AGES-Webribo. Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping. Alexander Indra

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "AGES-Webribo. Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping. Alexander Indra"

Valentin Ursler
vor 7 Jahren
Abrufe

1 AGES-Webribo Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping Alexander Indra AGES-Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien Nationale Referenzzentrale für Clostridium difficile

medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien

2 Clostridium difficile Clostridium difficile ist auch in Österreich ein bedeutender nosokomialer Erreger im Jahr 2003 wurden 777 Fälle registriert 53 davon mit tödlichem Ausgang Im Jahr 2010 wurden von Spitälern Clostridium-difficile-Infektionen gemeldet 181 davon mit tödlichem Ausgang Das ist nur die Spitze des Eisbergs! AGES-Webribo 2

Ausgang Im Jahr 2010 wurden von Spitälern 2.

3 Clostridium-difficile-Diagnostik in der österreichischen Referenzzentrale C. difficile Antigen Nachweis aus Stuhlproben C. difficile Toxinnachweis aus Stuhl (Tox A/B) C. difficile Kulturdiagnostik direkte Anzucht Flüssig-Anreicherung mit Alkoholschock Resistenztestung mittels E-Test Molekularbiologischer Nachweis von tcda, tcdb, tcdc-deletionen, cdta und cdtb PCR-Ribotyping mittels Kapillar-Gel-Elektrophorese Im Bedarfsfall MLVA-Typisierung zur Subtypisierung im Ausbruchsfall tcdc Sequenzierung AGES-Webribo 3

difficile Kulturdiagnostik direkte Anzucht Flüssig-Anreicherung mit Alkoholschock Resistenztestung mittels E-Test

4 PCR-Ribotyping AGES-Webribo 4

5 PCR-Ribotyping im Clostridium-difficile-Genom befinden sich bis zu 15 Kopien des ribosomalen RNA-Operons in diesem Operon finden sich Gene für 16s, 23s und 5s RNA die Gene der 5s, 16s und 23s-RNA sind durch kurze DNA- Abschnitte, die Intergenic-Spacer-Regions (ISR), getrennt die Abschnitte zwischen 16s und 23s können unterschiedlich lang sein (zw. 200 und 650bp) durch PCR-Amplifikation der 16s-23s-ISR und die Bestimmung der Fragmentlängen ist eine Typisierung möglich AGES-Webribo 5

Intergenic-Spacer-Regions (ISR), getrennt die Abschnitte zwischen 16s und 23s können unterschiedlich lang sein (zw.

6 PCR-Ribotyping AGES-Webribo 6

7 PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter Verantwortlich für die für die Unterschiede zwischen verschiednenen PCR Ribotypen sind 9bp langer Repeat im ISR Dieser Repeat trennt 33 bp 53 bp lange variable DNA Sequenzen Innerhalb einiger ISR findet man auch eine 172 bp lange spacer sequence die eine trna-ala codiert Dies ist zeigt eine eine hoch strukturierte Organisation des 16S 23S ISR von C. difficile AGES-Webribo 7 7

Sequenzen Innerhalb einiger ISR findet man auch eine 172 bp lange spacer sequence die eine trna-ala

8 PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter slipped-strand mispairing Homologe intra-chromosomal Rekombination Homologe inter-chromosomal Rekombination? 182 bp ISRstart-v1 IB 0 bp IB ISRend-v2 215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v4 215 bp ISRstart-v2 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1 215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1 214 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v5 215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1 215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v6 215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1 375 bp ISRstart-v4 172 bp v1 IB 33 bp v5 IB ISRend-v1 259 bp ISRstart-v5 IB 33 bp v11 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3 277 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v14 IB 53 bp v1 IB ISRend-v1 277 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v3 IB 33 bp v1 IB ISRend-v1 277 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v4 IB 33 bp v1 IB ISRend-v1 279 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v5 IB 33 bp v4 IB ISRend-v3 276 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v1 IB 33 bp v5 IB ISRend-v5 277 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v1 IB 33 bp v5 IB ISRend-v1 498 bp ISRstart-v4 171 bp v1 IB 53 bp v7 IB 53 bp v6 IB-T:C 33 bp v6 IB ISRend-v1 318 bp ISRstart-v1 IB 53 bp v7 IB 33 bp v11 IB 33 bp v7 IB ISRend-v5 500 bp ISRstart-v4 172 bp v1 IB 53 bp v7 IB 53 bp v6 IB 33 bp v8 IB ISRend-v7 321 bp ISRstart-v1 IB 53bp v8 IB 33 bp v12 IB 33 bp v9 IB ISRend-v3 363 bp ISRstart-v1 IB-T:G 53bp v8 IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3 361 bp ISRstart-v1 IB-T:G 53bp v8 IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB-C:T 33 bp v10 IB ISRend-v8 319 bp ISRstart-v1 IB-T:G 53bp v9 IB 33 bp v13 IB 33 bp v10 IB ISRend-v9 397 bp ISRstart-v4 172 bp v2 IB 53 bp v2 IB ISRend-v3 Indra & Blaschitz et al.2010 AGES-Webribo 8 8

v3 IB ISRend-v5 215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1 215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v6 215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1 375 bp ISRstart-v4 172 bp v1 IB 33 bp v5 IB

9 PCR-Ribotyping ist derzeit die wichtigste Methode zur Clostridium-difficile-Typisierung derzeit sind mehr als 250 PCR-Ribotypen in der Referenzzentrale in Wales bekannt weltweit die wichtigsten PCR-Ribotypen sind 001, 014, 017,078 und 027 neben dem ersten Nachweis eines Ribotyps 027 in Österreich konnten auch ca. 350 verschiedene Ribotypen bestimmt werden AGES-Webribo 9

die wichtigsten PCR-Ribotypen sind 001, 014, 017,078 und 027 neben dem ersten Nachweis eines

10 konventionelles PCR-Ribotyping: Probleme problematischer Datenaustausch keine einheitliche Nomenklatur schwer zu beeinflussende Laufbedingungen beeinflussen die Analyse DNA Konzentration verwendete Agarose Temperatur Spannung schwierige Interpretation von Bandenmustern z.b. PCR-Ribotyp 066 in Literatur mit Toxinotyp V und VI beschrieben AGES-Webribo 10

Analyse DNA Konzentration verwendete Agarose Temperatur Spannung schwierige

11 PCR-Ribotyping Ribotyping PCR-Ribotyping Probe 118 Probe 195 Probe 124 Probe 182 Probe 32 Probe 41 Probe 160 Probe 104 Probe 350 Probe 143 Probe 100 Probe 129 Probe 342 Probe 349 Probe 212 Probe 112 Probe 156 Probe 123 Probe 132 Probe 101 Probe 159 Probe 201 Probe 202 Probe 30 Probe 40 AGES-Webribo AI AI-14 AI-29 AI-23 AI-50 AI AI AI-20 AI-27 AI

Probe 156 Probe 123 Probe 132 Probe 101 Probe 159 Probe 201 Probe 202 Probe 30 Probe 40 AGES-Webribo 11 053

12 konventionelles PCR-Ribotyping was muss verbessert werden? Vergleichbarkeit von Ergebnissen Datenzuverlässigkeit jedes Labor produziert vergleichbare Daten eine Datenbank zur Dateninterpretation» Unabhängigkeit von Stammsammlungen einheitliche Nomenklatur AGES-Webribo 12

produziert vergleichbare Daten eine Datenbank zur

13 AGES-Webribo 13

14 Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping AGES-Webribo 14

15 Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping hohe Reproduzierbarkeit durch Verwendung eines Flureszenz markierten Primers eines vorgegebenen Größenstandards, der gleichzeitig mit jeder Probe mitläuft reproduzierbare Laufbedingungen höherer Proben-Durchsatz bei niedrigeren Kosten Vergleichbarkeit der Ergebnisse einfache Datenanalyse höhere Diskreminationsfähigkeit Fragmente mit 1.5 Basen Abstand und mehr können unterschieden werden AGES-Webribo 15

Laufbedingungen höherer Proben-Durchsatz bei niedrigeren Kosten Vergleichbarkeit der Ergebnisse einfache

16 Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Diskreminationsfähigkeit 6 verschiedene 014 Subtypen AGES-Webribo 16

17 Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping AGES-Webribo 17

18 Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Reproduzierbarkeit AGES-Webribo 18

19 AGES-WEBRIBO AGES-Webribo ist eine kostenlose Web-Datenbank zur Interpretation von Clostridium-difficile-Typisierungsergebnissen, die mittels Kapillar- Gel-Elektrophorese basierenden PCR-Ribotyping gewonnen wurden Die Fragmentlängen und die dazugehörenden Peakhöhen der Proben können direkt durch AGES-WEBRIBO oder mittels GENESCANNER-, GENEMAPPER- oder PEAKSCANNER-Software bestimmt werden Der Datenimport erfolgt mittels FSA, CSV- oder Excel-Files AGES-Webribo 19

gewonnen wurden Die Fragmentlängen und die dazugehörenden Peakhöhen der Proben können direkt durch AGES-WEBRIBO oder

20 AGES-WEBRIBO Aufgrund vorgegebener Analysekriterien wird ein Qualitätscheck der Ergebnisse durch die AGES-Webribo-Software durchgeführt z.b. eine maximal erlaubte Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von Split-peaks Eine minimale Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von Pull-Ups Ergebnisse werden sofort als versandt Informationen zu jedem PCR-Ribotyp sind online verfügbar neue PCR-Ribotypen müssen durch erneute Analyse bestätigt werden AGES-Webribo 20

ibo-Software durchgeführt z.b. eine maximal erlaubte Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von Split-peaks Eine

21 AGES-WEBRIBO AGES-WEBRIBO verwendet einen neu entwickelten Algorithmus zum Vergleich von neuen Proben mit der Datenbank dies erlaubt den Vergleich von Daten unabhängig von Größenstandard dieser muss den Analysebereich ( Basen) umfassen Sequencer jedweder Kapillarlänge der verwendeten Gele Primer AGES-Webribo 21

22 AGES-Webribo 22

23 AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien 52 Ausbruchsfälle werden identifiziert 38 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle allein im Spital HX 9 von 10 Pavillons des Spitals sind betroffen alleine 25 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle in einem der 9 die 14 anderen Fälle traten in 4 weiteren Wiener Spitälern auf alle 14 waren eindeutig mit dem Spital HX assoziiert ONE CASE THE INDEX CASE Nov Dec Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug AGES-Webribo 23

24 AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien zwischen März und August wurden 720 Proben allein aus Wiener Spitälern an die Referenzzentrale übersandt insgesamt wurden 1320 C.-difficile-Proben in dieser Zeit untersucht 1042 C.-difficile-Proben konnten angezüchtet werden die Typisierung erfolgte mittels Capillar Gel Electrophorese PCRribotying in Kombination mit AGES-WEBRIBO 152 unterschiedliche PCR-Ribotypen wurden identifiziert alle 52 PCR-Ribotype-027-Proben wurden auch MLVA-typisiert die Arbeit wurde von nur 2 Teilzeit-BMAs zusätzlich zur weiteren Routinearbeit durchgeführt die durchschnittliche Zeit bis zum Befund betrug 6 Tage AGES-Webribo 24

25 Die häufigsten Ribotypen in Österreich 2011 AGES-Webribo 25

26 AGES-Webribo 26

27 Das Team Fr. BMA. Hasenberger Fr. BMA. Kunczer Fr. BMA. Herold Fr. BMA Fiedler Hr. Dr. Hufnagl Fr. Mag. Pecavar Fr. Dr. Blaschitz Fr. Dr. Huhulescu AGES-Webribo 27

28 AGES-Webribo 28

Ähnliche Dokumente

Diagnostik von CDI Verlässlichkeit kommerzieller Tests und sinnvolle Algorithmen

Diagnostik von CDI Verlässlichkeit kommerzieller Tests und sinnvolle Algorithmen Athanasios Makristathis Klinische Abteilung für Mikrobiologie Klinisches Institut für Labormedizin 1 Pathogenetische Aspekte