2. Seminar:

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1 2. Seminar: Ballaset al. (1993): Identification of the Auxin-responsive Element, AuxRE, in the Primary indoleacetic Acid-inducible Gene, PS- IAA4/5, of Pea (Pisumsativum). J Mol Biol 233: Ulmasovet al. (1997): ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements. Science 276:

2 preliminary model (1993) Ub AXR1? Ub E3 E2 Ub repressor? Ub Ub Ub Ub AXR1similar to ubiquitin-activating enzyme E1 auxin response

3 Hintergründe bis dahin bekannt (1993): schnelle Induktion der Zellelongation durch Auxin (~15-25 min) transkriptionelleinduktion verschiedener Gene geht der phys. Reaktion voraus. Hypothese: Auxin reguliert Zellelongation über Veränderung von Genexpressionsmustern Auxin-responsiveGene wurden in Erbse, Sojabohne und Arabidopsisidentifiziert, die untereinander eine sehr hohe Homologie aufweisen und Kriterien als primäre Auxinresponsegene erfüllen: Induktion der Expression schnell und spezifisch durch Auxin Induktion erfordert keine de novo Proteinbiosynthese erforderliche Signalelemente liegen bereits vor

4 1. paper Ziel: Identifizierung der Promotorsequenz, die für die Auxin responsein Auxin-induzierbaren Genen verantwortlich ist = Auxin Response Element (AuxRE) = Versuchen den Signalweg vom Ende her zu entschlüsseln (erst die Promotorsequenz, dann Transkriptionsfaktoren, Interaktionsproteine der Transkriptionsfaktoren...) 4

5 Voraussetzung: Etablierung eines Auxin-induzierbaren Protoplastensystems / Reportersystems Lokalisation des AuxREerfordert das Testen vieler verschiedener (chimärer) Konstrukte stabile Trafo(sehr aufwändig+ zeitintensiv + funktioniert nicht mit jeder Pflanzenart gleich gut) transiente Transfektionmit Protoplasten (leichter zugänglich für die Aufnahme von DNA-Konstruktenund Chemikalien als komplexe Gewebe) NotwendigerTest: Überprüfen ob sich die Protoplasten genauso verhalten wie intakte Keimlinge (Auxin response)

6 test protoplasts vs. epicotyls Kontrolle IAA 2,4-D NAA GA ABA BA IAA4/5 IAA4/5 IAA6 pwi1 pwi1 + IAA Kontrolle 20 µm IAA 6 Protoplasten Epicotyle

7 test protoplasts vs. epicotyls IAA4/5 Kontrolle IAA 2,4-D NAA GA ABA BA IAA4/5Induktionin Protoplasten IAA6 IAA4/5 pwi1 gleicht der in Epicotylen wird spezifisch durch Auxine induziert erfolgt schnell, pwi1 Transkriptmengeakkumuliert + IAA in Abhäng. Kontrolle der Behandlungsdauer µm IAA Protoplasten Epicotyle 7

8 Konz. abhängigkeit IAA4/5 pwi1 IAA4/5 Expression nimm mit steigener Auxinkonz. zu Inhibierungder Proteinbiosynthese aktiviert Expression auch in Abwesenheit von Auxin! 1. Signalelemente müssen nicht erst gebildet werden 2. fehlende Aktivierung im Grundzustand vermutlich durch Repressorproteine 8

9 Konz. abhängigkeit IAA4/5 pwi1 Auxin responsein Protoplasten ist mit der von Epicotylen vergleichbar kann für weitere Experimente genutzt werden IAA4/5 Expression nimm mit steigener Auxinkonz. zu Inhibierungder Proteinbiosynthese aktiviert Expression auch in Abwesenheit von Auxin! 1. Signalelemente müssen nicht erst gebildet werden 2. fehlende Aktivierung im Grundzustand vermutlich durch Repressorproteine 9

10 Transkriptionelle Fusion (chimäre Konstrukte) Promotor XY Gen XY GFP Promotor XY + Reportergen Luciferase ß-Glucuronidase(GUS) CAT Aktivierung Promotor XY Reportergen Nachweis der mrna Nachweis der Proteinaktivität

11 Transkriptionelle Fusion (chimäre Konstrukte) Promotor XY Gen XY GFP Promotor XY + Reportergen Luciferase ß-Glucuronidase(GUS) CAT Aktivierung Promotor XY Reportergen Nachweis der mrna Nachweis der Proteinaktivität

12 CAT reporter system CAT = Chloramphenicol acetyltransferase Enzym kann das Antibiotikum Chloramphenicolneutralisieren, indem Acetylgruppen übertragen werden -CAT + CAT 12

13 CAT reportersystem Test des CAT reporter systems K kein Promotor konstitutiver Promotor IAA4/5 Promotor IAA4/5::CAT: CAT-Aktivität spiegelt die Auxin responsedes Promotors zeit-und konzentrationsabhängig wider 13

14 AufklärungderPromotorstruktur primer extension: i.d.r. ersterschritt zur Charakterisierung von Promotorbereichen/Erhalt vollständiger Transkripte Identifizierungdes Transkriptionsstarts (TATAbox, 5 UTR) TATA? ATG Promotor? 5 UTR? reverse Transkription IAA4/5 IAA4/5 (mrna) P 32 Primer 14

15 Primer extension IAA4/5 (mrna) P 32 Primer 3 Transkriptionsstarts identifiziert: 93, 95 und 99 bpvor dem Start ATG Experiment wurde auch mit Primer Extension aus dem chimärenkonstrukt (IAA4/5:CAT) wiederholt = gleiches Ergebnis ACGT Pr Epi 15

16 promoter deletion analysis basale CATAktivität vermindert -aber Auxin response funktioniert noch keine/kaum CATAktivität CAT Aktivität Vom 5 Ende her markiert Position -318 die Grenze zur Position des AuxRE 16

17 promoter deletion analysis markiert 3 Endedes AuxRE

18 promoter deletion analysis Das AuxREliegt im Bereich von -154 bis

19 Testender core sequence min.promotor = keine CAT Aktivität AuxRE= Auxin-induzierter Anstieg der CAT Aktivität inv.auxre= geringe Induktion der CAT Aktivität min.promotor = kaum CAT Aktivität AuxRE= Auxin-induzierter Anstieg der CAT Aktivität inv.auxre= geringe Induktion der CAT Aktivität (-318 AuxRE-154) reicht für die Auxin response aus korrekte Orientierung ist essentiel! 19

20 in vivo reporter assay Konstrukte in Tabak transformiert GUS IAA4/5 Promotor GUS -318 IAA4/5 Prom. GUS Bestätigung der Region -318 bis -154 als notwendig für die Auxin response + Faktoren die dafür in Erbse nötig sind finden sich auch in Tabak -188 IAA4/5 GUS 20

21 Bereichwurdeauf 164 bp eingegrenzt(-318 bis-154) DNaseI footprinting Liegen Bindestellen für kernlokalisierte Proteine (Transkriptionsfaktoren) in diesem Bereich? DNase I footprinting 21

22 Nr. 3 / 10 Nr. 4 / 5 / 6 (-IAA) Nr. 7 / 8 / 9 (+IAA) - IAA + IAA 22

23 - IAA komplementärer Strang - IAA + IAA 23

24 - IAA komplementärer Strang - IAA + IAA 24

25 Strukturdes AuxRE II-VI: five sequence motifs identified by Oeller et al. (1993) footprint C/E CACATGCTCATGTTTC palindrome sequence TGTCCCAT (1993) found in: auxin-responsive genes of P. sativum, soybean and A. thaliana 25

26 Modelle(1993) 26

27 1. paper Fazit: Es konnten zwei verschiedene Sequenzbereiche identifiziert werden, die zusammen die Auxin response vermitteln. Für beide Bereiche konnte die Bindung von Kernproteinen gezeigt werden + konservierte Sequenzen gefunden werden die in Auxin-responsivenGenen verschiedener Arten auftreten 27

28 2.paper Science (1997) Ziel: weitere Charakterisierung des AuxRE Identifizierung von Proteinen, die mit AuxRE interagieren Hintergrund: AuxREwurde anhand eines anderen Promotors (GH3aus Sojabohne) als konservierte Sequenz TGTCTC identifiziert Motif weist Homologie zu Glucocorticoid Motif(TGTTCT) auf, das i.d.r als Palindromsequenz(AGAACAnnnTGTTCT) vorliegt liegen AuxRE auch in Palindromen vor? 28

29 quantitativergus assay fluorimetrische Quantifizierung der Blaufärbung Test in Möhren Protoplasten D0: eins der zwei AuxRE des GH3 Promotors 29

30 Yeast-one-hybridsystem Identifizierung von Proteinen, die an das AuxRE binden können 1. cdnaexpressionlibrary(jeweiliges Protein wird mit einer Aktivierungsdomäne verbunden) 2. AuxRE wird mit einem LacZ reporter verbunden bindet ein Protein (aus der cdnaexpressionlibrary) anddas AuxRE, kommt es zur Aktivierung der LacZExpression und die entsprechenden Hefezellen werden je nach Reportergen blau oder können auf einem Minimalmedium wachsen auf dem ohne Expression des Reporters kein Wachstum möglich ist. 30

31 Yeast-one-hybrid screen 5 cdna Klone wurden identifiziert alle kodieren für das gleiche Protein: ARF1 Sequenzhomologie zu VP1(TF aus Mais) und ABI1(Homologes Gen in Arabidopsis) mögliche NLS Sequenzhomologie zu AUX/IAAs (putative TFs) 31

32 StrukturderGene 32

33 alignments 33

34 gel mobility shift assay Nachweis der Bindung eines Proteins an DNA DNA Fragmente an die ein Protein gebunden vorliegt, bewegen sich langsamer im Gel als freie DNA Stücke (abhängig von der Größe und Anzahl der gebundenen Proteine). 34

35 gel mobility shift assay C ARF1 Deletionen N ARF1wird von AuxRE gebunden Deletionendie in die VP1homologe Region reichen (C286bzw. N63und N154) können kein P3(2x) mehr binden = DNA Bindedomäne liegt am N-terminus 35

36 quantitativergus assay Welche Basen im Motif sind essentiell für die Auxininduktion? + GUS Protoplasten keine Auxininduktion der GUS Aktivität 36

37 DNase I footprinting ARF1 - - StrukturderARF1Bindestelle ARF1 bindet scheinbar bevorzugt an den everted repeat Bereich der Palindromen AuxRE Sequenz Test mit mobility shift assay 37

38 StrukturderARF1Bindestelle(n) P3(1x) = 1 inverted repeat P3(2x) = 2 inverted repeats 1 everted repeat 1 x IRist nicht ausreichend für ARF1 Bindung 1 x ER kann ARF1binden 2 x ER = 2 ARF1Komplexe (P3(4x)) 38

39 StrukturderARF1Bindestelle ARF1bindet im evertedrepeatbereich der Palindromen AuxRE Sequenz bei GREsist der Abstand zwischen den Palindromen wichtig für die Bindungsaffinität Auch bei AuxREs? 39

40 quantitativergus assay Abstand 0 (ER0) 9 (ER9) Basen ER Konstrukte + GUS Protoplasten Auxin responseist am stärksten, wenn der Abstand der ERs7 bis 8 Basen beträgt 40

41 2.paper Science (1997) Fazit: COOH ARF1 NH 2 VP1/ ABI3homol. IV III ARF1 Bindingprotein AuxRE 41

42 Modelle(1997) ARF1 BP? BP? ARF1 BP? ARF1 BP? ARF1 42

43 nächstewoche: Alexandra und Ariane: 43