Inhaltsverzeichnis... I. Abkürzungsverzeichnis... V. 1. Einleitung Material und Methoden Stämme und Plasmide...9

Transkript

1 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I Abkürzungsverzeichnis... V 1. Einleitung Material und Methoden Stämme und Plasmide Kultivierung von Bakterien Vollmedien für E. coli Nährmedium für E. acidaminophilum Medienzusätze Zellanzucht Messung des Bakterienwachstums Lagerung von Bakterienkulturen In-vivo-Markierung mit [ 75 Se]-Selenit Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung von Gesamt-DNA aus E. acidaminophilum (SAITO und MIURA, 1963, mod.) Isolierung chromosomaler DNA aus E. coli Isolierung von Plasmid-DNA Minipräparation von Plasmid-DNA aus E. coli (BIRNBOIM und DOLY, 1979) Plasmidisolation mit dem E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I (Peqlab, Erlangen) Midipräparation von Plasmid-DNA aus E. coli Isolierung von RNA In-vitro-Synthese von RNA (WYATT et al., 1991) Standard-Techniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren Phenol/Chloroform-Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren Auftrennung von Nukleinsäuren Agarose-Gelelektrophorese von DNA Denaturierende Agarose-Gelelektrophorese von RNA Elektrophorese von RNA in Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen Größenbestimmung von Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA Gewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen Reinigung von PCR-Produkten Spaltung von DNA...21

2 Inhaltsverzeichnis II Dephosphorylierung von DNA Ligation Radioaktive Markierung von RNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zielgerichtete Mutagenese Übertragung von DNA in E. coli Herstellung kompetenter Zellen Elektroporation Hybridisierung von Nukleinsäuren Herstellung DIG-markierter Sonden DNA-Hybridisierung nach SOUTHERN (1975) Northern-Hybridisierung Koloniehybridisierung Methoden zur DNA-Analyse DNA-Sequenzierung am A.L.F. TM -Sequencer DNA-Sequenzierung am ABI-Sequencer Auswertung von Sequenzdaten Methoden zur RNA-Analyse Bestimmung des Startpunktes der Transkription mittels primer extension Reverse Transkription (RT-PCR) Proteinchemische Methoden Bestimmung der Proteinkonzentration (BRADFORD, 1976) Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Coomassie-Färbung von Proteinen Trocknen von Polyacrylamid-Gelen Einengen und Umpuffern von Proteinlösungen Transfer von Proteinen auf Membranen Antikörpernachweis von Proteinen Strep-tag II-Fusionsproteine Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine Heterologe Expression von Proteinen His-tag-Fusionsproteine Zellanzucht, Induktion der Expression und Zellernte rapid screening von Expressionskulturen Zellaufschluss und Gewinnung von Rohextrakt im präparativen Maßstab Native Reinigung Strep-tag II-Fusionsproteine Zellanzucht, Induktion der Expression und Zellernte...33

3 Inhaltsverzeichnis III Zellaufschluss und Gewinnung von Rohextrakt Native Reinigung Entfernung des Strep-tag II Bestimmung der Formiat-Dehydrogenase-Aktivität in Rohextrakten Herstellung von Rohextrakten Aktivitätsbestimmung Bestimmung der b-galactosidase-aktivität Zellanzucht Aktivitäts-Bestimmung (MILLER, 1992, mod.) Gelretardations-Experimente mit SelB bzw. SelB-Domänen aus E. acidaminophilum Oligonukleotide Geräte und Chemikalien Experimente und Ergebnisse Putative Sekundärstrukturen der Selenoprotein-mRNAs aus E. acidaminophilum Klonierung von sela aus E. acidaminophilum Untersuchungen zur Transkription der sel-gene Analyse der DNA-Sequenz nach Transkriptions- und Translations-Signalen Northern-Hybridisierungen Nachweis eines gemeinsamen Transkripts durch RT-PCR Bestimmung von Transkriptions-Startpunkten mittels primer extension Komplementation von E. coli-mutanten Konstruktion von Plasmiden für Komplementations-Experimente Bestimmung der Aktivität der Formiat-Dehydrogenase H Expression von SelB und SelB-Domänen von E. acidaminophilum in E. coli Expression als His-tag-Fusionsproteine Klonierung in die Expressionsvektoren pqe30 und pt Expression und Reinigung Expression als Strep-tag II-Fusionsproteine Klonierung in die Expressionsvektoren pask-iba5 und pask-iba Expression und Reinigung Gelretardations-Experimente mit SelB und SelB-Domänen aus E. acidaminophilum Synthese von E. acidaminophilum-selenoproteinen in E. coli Heterologe Expression der Gene grdb1, prxu und seld1 in E. coli Konstruktion von Plasmiden zur Coexpression von selb und selc Heterologe Expression von grdb1, prxu und seld1 in Gegenwart von selb und selc aus E. acidaminophilum...76

4 Inhaltsverzeichnis IV Nachweis einer Inkorporation von Selenocystein durch in-vivo-markierung mit 75 Se Einfluss von Mutationen der putativen SECIS-Elemente auf die heterologe Selenoprotein- Synthese Einführung von Mutationen in die postulierten mrna-sekundärstrukturen Inkorporation von Selenocystein in die Produkte der mutierten Gene Die Effizienz der Inkorporation von Selenocystein in die Genprodukte von grdb1, prxu und seld Konstruktion der lacz-fusionen β-galactosidase-aktivitäten der Fusions-Konstrukte Immunologischer Nachweis der Fusionsproteine Nachweis einer Selen-modifizierten trna in E. acidaminophilum Diskussion Organisation und Transkription der sel-gene aus E. acidaminophilum Charakterisierung der Genprodukte von sela, selb und selc aus E. acidaminophilum Selenocystein-Synthase (SelA) Selenocystein-spezifischer Elongationsfaktor (SelB) Selenocystein-spezifische trna Funktionalität der sel-genprodukte aus E. acidaminophilum in E. coli SECIS-Elemente in Selenoprotein-mRNAs aus E. acidaminophilum Heterologe Expression von Selenoproteinen in E. coli Selen-modifizierte trna(s) in E. acidaminophilum Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang...150

5 V Abkürzungsverzeichnis A Adenin A. aeolicus, Aa Aquifex aeolicus Abb. Abbildung AHT Anhydrotetracyclin Amp r Ampicillin-Resistenz AS Aminosäure(n) ATP Adenosin-5 -triphosphat bp Basenpaar(e) BSA Rinderserum-Albumin B. subtilis Bacillus subtilis bzw. beziehungsweise C Cytosin ca. cirka Cam r Chloramphenicol-Resistenz C. difficile, Cd Clostridium difficile cdna komplementäre DNA CIAP calf intestine alkaline phosphatase (Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm) C. jejuni, Cj Campylobacter jejuni cm Zentimeter C. perfringens, Cp Clostridium perfringens cpm counts per minute C. sticklandii Clostridium sticklandii CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid CTP Cytidin-5 -triphosphat Cy5 5-N-N -Diethyltetramethylindodicarbocyanin d Schichtdicke [cm] Da Dalton datp Desoxyadenosin-5 -triphosphat D. baculatum, Db Desulfomicrobium baculatum DC Dünnschicht-Chromatographie DEPC Diethylpyrocarbonat dest. destilliert d. h. das heißt DIG Digoxigenin DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dntp Desoxynukleosid-5 -triphosphat DTT Dithiothreitol dutp Desoxyuridin-5 -triphosphat

6 VI ε molarer Extinktionskoeffizient E. acidaminophilum, Ea Eubacterium acidaminophilum E. aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli, Ec Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EF-Tu Elongationsfaktor Tu EF-1α eukaryotischer Elongationsfaktor 1α FDH Formiat-Dehydrogenase FPLC fast protein liquid chromatography (schnelle Flüssigchromatographie von Proteinen) G Guanin g Gramm g Erdbeschleunigung GDP Guanosin-5 -diphosphat GMP Guanosin-5 -monophosphat GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosin-5 -triphosphat h Stunde HABA 4 -Hydroxyazobenzol-2-carbonsäure HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino-1-ethansulfonsäure H. influenzae, Hi Haemophilus influenzae HPLC high performance liquid chromatography (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) H. pylori Helicobacter pylori HRP horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) I Inosin IPTG Isopropyl-β-thiogalactopyranosid Kan r Kanamycin-Resistenz kb Kilobasenpaar(e) kda Kilodalton kj Kilojoule kv Kilovolt l Liter LB Luria Bertani M Molar ma Milliampere MALDI matrix-assisted laser-desorption ionization (Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation) µci Mikrocurie mci Millicurie mcs multiple cloning site MES 2-Morpholino-ethansulfonsäure µf Mikrofarad µg Mikrogramm

7 VII MG Molekulargewicht mg Milligramm min Minute(n) M. jannaschii Methanococcus jannaschii µl Mikroliter µm Mikromolar µmol Mikromol ml Milliliter mm Millimolar mmol Millimol mnm 5 Se 2 U 5-Methylaminomethyl-2-selenouridin mnm 5 S 2 U 5-Methylaminomethyl-2-thiouridin mod. modifiziert MOPS 3-Morpholino-propansulfonsäure mrna Messenger-Ribonukleinsäure MS Massenspektrometrie ms Millisekunde M. vanniellii Methanococcus vannielii M. thermoacetica, Mt Moorella thermoacetica N beliebiges Nukleotid Ni-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure nm Nanometer nt Nukleotid(e) NTP Nukleosidtriphosphat OD Optische Dichte ONPG o-nitrophenyl-β-d-galactosid ORF open reading frame (offener Leserahmen) PAA Polyacrylamid P. aeruginosa, Pa Pseudomonas aeruginosa PAGE Polyacrylamid-Gelelectrophorese PBS Phosphat-gepufferte Saline PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PEG Polyethylenglycol pmol Picomol P. multocida, Pm Pasteurella multocida PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid psi pounds per sqare inch PVDF Polyvinylidendifluorid P. vulgaris Proteus vulgaris RF 2 release factor 2 RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RT Raumtemperatur (25 C) RT Reverse Transkription

8 VIII s s. siehe Sekunde(n) s. o. siehe oben SDS SLA sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) Spurenelementlösung A S. meliloti, Sm Sinorhizobium meliloti SSC Standard-Saline-Citrat S. typhimurium, St Salmonella typhimurium T Tab. TAE TBE TBS TE TEMED Tet r T m Tris trna Thymin Tabelle Tris-Acetat-EDTA Tris-Borat-EDTA Tris-gepufferte Saline Tris-EDTA N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Tetracyclin-Resistenz Schmelztemperatur Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Transfer-Ribonukleinsäure T. tengcongensis, Tt Thermoanaerobacter tengcongensis U U Upm UTP UV V vgl. Vol. v/v w/v wt X-Gal Unit (Einheit der Enzymaktivität) Uridin Umdrehungen pro Minute Uridin-5 -triphosphat Ultraviolett Volt vergleiche Volumen Volumen pro Volumen Masse pro Volumen Wildtyp Y. pestis, Yp Yersinia pestis z. B. zum Beispiel z. T. zum Teil 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactopyranosid

9 IX Ein- und Drei-Buchstaben-Code der Aminosäuren: A Ala Alanin N Asn Asparagin C Cys Cystein P Pro Prolin D Asp Aspartat Q Gln Glutamin E Glu Glutamat R Arg Arginin F Phe Phenylalanin S Ser Serin G Gly Glycin T Thr Threonin H His Histidin U Sec Selenocystein I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin X beliebige Aminosäure M Met Methionin Y Tyr Tyrosin