Gliederung. Wofür Fluoreszenzmikroskopie? Geschichtliches. Fluoreszenz: Drei Mechanismen. Das Fluoreszenzmikroskop. LED-Auflichtfluoreszenz (LED-AFL)

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1 Gliederung Wofür Fluoreszenzmikroskopie? Geschichtliches Fluoreszenz: Drei Mechanismen Das Fluoreszenzmikroskop LED-Auflichtfluoreszenz (LED-AFL) Beispiele

2 Fluoreszenzmikroskopie? Hellfeldmikroskop: Beobachtet wird alles Anfärbung: Eine Stufe spezifischer Phasenkontrast: Auch volles Feld Beobachtung nur ganz bestimmter Eigenschaften? Lösung: Gezielt anfärben, sehr spezifisch detektieren!

3 Geschichtliches 1852: Entdeckung der Fluoreszenz Anfang 20. Jahrhundert: Erste Anwendung in der Mikroskopie FL-Mikroskope: komplex, schwer bedienbar, teuer Ab 1960: Xe-/Hg-Hochdrucklampen, spezifische Filtersysteme, Fluorochrome Aktuell: Innovationsschub durch LEDs als Lichtquellen

4 Fluoreszenz 1852: Phänomen Fluoreszenz (Sir George Gabriel Stokes ( )) Quelle:

5 Fluoreszenz: Mechanismen Primärfluoreszenz (Eigenfluoreszenz) Pollen (365 nm)

6 Fluoreszenz: Mechanismen Sekundärfluoreszenz (Fluorochrome) Hefen (Mykoval)

7 Fluoreszenz: Mechanismen Immunfluoreszenz Kokken (FITC)

8 Fluoreszenz: Mechanismen Vorteile der Fluoreszenzmikroskopie Helle Strukturen auf dunklem Hintergrund Charakteristische Fluoreszenzfarben

9 Fluoreszenz: Mechanismen Analogie: Astronomie Helle Strukturen auf dunklem Hintergrund Konstellation: Microscopium Charakteristische Emissionsfarben

10 Fluoreszenz: Mechanismen Vorteile der Fluoreszenzmikroskopie Nachweis von Erregern ist eindeutig Einfaches Nachweisverfahren Geeignet für Routine Kein speziell ausgebildetes Personal notwendig

11 Das Fluoreszenzmikroskop Auflichtfluoreszenz ( klassisch )

12 Das Fluoreszenzmikroskop Spektrum HBO-Lampe

13 Das Fluoreszenzmikroskop Filtersatz: Transmissionskurven

14 Das Fluoreszenzmikroskop Klassisches Mikroskop (3) (1) (4) (2) (1) Hg-Höchstdrucklampe (2) Netzteil (3) Lichtsperrung (4) Umschalter Filtersatz

15 Das Fluoreszenzmikroskop Klassisches Mikroskop Hg-Höchstdrucklampe Spez. Lampenhaus, Hochspannung Muß warmlaufen Lebensdauer: 100 h Kosten: ca. 120

16 LED-Auflichtfluoreszenz Vorteile der LED-Fluoreszenz Monochromatisch Geringe Leistungsaufnahme: wenige Watt Keine Wärmestrahlung Verfügbar von Infrarot bis Ultraviolett Lebensdauer > h (bei Nennstrom) Preis: < 100, VIS: < 10

17 LED-Auflichtfluoreszenz Auflichtfluoreszenz, LED-Beleuchtung

18 LED-Auflichtfluoreszenz Spektren LEDs (Luxeon)

19 LED-Auflichtfluoreszenz LED-AFL-Einheit

20 LED-Auflichtfluoreszenz LED-AFL-Einheit: Adaptierung

21 Beispiel: Diagnose von Mykosen Fluorochrom Mykoval (Filtersatz G) Exklusiv für die Helmut Hund GmbH Bindung an Zellulose und Chitin Markierung von Pilzen Einfache Anwendung, jahrelang haltbar Hohe diagnostische Sicherheit: sofortige Einleitung der Therapie möglich Anlage von Kulturen vielfach unnötig

22 Beispiel: Diagnose von Mykosen Anwendungsmöglichkeiten Mykoval Nativpräparate: Haut, Haare, Nägel, Schleimhautabstriche Histologische Präparate, Kombination mit anderen Färbungen Schnelldiagnostik während OPs Körperflüssigkeiten, Stuhl Gynäkologie: Hefebesiedelungen auf Schleimhäuten Mikrosporidien im Stuhl

23 Beispiel: Diagnose von Mykosen Trichphyton rubrum in Hautschuppen Objektiv 10:1 Objektiv 10:1

24 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Schimmelpilze Objektiv 40:1 Objektiv 40:1

25 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Schimmelpilze Probe Innenraum

26 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Differenzierung Zellulosefasern

27 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vergleich Hellfeld - Fluoreszenz

28 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vergleich Hellfeld - Fluoreszenz

29 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vergleich Hellfeld - Fluoreszenz

30 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vergleich Hellfeld - Fluoreszenz

31 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vgl. Hellfeld, Phasenkontrast, Fluoreszenz

32 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vgl. Hellfeld, Phasenkontrast, Fluoreszenz

33 Beispiel: Pilzhyphen, -sporen Vgl. Hellfeld, Phasenkontrast, Fluoreszenz

34 Beispiel: Hefen Färbung: Mykoval (Filtersatz G)

35 Beispiel: Staphylokokken Färbung: FITC (Filtersatz D) E. Coli

36 Beispiel: E. coli Färbung: DAPI (Filtersatz A)

37 Beispiel: Mycobakterien (Tb) Färbung: Auramin + Thiazinrot (Filtersatz D)

38 Beispiel: STED-Mikroskopie STED: Stimulated Emission Depletion Quelle: MPI Biophys. Chemie

39 Beispiel: STED-Mikroskopie STED: Stimulated Emission Depletion Quelle: MPI Biophys. Chemie Menschliche Nervenzelle: Filamente STED: 12-fache Auflösung!

40 Beispiel: FISH FISH: Fluorescence In-Situ Hybridization Chromosomen aus menschl. weibl. Erythrozyten Rot: DNA Grün: Alu-Sequenzen

41 Beispiel: TIRF TIRF: Total Internal Reflection Fluorescence

42 Zusammenfassung Fluoreszenzmikroskopie: Empfindlich, hochspezifisch Mykoval: Färbemittel für Pilze/Hefen Fluoreszenz auf LED-Basis: - einfachste Anwendung - günstige Technologie - geringe Folgekosten