche Funktionen (Telomerase; RNA-Editing ) RNA-Polymerase II RNA-Polymerase II Laura Bloch 19
19 5. Viele RNA-Moleküle - mirna Laura Bloch 23
20 6. Der Promotor Upstream-Element -35-Region TATA/Pribnow-Box Prokaryonten Enhancer /Silencer GC- Box CAAT- Box TATA Box BRE u BRE d +1 INR MTE DPE -100 bp - 10 kb BRE: TF II B recognition element upstream/downstream -2 INR: Initiator Element MTE: motif ten element DPE: downstream promoter element Eukaryonten Laura Bloch 24
21 7a. Was sind cis-elemente? Kurze DNA-Bereiche definierter Sequenz Regulatorische DNA-Elemente Bindungsstellen für trans-faktoren 7b. Was sind trans-faktoren? Genregulatorische Proteine, die die cis-elemente spezifisch erkennen und binden Transkriptionsfaktoren Laura Bloch 25
22 7c. Transkriptionsinitiation bei Eukaryonten TFIID: besteht aus TBP (TATA-Box binding protein) und TAFs (TBP-associated factors) bindet an TATA-Box TFIIA und TFIIB binden an BRE und TFIID TFIIF bindet zusammen mit RNA- Polymerase an TFIIB und INR TFIIE TFIIH 10 Untereinheiten mit Helicase-Aktivität, ATPase und Proteinkinase Phosphorylierung der C-Terminalen Domäne der Polymerase Transkriptionsstart Laura Bloch 26
23 7c. Transkriptionsinitiation bei Eukaryonten Laura Bloch 27
24 7d. DNA-Bindemotive bei Transkriptionsfaktoren Bindungsmotiv Besonderheit Beispiel Helix-Turn- Helix Helix-Loop- Helix Bindet an große Grube palindromischer DNA-Sequenzen Basische Bindungssequenz Dimerisierung; bindet an große Grube palindromischer DNA-Sequenzen Homöoboxproteine c-myc; HIF β-faltblatt Bindet an große Grube NFκB Zn-Finger Bindet an große Grube Nukleäre Hormonrezeptoren (ER; AR; GR ); Sp1 Leucin-Zipper Dimer; bindet inverted repeats c-fos; c-jun HMG-Box Bindet an kleine Grube TCF; SOX Laura Bloch 28
25 7d. Prinzip der Sequenzerkennung H-Brücken Ionische WW Van-der-Waals-Kräfte Laura Bloch 29
26 7d. DNA-Bindemotive Transkriptionsfaktoren bilden Dimere (Homo- und Heterodimere) Transkriptionsfaktoren binden in die große Grube der DNA (Ausnahme HMG-Box) Transkriptionsfaktoren binden mittels α-helix an die DNA (Ausnahme β-faltblatt) Laura Bloch 30
27 7d. Helix-Turn-Helix und Homöodomäne Laura Bloch 31
28 7d. Leucin-Zipper Dimerisierung über α-helices mit vielen Leucin-Resten (jeder 7. Rest) hydrophober Effekt Am unteren Ende bindet eine basische Region an die DNA Laura Bloch 32
29 7d. Zink-Finger Zn 2+ bindet über Cys und/oder His ans Protein (Cys 2 His 2 Zn oder Cys 4 Zn). Sorgt für eine genaue Orientierung der DNA-Bindedomäne Laura Bloch 33
30 7e. Regulation von Transkriptionsfaktoren Laura Bloch 34
31 8a. Lac-Operon CRP Promotor Operator Lac I Lac Z Lac Y Lac A Lac-Repressor β-galactosidase Permease Transacetylase Laura Bloch 35
32 8a. Lac-Operon ohne Lactose CRP Promotor Operator Lac I Lac Z Lac Y Lac A Lac-Repressor β-galactosidase Permease Transacetylase RNA-Polymerase Laura Bloch 36
33 8a. Lac-Operon mit Lactose CRP Promotor Operator Lac I Lac Z Lac Y Lac A Lac-Repressor β-galactosidase Permease Transacetylase RNA-Polymerase Allolactose Laura Bloch 37
34 8a. Lac-Operon ohne Glucose mit Lactose CRP Promotor Operator Lac I Lac Z Lac Y Lac A CRP + camp Lac-Repressor β-galactosidase Permease Transacetylase RNA-Polymerase Allolactose Laura Bloch 38
35 8a. Lac-Operon ohne Glucose ohne Lactose CRP Promotor Operator Lac I Lac Z Lac Y Lac A CRP + camp Lac-Repressor β-galactosidase Permease Transacetylase RNA-Polymerase Laura Bloch 39
36 8b. Trp-Operon Laura Bloch 40
37 8b. Trp-Operon Laura Bloch 41
38 9a. Chromatin Laura Bloch 42
39 9b. Genregulatorische Chromatin-Proteine - Histone Laura Bloch 43
40 9b. Genregulatorische Chromatin-Proteine - Histone Laura Bloch 44
41 9c. Histon-Modifikationen Acetylierung an Lysinresten Histonacetyltransferasen (HATs) und Histon-Deacetylasen (HDACs) Ladungsänderung Auflockerung der Nucleosomenstruktur Acyllysine dienen als Bindungsstelle für Proteine mit Bromodomäne Methylierung an Lysin- und Arginin-Resten Histonmethyltransferasen und Histondemethylasen Proteine mit Chromodomäne binden an methylierte AS Phosphorylierung an Serin- und Threonin- Resten Proteinkinasen und Phosphatasen Ladungsänderung Ubiquitinierung von Lysinresten Sumoylierung Laura Bloch 45
42 9d. Histon-Code Laura Bloch 46
43 9d. Histon-Code Nature Reviews Immunology 2, (March 2002) Laura Bloch 47
44 9d. Histon-Code Laura Bloch 48
45 9e. Chromatin-Remodelling Nature Structural & Molecular Biology 14, (2007) Laura Bloch 49
46 10. Medikamente und Transkription Actinomycin DNA-interkalierend (Hemmung der Transkription) Wirkt auf Pro- und Eukaryoten Rifamycin und Rifampicin Binden β-ue der prokaryotischen RNA-Polymerase Blockieren RNA:DNA-Kanal im Enzym und verhindern Kettenverlängerung α-amanitin Inhibiert eukaryotische RNA-Polymerasen II und III Gyrase-Hemmer (Fluorchinolone; Nalidixinsäure) Wirken bei Prokaryoten Gyrasen sind Enzyme, die für DNA-Verdrillung/Entdrillung benötigt werden (Supercoiling) Laura Bloch 50
47 11a. Messung von Genexpression - Reportergenassay Abbildung angelehnt an: Böhm, H-J., Klebe, G., und H. Kubinyi (2002): Wirkstoffdesign, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg
48 11a. Messung von Genexpression - qpcr Laura Bloch 52
49 11a. Messung von Genexpression - qpcr Laura Bloch 53
50 11b. Transkriptionsfaktoren und Bindungsstellen Chromatin-Immunpräzipitation Laura Bloch 54
51 11b. Transkriptionsfaktoren und Bindungsstellen EMSA (electromobility shift assay) Laura Bloch
52 Fragen??? Laura Bloch 56
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