Transkription 3. Teil. Posttranskriptionale Modifikationen

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Käthe Adler
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1 Transkription 3. Teil Posttranskriptionale Modifikationen

2 Gliederung des Vortrags 1. Reifung der t-rna 2. Modifikationen der Prä-mRNA 5 Capping 3 Schwanzbildung RNA-Editing Spleißen Alternatives Spleißen

3 Reifung der t-rna Abspaltung einer 5 Leader-Sequenz Entfernung von Introns durch Spleißen Substitution am 3 Ende (von UU zu CCA) Modifikation mehrerer weiterer Basen Zur Entstehung des Endproduktes benötigt man mehrere Enzyme

4 Prozessierung eines Vorläufers der Transfer-RNA Leader Anheftungsstelle für Aminosäure Prozessierung Frühes Transkript Reife trna

5 Herstellung eukaryoter mrna Ein Käppchen für das 5 -Ende Ein Schwänzchen für das 3 -Ende Entfernen der Introns und spleißen der Exons

6 Einführung eines 5 Caps Reaktionsablauf: -Esterspaltung durch Hydrolyse am 5 Ende - Abspaltung eines Phosphat-Restes - Diphosphat greift α-phosphoratom eines GTP an Es entsteht eine sehr ungewöhnliche 5,5 - Triphosphatbindung, das 5 Cap I

7 Einführung eines 5 Caps II Weitere Reaktionen: -Methylierung vom N-Stickstoff des Guanins durch s-adenosylmethionin - Methylierung an den benachbarten Riboseuntereinheiten

8 Caps am 5 -Ende In Cap 0,1 und 2 methyliert Base Base In Cap 1 und 2 methyliert In Cap 2 methyliert

9 Funktion der 5 -Kappe Erhöht die Stabilität der mrna durch Schutz vor Nukleasen und Phosphatasen Beteiligung an Initiation der Translation Unterstützt den Spleißvorgang der hnrna

10 3 Poly-(A)-Schwanz Am 3 Ende I Nach Beendigung der Transkription - Nicht in der DNA codiert Poly-A-Ende besteht aus bis zu 250 Adenylateinheiten

11 3 Poly-(A)-Schwanz II Reaktionsablauf: Erkennung des spezifischen Signals AAUAAA für die Anheftung durch Endonukleasen meist nicht das Ende des primären Transkript Anfügen des Poly-(A)-Schwanzes Durch Polyadenylatpolymerase unter Verbrauch von ATP

12 Polyadenylierung eines Primärtranskripts DNA-Matrize Entstehende RNA Spaltungssignal Spaltung durch spezifische Endonuklease Anfügen des Schwanzes durch Poly-(A)-Polymerase Polyadenylierter mrna-vorläufer

13 Funktion des 3 Poly-(A)- Schwanzes Funktion noch nicht abschließend geklärt Stabilisierung der mrna Unterstützung des nukleozytoplasmatischen Transports Steigerung der Effizienz der Translation

14 Versuche zur Funktion des 3 Poly-(A)-Schwanzes Durch Hemmung der Poly-A-Polymerase mit 3 -Desoxyadenosin Synthese des Primärtranskripts wird nicht beeinträchtigt problemloser Transport der mrna aus dem Zellkern weniger effiziente Translation

15 mrna-editing Änderungen in der mrna, die nicht durch Spleißen zustande kommen, sondern durch Veränderungen der Nukleotidsequenz nach ihrer Synthese Die DNA ist nicht das einzige für die Proteinbiosynthese determinierende Element

16 mrna-editing am Beispiel des Apolipoprotein B (ApoB) Verhüllt zu transportierende Lipoproteinpartikel Es existieren zwei verschiedene Typen: Typ 1: ApoB kd 4536 Reste Transportiert in der Leber endogen gebildete Lipide Typ 2: ApoB kd 2152 Reste Transportiert im Dünndarm Lipide aus der Nahrung

17 Ablauf der mrna-editierung Ein spezielles Cytidin der mrna wird zum Uridin desaminiert das Codon für den Rest 2153 wird von CAA (GLN) zu UAA, einem Stoppsignal, verändert Diese Desaminase befindet sich im Dünndarm, jedoch nicht in der Leber

18 RNA-Editing Zusammenbau des Lipoproteins Bindung an LDL- Rezeptor Unedidierte mrna RNA-Editing durch Desaminierung Editierte mrna

19 Das Spleißen Spleißen beschreibt das Verbinden der Exons miteinander, nachdem die Introns ( Nukleotide) herausgeschnitten wurden Sehr hohe Genauigkeit erforderlich Findet nur bei Eukaryoten statt

20 Spleißsignale für präzises Spleißen Die Basensequenz eines Introns beginnt mit GU und endet mit AG Zusätzlich existiert eine wichtige interne Stelle, die zwischen 20 und 50 Nucleotide stromaufwärts von der 3 Spleißstelle liegt Verzweigungsstelle 5 -Spleißstelle Verzweigungsstelle 3 -Spleißstelle

21 Spleißdefekte Mutationsbedingte Veränderungen von Spleißstellen sind die Ursache für ca. 15% aller genetisch bedingten Krankheiten z.b. Formen der Thalassämie (erbliche Blutkrankheiten) mit Defekten in der Hämoglobinsynthese Ursache ist die Mutation einer einzigen Base von A zu G Erzeugung einer neuen 3 -Spleißstelle

22 Chemischer Ablauf des Spleißens I Spaltung der Phosphordiesterbindung zwischen 3 Ende des Exons 1 und 5 - Spleißstelle des Introns Angriff durch 2 OH-gruppe eines Adenylatrestes der Verzweigungsstelle Entstehung einer 2,5 - Phosphordiesterbindung zwischen 2 - Adenylat-Rest und 5 -Ende des Intron Charakteristische intermediäre Lassostruktur

23 Entstehung der intermediären Lassostruktur 3 - Spleißstelle 5 -Spleißstelle Vorläufer Intermediäre Lassostruktur

24 Chemischer Ablauf des Spleißens II Die freigewordene OH-Gruppe am 3 -Ende des Exons 1 greift nun die Phosphordiesterbindung zw. Exon 2 und Intron an Exon 1 und 2 verbinden sich Das Intron wird in Lassostruktur freigesetzt Die Anzahl der Phosphordiesterbindungen bleibt während dieser Schritte gleich kein Verbrauch von ATP oder GTP

25 Der Spleißmechanismus von intermediären Lassostruktur Intermediäre Lassostruktur Gespleißtes Produkt Lassostruktur des Introns

26 Zusammenfassung hinsichtlich der Chemie Es handelt sich um zwei Umesterungen: 1. Erzeugung der freien 3 -OH-Gruppe am Exon 1 2. Verbindung dieser Gruppe mit dem 5 -Phosphat von Exon 2 Bildung einer intermediären Lassostruktur Kein Bedarf an Energiezufuhr

27 Katalyse des Spleißens Das katalysierende Enzym ist ein Multienzymkomplex Das Spleißosom Bestandteile des Spleißosoms: 1. snrna s (small nuclear RNA) 2. Spleißfaktoren (z.b. Proteine) 3. Vorläufer der mrna Vollständiges Spleißosom

28 snrna s Kleine Zell-RNA s Aufgebaut aus kleinen Nukleotidketten, nicht größer als 300 Bp In ihrer Sekundärstruktur sehr einheitlich Unterteilung in Untereinheiten (U1; U2; U4; U5; U6) Assimiliert mit bestimmten Proteinen zu Snurps (= small nuclear ribonucleoprotein particles)

29 Initiation des Spleißosoms I Erkennung der 5 -Spleißstelle durch U1-snRNP Bindung an die 5 -Spleißstelle durch U1- snrnp Bindung über Basenpaarung Initiation für den Aufbau des Spleißosoms mrna-vorläufer

30 Initiation des Spleißosoms II Anlagerung der U2-snRNP s an die Verzweigungsstelle in dem Intron Basenpaarung zwischen der stark konservierten Sequenz der U2-snRNA und der prä-mrna Anlagerung unter Verbrauch von ATP Addition einer zuvor gebildeten Komplex aus U4, U5 und U6 Verbrauch von ATP Das Spleißosom ist fertig

31 Zusammenbau des Spleißosoms Verzweigungsstelle Vorläufer-mRNA Vollständiges Spleißosom

32 Funktion des Spleißosoms I U5-Einheit tritt mit beiden Exonsequenzen (sowohl 3 als auch 5 ) in Wechselwirkung U6 löst sich von U4 mit anschließender intramolekularer Umlagerung von U6 Dies ermöglicht Basenpaarung mit U2 Anlagerung an U2 U1 wird verdrängt Helix aus U6 und U2 ist unentbehrlich und bildet wahrscheinlich das katalytische Zentrum

33 Das katalytische Zentrum beim Spleißen Vorläufer-mRNA

34 Funktion des Spleißosoms II Diese Umordnungen führen zur ersten Umesterungsreaktion (Lassostruktur; 5 - Exon)) Das U4-snRNP dient als Inhibitor der U6-snRNP: es bindet U6 solange bis die spezifischen Spleißstellen richtig angeordnet sind

35 Funktion des Spleißosoms III Die zweite Umesterung wird durch weitere Umordnung der RNA im Spleißosom begünstigt Das freie 5 -Ende des Exon 1 wird so zurechtgelegt, dass es neben dem 3 -Ende des Exon 2 zu liegen kommt Es kommt zum nucleophilen Angriff und Vereinigung von Exon 1 und 2 Nach Abspaltung der restlichen snrna s ist das Spleißen abgeschlossen

36 Kurzer Rückblick Viele Schritte verbrauchen ATP z.b. die Umlagerungen, weil durch ATPabhängige RNA-Helicasen die RNA erst entwunden werden muss RNA-Moleküle spielen eine wichtige Schlüsselrolle beim richtigen Anordnen und bei der Katalyse

37 Alternatives Spleißen I Weitere Möglichkeit, um aus einen hnrna-transkript unterschiedliche Proteine herzustellen Herausschneiden von Introns und Exons

38 Alternatives Spleißen mit 2 Exonalternativen 2A und 2B Prä-mRNA

39 Ende

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