Zur Bedeutung der Aminosäure Histidin für den Verlauf der Intoxikation des Cytotoxins aus Pseudomonas aeruginosa, insbesondere der Oligomerisation

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1 Zur Bedeutung der Aminosäure Histidin für den Verlauf der Intoxikation des Cytotoxins aus Pseudomonas aeruginosa, insbesondere der Oligomerisation Marita Elisabeth Langewische

2 INHALTSVERZEICHNIS Seite Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen Verzeichnis der Abkürzungen VII X XI EINLEITUNG 1.1 Pseudomonas aeruginosa Human- und veterinärmedizinische Relevanz von Pseudomonas aeruginosa CTX aus Pseudomonas aeruginosa Intoxikation mit CTX aus Pseudomonas aeruginosa Porenbildende cytolytische'bakterielle Toxine Aufgabenstellung? Die Aminosäuren Arginin, Histidin, Leucin und Prolin. Bedeutung für die Eigenschaften von Proteinen im Hinblick auf diese Arbeit 9 2 MATERIALIEN UND VERSUCHSTIERE n 2.1 Chemische Materialien Biologische Materialien Aminosäuren Bakterienstämme Plasmide Enzyme, Restriktionsendonukleasen, DNA-Marker CTX und immunologische Reagenzien Nährmedien, Nährmedienkomponenten und häufig verwendete Puffer Kommerzielle Kits Proteinstandards Sonstiges Geräte 22 I

3 2.5 Computerprogramme Versuchstiere 25 3 METHODEN 26 I. Allgemeine und proteinbiochemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) Herstellung von Gradientengelen Herstellung von Gelen mit 12 % oder 18 % Acrylamid Probenvorbereitung und Durchführung der Elektrophorese Proteinfärbung von Gelen nach SDS-PAGE Bestimmung der molekularen Massen Trocknung der Gele Präparation von Rattenerythrozytenmembranen Quantitative Gesamt-Proteinbestimmungen und Proteinfällung Membranproteinbestimmung Proteinbestimmung nach Lowry et al Semiquantitative Proteinbestimmung mit dem ImageMaster Elite 1D Proteinfällung mit Ammoniumsulfat Verdau von bakteriellen Zellbestandteilen ammoniumsulfatgefa'llter Proteine durch Trypsin Granulozytenschwelltest Markierung des Nativ-CTX mit I25 I Membranbindungsstudien Western-Immunoblotting Proteindetektion Ponceau S-Färbung Detektioiynittels Enhanced Chemo Luminescence (ECL) Messung von DECP-modifiziertem Nativ-CTX und DEPC-modifizierten Aminosäuren im UV-Spektrophotometer Prüfung von Nativ-CTX und seinen Mutanten auf Oligomerisation Hemmung der Oligomerisation von Nativ-CTX durch DEPC 45

4 Einsatz von DL-Histidin, L-Histidin, L-Cystein und L-Lysin zur Verifizierung der Bindung von DEPC an die Aminosäure Histidin Hemmung des DEPC durch DL-Histidin an Rattenerythrozytenmembranen Vergleichende Analyse der Wellenlängenspektren von DEPC-modifiziertem L-Cystein, L-Histidin und L-Lysin Aufhebung der DEPC-bedingten Hemmung der Oligomerisation durch Hydroxylamin-Hydrochlorid Dialyse von modifiziertem Nativ-CTX 49 II. Molekularbiologische Methoden Expression des ctx-genes in E. coli HB101 und Epicurian coli XLl-Blue superkompetenten Zellen Expression des ctt-genes zur Herstellung von Procytotoxin in E. coli HB Expression der Histidin-Punktmutanten in Epicurian coli XLl-Blue superkompetenten Zellen Aktivierung des Protoxins von CTX und der Histidin-Mutanten durch Trypsin Trypsinierung des gewonnenen psn3-proctx (ohne Reinigung) Trypsinierung der Pro-Histidin-Mutanten (nach Reinigung) Präparation von Nährmedien und Agarplatten Präparation von TSB-Medium und TSB-Ampicillin-Medium, TSA-Agarplatten und TSA-Ampicillin-Agarplatten Präparation von LB-Medium, LB-Ampicillin-Medium, LB-Agarplatten und LB-Ampicillin- Agarplatten Herstellung von LB-Ampicillin-Platten mit IPTG und X-Gal Zusatz Analytische Agarose-Gelelektrophorese Microquick-Plasmid-Präparation Plasmid-Transformationsreaktionen Herstellung transformationskompetenter E. coli HBIOI-Zellen mittels der CaCh-Metholie und Plasmidtransformation Plasmid-Transformation in Epicurian coli XLl-Blue superkompetente Zellen Restriktionsverdau Plasmid-Präparation mittels Qiagen 100-Säulen 58 III

5 3.18 Herstellung von Glycerolstocks zur Aufbewahrung transformierter Bakterienstämme Photometrische DNA-Gehaltsbestimmung Zielgerichtete Mutagenese mit dem QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit" mittels PCR Auswahl der Mutagenese-Primer Mutagenese-PCR Restriktionsverdau des nichtmutierten, methylierten Ausgangstemplates Plasmid-Transformation in Epicurian coli XLl-Blue superkompetente Zellen nach Dpnl-Verdau des Mutagenese-PCR-Reaktionsansatzes DNA-Sequenzierung Auswahl der Sequenzierprimer Sequenzierung mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" Sequenzierung mit dem BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" /. 67 // DNA-Alignment mit den Computerprogrammen EditSeq und MegAlign 68 4 ERGEBNISSE Hemmung der Oligomerisation durch DEPC UV-Spektrophotometrie Aufhebung der Blockade des Histidins durch Hydroxylamin-Hydrochlorid Fehlende Befähigung von Procytotoxin zur Oligomerisation Procytotoxin aus E. coli HB101 - SDS-PAGE Analyse des trypsinierten psn3-ctx Pentamers und seiner molekularen Masse Vergleich der Monomerbanden von psn3-proctx, psn3-ctx und Nativ-CTX Einfluß von Solubilisationstemperatur und Trypsinverdau auf die Stabilität von Rattenerythrozytenmembranen und psn3-ctx-pentamer Histidin-Punktmutanten Erstellte Histidin-Punktmutanten Analyse der Histidin-Mutanten 84 IV

6 4.6.1 Sekundärstrukturvorhersagen des Protein Predict Servers (EMBL, Heidelberg) der erstellten Histidin-Mutanten auf Aminosäureebene Monomerexpression der Histidin-Mutanten Histidin-Mutanten nach Reinigung mit Ammoniumsulfat und vor der Aktivierung durch Trypsin Darstellung der Mutanten-Monomere nach Reinigung mit Ammoniumsulfat und nach Aktivierung durch Trypsin in der SDS-PAGE Histidin-Mutanten Protein Anreicherung und Bestimmung im ImageMaster Darstellung der Mutanten-Monomere nach Reinigung mit Ammoniumsulfat und nach Trypsinierung im Western-Immunoblot Bestimmung der molekularen Massen der Monomere von psn3-proctx und der Histidin-Mutanten Monomere in trypsinierter und untrypsinierter Form Funktionsstudien der Histidin-Mutanten Bindungsaktivität der Histidin-Mutanten in Bindungsstudien bei Präsenz von 125 I-Nativ-CTX / Oligomerisation der Histidin-Mutanten in der SDS-PAGE und im Western- Immunoblot Bestimmung der molekularen Masse des Pentamers von psn3-ctx und der Histidin-Mutanten Angreifbarkeit der Histidin-Mutanten Toxine durch Proteasen Granulozytenschwelltest Vergleichende Darstellung der Ergebnisse der Funktionsstudien DISKUSSION Diskussion der eingesetzten Methoden Gentechnische Erstellung der Histidin-Mutanten Proteinbestimmung und Bestimmung der molekularen Massen durch SDS-PAGE im ImageMaster Bindungsstudien und Granulozytenschwelltest Bindung, Oligomerisation und cytotoxische Aktivität der Histidin-Mutanten des CTX 116

7 5.3 Charakteristika der Histidine im ccc-genprodukt aus Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zu einigen ausgewählten Histidinen anderer bakterieller Porenbildner Histidine bei Thiol-aktivierten Toxinen Histidine bei AB-Toxinen Histidine bei den ß-Faltblatt formenden porenbildenden Toxinen (ß-CFT) Sind auch Tryptophane für die Intoxikation von Bedeutung? ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATUR ANHANG Verzeichnis der Primersequenzen Nukleotidsequenz des ctt-inserts von psn3 mit allen 6 Leserahmen Multialignment von Pneumolysin und den Toxinvorstufen von Perfringolysin O, Streptolysin O, Listeriolysin und Cytotoxin Multialignment der Toxinvorstufen von Pertussis-Toxin Subunits 2 und 3, Aerolysin, a-hämolysin und Cytotoxin 156 VI