Thema Transkription und Genregulation Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Gentechnologische Sicherheitsforschung & Beratung

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1 Thema Transkription und Genregulation Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Gentechnologische Sicherheitsforschung & Beratung

2 Thema: Gene und Transkription Was ist ein Gen?

3 Heute: Gendefinition: Ein Gen ist ein DNA-Abschnitt, von dem eine biologisch aktive RNA transkribiert werden kann. Zu einem Gen gehören neben dem transkribierten Bereich auch die für die Transkription notwendigen Bereiche wie Promotor, Initiatorregion und weitere cisregulatorische Elemente

4 Genstruktur (grob schematisch) Initiator (region) Kontrollelemente Promotor Transkribierter Bereich Termination Die Genstruktur ist für verschiedene Gene und insbesondere für Pro- und Eukaryoten sehr verschieden. Die obige Skizze zeigt nur sehr schematisch die grundsätzlich zu einem Gen gehörenden DNA-Abschnitte

5 Ein Gen ist durch seine RNA definiert! Gene für mrnas und damit für Polypeptide Gene für trnas Gene für rrnas (ribosomale RNAs) Gene für snrnas (small nuclear RNAs) Gene für microrna/sirnas etc.

6 Gene haben eine festgelegte Orientierung: immer von 5 nach 3 abgebildet wird der Nicht-Template-Strang (entspricht der sense -RNA)

7 Das zentrale Dogma der Molekulargenetik: Transkription: Umschreibung von DNA in RNA

8 Chemische Unterschiede zwischen RNA und DNA: in der RNA Ribose H 3 2

9 Chemische Unterschiede zwischen RNA und DNA: in der RNA: Uracil statt Thymin Achtung Ausnahme: in trna kommt regelmäßig Thymin vor H Uracil Thymin = 5-Methyl-Uracil

10 Unterschiede zwischen RNA und DNA: RNA ist in der Regel einzelsträngig, bildet aber fast immer durch Rückfaltung partiell Doppelhelices aus. Dadurch entstehen komplizierte Sekundärstrukturen, die über sehr lange evolutionäre Zeiträume konserviert wurden und für die Funktion der RNA sehr wichtig sind

11 Ähnliche Sekundärstruktur der ribosomalen RNA (18s rrna) aus Wasserfloh und Hefe

12 Funktionen von RNAs Sehr vielfältig: -mrna (messengerrna), -r(ibosomale)rnas, (>90% der RNA in einer Zelle) -trnas, -snrnas, -microrna -Ribozyme (RNAs mit Enzymfunktion) -Untereinheit der Telomerase

13 Die Biosynthese der RNA erfolgt von 5 nach 3, der Template-Strang hat die Orientierung 3-5

14 Für die Synthese von RNA werden (Ribo-)Nukleosid-5 triphosphate benötigt

15 Für die Bildung der Phosphodiesterbindung wird Energie benötigt, die durch die Abspaltung von Pyrophosphat aus Nukleosidtriphosphaten gewonnen wird -

16 Die RNA-Synthese ist Template-gesteuert! Der Template-DNA-Strang wird abgelesen von 3 nach 5`! (der Template-Strang entspricht dem antisense Strang!!! )! Die Kettenverlängerung der RNA erfolgt in 5-3 -Richtung A

17 Für die RNA-Synthese sind die RNA-Polymerasen zuständig. Prokaryoten haben nur eine RNA-Polymerase, Eukaryoten drei (vier) verschiedene. (plus mitochondriale und plastidäre RNA-Polymerasen)

18 Die Bakterien-RNA-Polymerase ist ein Molekül aus mehreren Untereinheiten

19 Für die Initiation der RNA-Synthese kommt zu dem Core -Enzym der Sigma -Faktor hinzu

20 Bei Eukaryoten gibt es drei verschiedene kernkodierte RNA- Polymerasen (plus mt und cp RNA-Pol) und damit drei verschiedene Genklassen. Kürzlich ist bei Pflanzen eine vierte RNA-Polymerase entdeckt worden. Pol II Pol III Pol I sirnas Pol IV

21 Vergleich eukaryotischer mit prokaryotischen RNA- Polymerasen Die Abb. zeigt die komplizierte Zusammensetzung der bakteriellen sowie der eukaryotischen und archaeischen und RNA- Polymerasen mit 12 oder mehr Untereinheiten. Bei dieser Tabelle wird auch klar, dass Archaea mit Eukaryoten näher verwandt sind als mit Eubakterien. Die Farbkodierung weist auf sequenzverwandte Polypeptide hin. Man erkennt, dass fast alle Untereinheiten der Archea-RNA-Pol auch bei Eukaryoten zu finden sind.

22 Die drei eukaryotischen RNA-Polymerasen lassen sich anhand ihrer Sensitivität gegenüber den Transkriptionsinhibitoren -Amanitin und Actinomycin D unterscheiden

23 Amanitin: Gift aus dem Grünen Knollenblätterpilz; tödliche Dosis 0,1mg/kg Körpergewicht

24 -Amanitin hemmt RNA- Pol II bei geringen Konzentrationen bereits vollständig, RNA Pol III wird nur durch hohe Konzentration vollständig gehemmt. RNA Pol I ist Amanitin resistent. Strukturformeln:

25 Actinomycin D (aus Streptomyces parvulus) hemmt besonders stark die RNA-Pol I, weil es sich bevorzugt an GC-Basenparen anlagert und rrna-gene sehr GC-reich sind.

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27 Neben den RNA-Polymerasen sind weitere Proteine an dertranskription beteiligt: Die Aktivierung von Genen erfolgt durch Transkriptionsfaktoren (TFs) Es gibt basale TFs (immer vorhanden und für jede Transkription notwendig) und spezifische TFs (gewebs-/zellspezifisch; hormoninduziert; entwicklungsspezifisch etc.) Jede Genklasse hat eigene TFs

28 Die basalen Transkriptionsfaktoren: Je nach Genklasse und RNA-Pol werden die Transkriptionsfaktoren TF IA, TF IB...; TF IIA, TF IIB..; TF IIIA etc. bezeichnet Daneben gibt es eine Reihe anders benannter Proteine, die die Genaktivität steuern und nicht immer Teil des basalen Transkriptionskomplexes sind (z. B. SP1).

29 Präinitiation bei RNA Pol II-Genen: Der Basale Transkriptionskomplex (Präinitiationskomplex) der Pol II Gene: TF IID, TF IIA, TF IIB + Pol II-TFIIF F Präinitiation, stark vereinfacht F

30 Besondere Rolle von TF IID: TF IID enthält als Untereinheit das TBP ( TATA- Box binding Protein) und sog. TBP associated factors(taf). Das TBP erkennt die TATA-Box (s.u.) und bindet als erstes Protein an den Gen-Promotor. Erst danach erfolgt die Bindung der anderen TFs und schließlich zuletzt die der RNA-Polymerase II in Verbindung mit TF IIF.

31 TBP (TATA-box binding protein) TBP bindet im Gegensatz zu den meisten DNAbindenden Proteinen in der kleinen Grube der DNA TBP krümmt die DNA durch die Bindung und verursacht so einen scharfen Knick TBP vermittelt die Bindung weiterer TFs an den Promotor TBP ist auch bei Genen ohne TATA-Box am Präinitiationskomplex beteiligt, und zwar auch bei Pol I- und Pol III-Genen

32 TBP (TATA-box binding protein) TBP bindet im Gegensatz zu den meisten DNAbindenden Proteinen in der kleinen Grube der DNA

33 TATA-Box binding protein (TBP)

34 Sattel-Struktur des TBP auf der DNA

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36 Funktionen der einzelnen TFs Phosphorylierung der CTD

37 TBP (TATA Binding Protein, see TATA Binding Protein) and an attached complex TAFs, collectively known as TFIID (Transcription Factor for polymerase II D), bind at the TATA box. TFIIA (three subunits) binds TFIID and DNA, stabilising the first interactions. TFIIB binds between TFIID and the location of Pol II binding in the near future. TFIIB binds partially sequence specifically, with some preference for BRE. TFIIF and Pol II (two subunits, RAP30 and RAP74, showing some similarity to bacterial sigma factors) enter the complex together. TFIIF helps to speed up the polymerization process. TFIIE enters the complex, and helps to open and close the PolII s Jaw like structure, which enables movement down the DNA strand. TFIIE and TFIIH enter concomitantly. Finally TFIIH binds. TFIIH is a large protein complex that contains among others the CDK7/cyclin H kinase complex and a DNA helicase. TFIIH has three functions: it binds specifically to the template strand to ensure that the correct strand of DNA is transcribed and melts or unwinds the DNA (ATP dependently) to separate the two strands using its Helicase activity. It has a kinase activity that phosphorylates the C- terminal domain (CTD) of Pol II at the amino acid serine. This switches the RNA polymerase to start producing RNA, which marks the end of initiation and the start of elongation. Finally it is essential for Nucleotide Excision Repair (NER) of damaged DNA. TFIIH and TFIIE strongly interact with one another. TFIIE affects TFIIH s catalytic activity. Without TFIIE, TFIIH will not unwind the promoter. Mediator then encases all the transcription factors and the Pol II. Mediator interacts with enhancers, areas very far away (upstream or downstream) that help regulate transcription.

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39 Präinitiation bei Polymerase I-Genen stark vereinfacht UBF: Upstream binding factor UCE: Upstream control element TBP: TATA-box binding protein SL-1: Selectivity factor 1 Core: core promotor

40 Präinitiation bei Pol III-Genen TF IIIC TBP TF IIIB TF IIIC Pol III TBP TF IIIB TF IIIC TBP TF IIIC TF IIIB Pol III

41 Präinitiation bei Genen Nur für Interessierte! a) mit TATA-Box b) ohne TATA-Box c) mit GC-Box

42 Zusammenfassung: Präinitiationskomplexe der verschiedenen Genklassen

43 DNA-bindende Proteine: Die wichtigsten Interpreter des DNA-Kommando- Codes Die Vermittler zwischen ankommenden Signalen und Umsetzung durch die Gene transaktive Steuerungselemente von Genen oder ganzen Gengruppen Globale oder lokale Modifikatoren der Chromatinstruktur und damit der Genaktivität

44 DNA bindende Proteine haben eine DNA- Bindedomäne und binden oft als Dimere

45 Die wichtigsten DNA-binde-Proteine Helix-turn-Helix Zinkfinger Leucin Zipper

46 Helix Proteine: Basisches Loop DNA-binde- Helix-loop- Helix-Protein (bhlh) Helix

47 ZinkfingerProteine (ZF)

48 Die wichtigsten DNA-binde-Proteine: Zinkfinger-Proteine Cys-His-Typ

49 Die wichtigsten DNA-binde-Proteine: Leucin- Zipper

50 H-Brückenbindungen zwischen Aminosäuren des Proteins und Basen der DNA über die große Grube stellen die sequenzspezifische Bindung sicher

51 Die Aminosäuren der DNA-binde-Proteine interagieren über die große Grube direkt mit den Basen der DNA

52 Transkription und Genregulation bei Prokaryoten Genregulation: An- und Abschaltung von Genen entsprechend Bedarf

53 Die Transkription der Prokaryotengene erfolgt in drei Stufen: 1. Initiation 2. Elongation 3. Termination

54 Für die Initiation ist neben der Core - RNA-Polymerase der Sigma -Faktor notwendig. Der Sigma-Faktor löst sich nach der Synthese von ca. 10 Basen von der RNA-Polymerase ab.

55 Termination (typisch für Prokaryoten) entweder Rhounabhängig durch Terminator RNA-Polymerase Rho Terminator oder Rho-abhängig

56 Typische Prokaryotengene Gen1 Transkribierter Bereich Gen2 Gen3 Promotor ShineDalgarno Kodierender Bereich Terminator Polycistronische mrna

57 Damit ein Gen transkribiert werden kann, braucht es ein Promotor-Element

58 Promotorelemente bei Prokaryoten: Die erste transkribierte Base ist definitionsgemäß die Base +1 bei -10 findet sich die Pribnow -Box bei -35 die TTGAC-Box +1

59 Ganz typisch für regulierte Gene bei Prokaryoten sind die Operons Nach der Operon-Operator Hypothese von Jacob und Monod (Nobelpreis1965) sind Operons sind zusammengefasste, gemeinsam regulierte und gemeinsam transkribierte Gene, die für Enzyme kodieren, die gemeinsam an einem Stoffwechselprozess beteiligt sind und die damit zum gleichen Zeitpunkt in der Zelle benötigt werden.

60 Nobelpreis 1965 Jacob Lwoff Monod

61 Verschiedene Regulationsmodelle

62 Beispiel: das Lac-Operon bei Escherichia coli Im Lac-Operon sind Gene zusammengefasst, die für Enzyme des Lactose-Abbaus/- transports notwendig sind Diese Gene werden gemeinsam als eine polycistronische mrna transkribiert und durch einen Operator gemeinsam reguliert

63 Lac-Operon, stark vereinfacht

64 Die wichtigste Funktion: Spaltung der Lactose in Galactose und Glucose

65 Gen für Lac-Repressor Lac(tose)-Operon Ohne Lactose bindet der Repressor an den Operator und verhindert die Transkription Lac-Repressor

66 Ist Lactose (bzw. Allolactose) als Induktor vorhanden, bindet dieser an den Lac-Repressor und verändert dessen DNA-Binde-Eigenschaft so, dass sich der Repressor von der DNA löst und die Lac-Gene zur Transkription freigibt

67 Der eigentliche Induktor ist Allolactose

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69 Die Aktivität des Lac-Operons wird aber nicht nur durch Lactose, sondern auch durch Glucose gesteuert : Ist Glucose ausreichend im Medium vorhanden, werden die Lac-Gene nur schwach transkribiert. Dies macht Sinn, denn Glucose ist für das Bakterium eine sehr viel günstigere Kohlenstoffquelle als Lactose. Wie funktioniert das?

70 Die Steuerung der Transkriptionsrate erfolgt über den camp- Spiegel, der wiederum von der Glucosekonzentration abhängig ist. Es gilt: Hoher Glucosespiegel niedrige camp Konzentration Niedriger Glucosespiegel hohe camp Konzentration denin

71 camp bindet an ein Aktivator-Protein, das CAP (Catabolic activator protein), camp-cap aktiviert (positiv!) die Transkription

72 Zusammenfassung

73 Die Struktur des Lac-Repressor

74 Nur für Interessierte: Die Struktur der Lac- Repressions-schleife Die Unterdrückung der Transkription erfolgt durch Erzeugung einer raffinierten Sekundärstruktur, der Repressionschleife. Zwei Repressordimere binden symmetrisch vor und hinter der Promotorregion und zwingen damit die Promotor-DNA in ein geschlossene Schleife (blau), so dass die RNA-Polymerase keine Chance für eine Transkription hat.

75 Struktur des Tryptophan-Operons Aus Hartl und Jones, Genetics

76 Tryptophan -Operon Beispiel für negative Rückkopplung: Die Transkription der Strukturgene für die Tryptophansynthese wird durch die Tryptophankonzentration gesteuert. Das Regulatorprotein liegt als inaktiver Aporepressor vor. Erst durch Bindung von Tryptophan wird aus dem inaktiven Aporepressor der aktive Repressor, der an den Operator bindet und die Transkription stoppt

77 Unabhängig von der Steuerung durch Aporepressor/Repressor hat das Tryptophan-Operon einen weiteren Steuerungsmechanismus, die Attenuation. Die Attenuation (Verringerung) ist eine Art Feinregulation, mithilfe derer die Synthese der Trp-RNAs verringert werden kann, ohne das Trp-Operon ganz abzuschalten. Der Mechanismus ist ein faszinierendes Beispiel dafür, welche raffinierten Möglichkeiten die Natur nutzt, um Organismen den optimalen Umgang mit ihren Ressourcen zu erlauben.

78 Bei hoher Trp-Konzentration finden sich besonders viele Leader-RNA-Moleküle

79 Feinstruktur der Leader-Region des Trp- Operons Aus Hartl und Jones, Genetics

80 Mechanismus der Attenuation im Trp- Operon Terminator Aus Hartl und Jones, Genetics

81 Termination durch hohe Tryptophankonzentration

82 Nur für Interessierte Termination/Antitermination bei Lambda

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