Charakterisierung zweier CPx-Typ ATPasen und deren Zusammenwirken mit anderen Metall-Effluxsystemen in Ralstonia metallidurans

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1 Charakterisierung zweier CPx-Typ ATPasen und deren Zusammenwirken mit anderen Metall-Effluxsystemen in Ralstonia metallidurans Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Antje Legatzki geb. am in Brehna Gutachter: 1. Prof. Dr. D.H. Nies 2. Prof. Dr. C. Rensing 3. Prof. Dr. K. Hantke Halle/Saale, den urn:nbn:de:gbv: [

2 ...I Abkürzungsverzeichnis... V 1. EINLEITUNG MATERIAL UND METHODEN Bakterienstämme und Plasmide Kultivierungsbedingungen Nährmedien und Zusätze für Bakterien Anzucht und Zellernte Stammhaltung Reinheitskontrolle Molekulargenetische Arbeiten mit DNA Isolierung von DNA Isolation von Gesamt-DNA nach Marmur Mikroplasmidpräparation Plasmidisolation mittels Spin Säulen Plasmidpräparation mittels Anionen-Austauscher-Säulen DNA-Techniken Agarose-Gelelektrophorese DNA-Größenstandard DNA-Konzentrationsbestimmung Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen Reinigung und Konzentrierung von DNA Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen Ligation von DNA-Fragmenten Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Auswahl der Primer Standard Polymerase-Ketten-Reaktion Reinigung von PCR-Produkten DNA-Transfer und Selektion rekombinanter Klone Transformation nach der CaCl 2 -Methode Selektion rekombinanter E. coli-klone Plasmidtransfer durch Konjugation Selektion von Rekombinanten und Doppelaustausch-Rekombinanten DNA-Sequenzierung Sequenzierung unter Verwendung des drhodamine Termination Cycle Sequencing-Kits Das Sequenziergel Auswertung der Sequenzdaten Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung I

3 Herstellung der Sonden Digoxigenin-markierte Längenstandards DNA:DNA-Hybridisierung Gelelektrophorese und DNA-Blotting Hybridisierung Chemilumineszenz-Nachweis Zellwachstumsversuche Wachstumsversuche in Flüssigmedien Messung der Zelltrübung Zellanzucht von E. coli-stämmen in Wachstumsversuchen Zellanzucht von R. metallidurans-stämmen in Wachstumsversuchen Ermittlung der Minimalen Inhibitor Konzentration (MIC) gegen Schwermetallionen Bestimmung der β-galaktosidase-aktivität Proteinbiochemische Methoden Protein-Expression und Reinigung über das Strep-tag II Protein Purification System Zellanzucht, Induktion der Expression und Zellernte Zellaufschluss und Gewinnung von Rohextrakt Native Proteinreinigung mittels StrepTactin-Chromatographie Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen Proteinbestimmung von Membranproteinen BCA-Test Bradford-Proteinbestimmung Konzentrieren von Proteinlösungen TCA-Fällung Konzentrieren und Umpuffern von Proteinlösungen Elektrophoretische Methoden Probenvorbereitung Proteinmarker Lineare SDS-PAGE Gradienten-SDS-PAGE Saure SDS-PAGE-Gelelektrophorese bei ph Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf eine Membran (Westernblot) Proteinnachweis durch Doppelimmunpräzipitation auf PVDF-Membranen Strep-tag II Detektionssystem Färbung und Trocknung von SDS-Polyacrylamid-Gelen Unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie-Blau Silberfärbung Trocknung von Polyacrylamid-Gelen Phosphorylierungsversuche mit [γ 32 P]-ATP Zellanzucht und Membranpräparation Phosphorylierungsassay mit [γ 32 P]-ATP In vitro Bindung von Proteinen an Metall-Chelat-Sepharose In vivo Vernetzungsexperimente mit Formaldehyd Transportstudien mit radioaktiven Metallisotopen Aufnahmeexperimente an E. coli-zellen mit radioaktiven Metallen II

4 Aufnahme radioaktiver Metalle durch R. metallidurans ERGEBNISSE Heterologe Expression der CPx-Typ ATPasen znta und cada aus Ralstonia metallidurans in Escherichia coli ZntA und CadA vermitteln im metallsensitiven E. coli-stamm GG48 Resistenz gegenüber Zink und Cadmium Die durch ZntA bzw. CadA vermittelte Schwermetallresistenz in E. coli beruht auf verminderter Akkumulation Funktionen von ZntA und CadA in R. metallidurans AE Die Deletion von znta und cada führen zu erhöhter Zink- und Cadmiumsensitivität in R. metallidurans AE Die znta/cada-doppelmutante zeichnet sich durch erhöhte Cadmium- Akkumulation aus Induktionsuntersuchungen von znta und cada mit Hilfe einer β-galaktosidase- Transkriptionsfusion Das Gen znta ist durch geringe Zink- und Cadmiumkonzentrationen induzierbar Das Gen cada ist durch Cadmium und bei Deletion von znta auch durch Zink induzierbar Induzierbarkeit von znta und cada durch andere Schwermetallionen Untersuchungen von einem putativen Regulator stromaufwärts von cada Die Rolle von ZntA und CadA in der Zink- bzw. Cadmiumresistenz in Beziehung zu anderen Effluxsystemen Die Effluxtransporter CzcCBA und CzcD sind in trans nicht in der Lage die Cadmiumsensitivität der znta/cada-doppelmutante vollständig zu komplementieren Einfluss von CzcCBA und CzcD auf die Induzierbarkeit von znta und cada durch Zink oder Cadmium Einfluss von pmol30 auf die Induzierbarkeit von znta und cada Biochemische Charakterisierung der CPx-Typ ATPasen ZntA und CadA aus R. metallidurans Reinigung von ZntA und CadA als Strep-tag II -Fusion aus E. coli Bindung von Schwermetallionen an ZntA und CadA [γ 32 P]-ATP-Markierung von ZntA bzw. CadA Untersuchungen am CzcCBA-Transportsystem in R. metallidurans Reinigung von CzcA als Strep-tag II -Fusion aus R. metallidurans In vivo Vernetzungsexperimente in R. metallidurans führen zum Nachweis der Interaktion zwischen CzcA und CzcB DISKUSSION CPx-Typ ATPasen ZntA Rm und CadA Rm aus R. metallidurans Expression von znta Rm oder cada Rm in metallsensitiven Stämmen von E. coli Die Substratspezifität von ZntA Rm oder CadA Rm in R. metallidurans Zusammenspiel von Zn(II)/Cd(II)-Effluxsystemen aus R. metallidurans CH III

5 Biochemische Untersuchungen zur Schwermetall-Bindung und Phosphorylierung von ZntA Rm und CadA Rm Der RND-Proteinkomplex CzcCBA Ausblick ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS Anhang IV

6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A/a Abb. ABC-Transporter AHT AK amp APS AS ATP ATPase bidest bp BPB BSA bzw. C/c ca CDF cm cpm CSPD CTAB C-Terminus d.h. DIG DMF DMSO DNA DNase ddntp dntp DSG DSP ECF ECL EDTA Adenin Abbildung ATP-binding cassette-transporter Anhydrotetracyclin Antikörper Ampicillin Ammoniumpersulfat Aminosäure Adenosintriphosphat Adenosintriphosphatase doppelt destiliert (Reinstwasser) Basenpaare Bromphenolblau Rinderserumalbumin beziehungsweise Cytosin circa cation diffusion facilitator (Proteinfamilie) Chloramphenicol counts per million Disodium3-(4-methoxyspiro-{1,2-dioxetane-3,2 -(5 -chloro) tricyclo [ ,7] decan}-4-yl) phenyl phosphate Cetyltrimethylammoniumbromid Carboxyterminus das heißt Digoxigenin Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonuklease didesoxy-nukleosidtriphosphat desoxy-nukleosidtriphosphat Disuccinimidylglutarat Dithiobis-(succinimidylpropionat) (auch Lomant s Reagenz genannt) extracellular function enhanced chemiluminescence Ethylendiamintetraacetat V

7 Abkürzungsverzeichnis G/g GFP h HABA IPTG kan kb kda KE LB M MFP MIC min ml mrna MW N NRAMP nt N-Terminus NA NB OD OMF ONPG ORF PAGE PCR pers. PMSF PVDF RBS Rm RNA RNase RND rpm RT Guanin Grün-fluoreszierendes Protein Stunde 4-Hydroxylbenzen-2-carboxylic acid Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid Kanamycin Kilobasenpaare Kilodalton Klett-Einheiten Luria-Bertani-Medium Molarität membrane fusion protein (Proteinfamilie) Minimale Inhibitor Konzentration Minute Milliliter messenger RNA Molekulargewicht Normalität natural-resistance-associated macrophage protein Nukleotide Aminoterminus Nähragar Nährbouillon optische Dichte outer membrane factor (Proteinfamilie) ortho-nitrophenyl-β-d-galactopyranosid open reading frame (offener Leserahmen) Polyacrylamid-Gelelektrophorese polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) persönlich Phenylmethylsulfonylfluorid (Protease-Inhibitor) Polyvinylidendifluorid (Membran) Ribosomenbindestelle Ralstonia metallidurans Ribonukleinsäure Ribonuklease resistance, nodulation, cell division (Proteinfamilie) rotations per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur VI

8 Abkürzungsverzeichnis s SDS spez. T/t Tab. TAE TB TCA TEMED tet TG TMH Tris U u.a. UV Vers. VIS Vol v/v w/v X-Gal ZIP z.b. Sekunde Natriumdodecylsulfat spezifisch Thymin Tabelle Tris-Acetat/EDTA terrific broth (Nährmedium) Trichloressigsäure N, N, N, N -Tetramethylethylendiamin Tetracyclin Trockengewicht Transmembrane Helix Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan Unit (Einheit der Enzymaktivität) unter anderem ultraviolett Version visible (sichtbares Licht) Volumen Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid ZRT, IRT-ähnliche Proteine zum Beispiel Ein- und Drei-Buchstaben-Code der Aminosäuren A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin VII