Proteinanalytik Western Blot, Gelelektrophorese

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1 Simon Schuster Proteinanalytik Western Blot, Gelelektrophorese Seminar: Entwicklung Biogener Arzneistoffe

2 Inhalt Aufbau von Proteinen Proteinanalytik Allgemein Arbeitsablauf Lyse von Zellen Mengenbestimmung von Proteinen Polyacrylamidgelelektrophorese Western Blot 2

3 Einleitung 20 proteinogene Aminosäuren (AS) Aminosäuren werden über eine Kondensationsreaktion verknüpft Katalysiert wird die Reaktion durch das Ribosom, als Vorlage dient die mrna (= messenger RNA) Die mrna codiert Aminosäuren in Basentripletts (sog. Codons) jede Aminosäure wird so eindeutig codiert ( Codon-Sonne ) Peptidbindung 3

4 Einleitung Proteine werden in mehrere Organisationsebenen unterteilt: 1. Primärstruktur Abfolge der AS (die sog. Primärsequenz), diese wird letztlich über die DNA-Sequenz bestimmt 2. Sekundärstrukturen z.b. α-helix; β-faltblatt stabilisiert über H- Brücken Faltblätter oder Helices können über funktionelle Schleifen ( Loops ) miteinander verbunden sein 3. Tertiärstruktur bezeichnet räumliche Faltung; Bereiche die für Proteinfunktion wichtig sind werden positioniert bzw. exponiert (Stabilisierung auch über Cys-Cys) 4. Quartärstrukturen Mehrere Tertiärstrukturen bilden einen funktionellen Komplex, dabei werden einzelne AS-Ketten als Untereinheiten bezeichnet 4

5 Einleitung Proteine können je nach Fragestellung mit zahlreichen Techniken analysiert werden - Beispiele: Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) Auftrennung der Proteine nach Größe, IP (2D) oder Komplexgröße je nach Aufbau der PAGE Western Blot Übertragen der Proteine eines PAGE-Gels auf eine Membran Bestimmung von spezifischen Proteinen über AK Bradford-Test Bestimmung von Proteinmengen Massenspektrometrie Bestimmung von postranslationalen Modifikationen (z.b. Phosphorylierungen); Bestimmung von Interaktionspartnern; Quantifizierung 5

6 Arbeitsablauf Arbeitsschritte 1) Lyse der Zellen und Aufreinigung von Proteinen 2) Proteinmengenbestimmung 3) Polyacrylamidgelelectrophorese 4) Western Blot 6

7 Zelllyse Methoden: Ultraschallbehandlung Osmolyse (in hypotonischem Medium) Druck und Scherkräfte (z.b. French Press ) Detergenzien 7

8 Zelllyse Pufferzusammensetzung: Bestandteil Puffersystem (meist TBS = Tris buffered saline) Detergenzien (oft Kombination aus mehreren) z.b. SDS, Triton, Tween Proteaseinhibitoren Phosphataseinhibitoren Funktion Konstanter ph Aufrechterhaltung von Proteinfunktion und Konformation Permeabilisierung Erhöht Löslichkeit von Zellbestandteilen und verhindert Aggregation Inihibiert endogene Proteasen Schutz der Proteine Inhibiert endogene Phosphatasen Schutz der Phosphorylierungen 8

9 Detergenzien (Tenside) Zelllyse Setzen Oberflächenspannung zwischen 2 Phasen herab - wirkt als Emulgator und hilft bei der Lösung von hydrophoben Komponenten Permeabilisiert Zellmembran durch Lösung von Membranlipiden Verschiedene Klassen von Tensiden Triton X 100 Natriumdodecylsulfate (SDS) hydrophob hydrophil 9

10 Zelllyse Proteaseinhibitoren Proteasen (und Peptidasen) spalten Peptidbindungen und fragmentieren Proteine in kleinere Aminosäureketten (=Peptide) bzw. einzelne AS Proteasen werden in verschiedene Klassen unterteilt (z.b. Metalloprotease oder saure Proteasen) Peptidasen werden unterteilt in Endo- und Exopeptidasen Proteaseinhibitor Cocktails für eine breite Inhibition kann man fertig kaufen (z.b. Complete von Roche) 10

11 Zelllyse Phosphataseinhibitoren Postranslationale Modifikationen sind wichtige regulatorische Mechanismen für Proteinfunktionen (z.b. Enzymaktivität) Bekannt sind Phosphorylierungen vermittelt durch Kinasen, Acetylierungen durch Acetyltransferasen und Methylierungen durch Methyltransferasen Schutz der Phosphorylierungen vor Phosphatasen z.b. Natriumorthovanadat oder Natriumfluorid Wichtig um z.b. den Aktivitäts-zustand eines Proteins zu beurteilen 11

12 Mengenbestimmung von Proteinen Spektrometrische Methoden: Absorptionsspektrum (z.b. mit Thermo Nanodrop ); Proteine absorbieren UV-Licht im Bereich von 280nm (Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin) Massenspektrometrie Colorimetrische Methoden: Biuret-Assay Lowry-Assay BCA-Assay Bradford-Assay 12

13 Proteinanalyse BCA-Assay Protein + Cu 2+ Cu + Cu-BCA-Komplex Prozedur: Reagenz Assay: A Bicinchoninacid-Na B Cu 2 SO4 Lösung Mischen von A und B, zur Probe geben, Inkubation für 30min ( 37 C) Absorptionsmessung: complex A max ~ 562nm Detektions-Limit: 0,5 µg Vorteile: alkalisches Milieu Nachteile: Komplexbildner stören Reaktion Cu + BCA complex 13

14 Proteinanalyse Bradford Prozedur: Reagenz: Coomassie Brilliant Blue G250 Absorptionsmessung: blue complex A max ~ 595nm Detektions-Limit: 0,05µg Vorteile: Große Sensitivität Nachteile: saures Milieu Protein kann ausfallen Detergenzien stören manchmal Coomassie Brilliant Blue G nm: freier Farbstoff 595nm: Komplexe 14

15 Absorption (595nm) Auswertung (Bradford): Proteinanalyse Kalibriergerade: Absorption als Funktion der Proteinkonzentration (Blindwert abziehen) Anhand der Kalibriergerade Proteinkonzentrationen errechnen und tabellarisch festhalten Westernblotproben auf die gleiche Proteinmenge pro Volumeneinheit einstellen Proteinmenge [µg] Wichtig (!): Die am wenigsten konzentrierte Probe bleibt unverdünnt 15

16 Proteinanalyse - Basierend auf Polyacrylamidgel - Diskontinuierliches System (Lämmli-System) - Poröse Matrix führt zur Auftrennung der Proteine nach Stokes-Radius im elektrischen Feld - Proteine sollten ein konstantes Masse/Ladungsverhältnis aufzeigen 16

17 Proteinanalyse Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Aufgereinigte Proteine werden mit SDS (Sodiumdodecylsulfat) versetzt SDS führt zur Zerstörung von nicht kovalenten Bindungen DTT (Dithiothreitol) reduziert Disulfidbrücken Nativ SDS 95 C DTT Denaturiert 17

18 Proteinanalyse Lauffront wird durch Brom-Phenol-Blau sichtbar gemacht 18

19 Proteinanalyse 19

20 Proteinanalyse Gele gießen: Zutaten: Acrylamid/Bis,TEMED, APS Gellösungen werden vorbereitet, TEMED (Kat.) APS (Radikalbildner) starten die Polymerisierung (am Schluss dazu geben) Acrylamid ist toxisch! Handschuhe tragen 20

21 Proteinanalyse Transfer von Proteinen auf eine Membran (Nitrocellulose oder PVDF) und anschließender Nachweis mit Antikörpern (deshalb auch Immunoblot ) Edwin Southern erfand 1975 den Southern Blot angelehnt daran wurde der Western Blot und der Northern Blot Unterschieden wird Semi-dry-Blot und Wet-Blot 21

22 Proteinanalyse Detektion: Film, Kamera SUBSTRAT PRODUKT E E Sekundärer Antikörper Primärer Antikörper Blocking Reagenz Membran 22

23 Proteinanalyse Coomassie Brilliant Blue G250 Nach dem Transfer sollten keine Banden mehr zu sehen sein! 23

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