Promotoren und Transkriptionsfaktoren (TF)

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1 Promotoren und Transkriptionsfaktoren (TF) Übersicht Promoteranalyse Transiente Genexpression DNA/TF Bindung TFs in Eukaryoten Anzahl Klassen Domain shuffling Kombinatorische Kontrolle Methoden zur Isolation DNA-bindender Proteine Koloniehybridisierung Yeast one-hybrid system Literatur

2 Einleitung Allgemeine Transkriptionsfaktoren: Komponenten, des RNA-Polymerase II Transkriptions- Initiationskomplexes, die für die Transkription aller RNA-Polymerase II Promotoren benötigt werden. Transkriptionelle Regulatoren: Klasse DNA-bindender, regulatorischer Proteine, die genspezifisch wirken und bestimmte Zielpromotoren regulieren (meist aktivieren).

3 Transkriptions-Initiations Komplex Einleitung trans-acting factor (Protein, z.b. TF) cis-element (DNA-Sequenz) Rep genspezifische Transkriptionsfaktoren Transkription DNA Wechselwirkung zwischen transkriptionellen Aktivatoren (Act) und allgemeinen Transkriptionsfaktoren stabilisiert den Transkriptions- Initiationskomplex. Repressoren (Rep) schwächen den Initiationskomplex. Start der Transkription

4 Deletionsanalyse eines Promoters: Promoteranalyse Ziel: Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Deletion (Entfernung) Promotersequenzen mit funktionellem Test Beispiel: PR-1 Promoter Arabidopsis INA Induktion (2,6-dichloroisonicotinic acid, synthetischer Inducer für SAR)

5 Deletionsanalyse eines Promoters: Promoteranalyse Ziel: Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Deletion (Entfernung) Promotersequenzen mit funktionellem Test Beispiel: PR-1 Promoter Arabidopsis INA Induktion spezifische GUS Aktivität Kontrolle

6 Deletionsanalyse eines Promoters: Promoteranalyse Ziel: Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Deletion (Entfernung) Promotersequenzen mit funktionellem Test Beispiel: PR-1 Promoter Arabidopsis INA Induktion spezifische GUS Aktivität induction factor! ( + -) Kontrolle Induktion

7 Linker Scanning: Promoteranalyse Ziel: Feinanalyse regulatorischer Promoterregionen Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Veränderung kurzer (ca. 10 bp) Sequenzen eines Promoters mit Funktionstest

8 Transiente Genexpression: Transiente Genexpression Ziel: Promoteranalyse Testsysteme: Protoplasten, Particle bombardment Protoplasten: Verdauen der Zellwände (z.b. Blätter) mit Enzymmix (Zellulasen, Pektinasen etc.) Inkubation mit Plasmid-DNA (Effektor, Reporter) PEG-Zugabe Analyse von Reporteraktivität in Abhängigkeit von Effektoren (Proteinen, Signalmolekülen) - GFP + GFP Particle bombardment: Beschichtung kleiner Goldkügelchen mit Plasmid-DANN Beschuss (Pressluft) von Gewebe (z.b. Zwiebelepidermis) Analyse von Reporteraktivität GFP-Aktivität in Arabidopsis Protoplasten

9 DNA-Struktur DNA/TF Bindung Minor groove (kleine Furche) Major groove (große Furche)

10 DNA/TF Bindung Die verschiedenen Basenpaare werden erkannt ohne Aufschmelzen der Doppelhelix H-Brücken Donor: blau H-Brücken Akzeptor: rot H-Brücke: rote Linie Hydrophobe Protuberanz: gelb Freies H-Atom: weiss Major groove: Erkennungsmuster für alle 4 Kombinationen Minor groove: AT gleicht TA; GC gleicht CG

11 Bindung eines TF an die major groove der DNA DNA/TF Bindung solcher nicht-kovalenten Kontakte tragen zur Bindungsenergie einer DNA/TF Interaktion bei.

12 Transkriptionsfaktoren (TF) in Eukaryoten TF in Eukaryoten TFs/Genom Gene für TFs Organismus Anzahl Gene Total % aller Gene A. thaliana ~26, S. cerevisiae ~6, D. melanogaster ~14,

13 Modularer Aufbau eines TFs TF in Eukaryoten Aufbau TF: DNA-bindende Domäne Aktivierungsdomäne Flexible Verbindung

14 TF in Eukaryoten Klassen Helix-turn-helix Homeobox Proteine Zink Finger Leucine zipper und andere...

15 Helix-turn-helix TF in Eukaryoten erste identifizierte DNA-Erkennungssequenz 2 α-helices verbunden durch turn (Windung) C-terminale Helix erkennt DNA-Sequenz Erkennungs-Helix (recognition helix; rot) Bindung an major groove Dimere binden DNA Symmetrische Anordnung von Protein und DNA-Erkennungssequenz (Palindrom) Verdopplung der Kontakte vervierfacht die Bindungskonstante

16 Helix-turn-helix TF in Eukaryoten Myb isoliert aus avian myeloblastosis virus Vorkommen: Insekten, Pilzen, Pflanzen (Arabidopsis >100 Gene) In Pflanzen 3 Klassen: 1, 2 und 3 MYB-Domänen Multifunktionell z.b.: LHY CPC1 AtMYBGL1 AtMYB13 MSA-binding protein Regulation der circadianen Uhr Differenzierung von Epidermiszellen, Wurzelhaaren Trichomentwickung Sprossentwicklung Regulation von Zellcyclus-Regulatoren (cyclin)

17 Homeobox Proteine TF in Eukaryoten 1980 entdeckt, Drosophila Walter Gehring, Biozentrum Basel spezielle helix-turn-helix Proteine konservierte 60 aa Domäne Helix 2 und 3 bilden helix-turn-helix Motif Helix 3 erkennt DNA (major groove) Arm der Helix 1 greift um DNA in minor groove Funktion: Fundamentale Rolle bei der Steuerung der Entwicklung bei Tieren und Pflanzen

18 Homeobox Proteine TF in Eukaryoten kn-1 Mutationen KN (knotted) Genfamilie: erstes Homeoboxgen aus Pflanze (Mais kn-1, knotted 1) Wichtige Regulatoren der Pflanzenentwicklung Expression in SAM

19 Zink Finger TF in Eukaryoten Zink strukturelles Element Cys-Cys-His-His bindet Zink-Atom DNA-Bindung durch 3 Zink-Finger

20 Zink Finger TF in Eukaryoten SUPERMAN aus Arabidopsis Repressor der Blütenentwicklung Repressordomäne (RD) C-term. wild-type 35S::SUP RD 35S::SUP RD Phenotype of flowers of 35S::SUPDRD transgenic plants. A: Wild-type (Col-O) flower, with the normal number of stamen (six) and a central gynoecium, which consisted of two fused carpels. B: Flower from a 35S::SUPDRD transgenic T1 plant with 11 stamens and two incompletely fused carpels. C: Flower from a 35S::SUPDRD transgenic T1 plant with seven stamens and three incompletely fused carpels.

21 Leucine Zipper TF in Eukaryoten DNA-Erkennung und Dimerisierung in einer Domäne vereint 2 α-helices bilden coiled-coil hydrophobe Wechselwirkungen (Leucin) zwischen Helices bindet major groove Form einer Wäscheklammer auf der Leine Jun (blau), Fos (rot) L-Leu

22 Domain shuffling TF in Eukaryoten TF-Klassen in Arabidopsis Genfamilien: Größe prop. zur Anzahl der Mitglieder Domain-shuffeling: Größe prop. zur Länge der Domäne DNA-Bindungsdomäne: farbig Protein/Protein Bindung: gemustert Beispiel für Domain-shuffeling: HD-Zip Proteine Figure 1. Relationships and domain shuffling among the different Arabidopsis transcription factor families. Gene families are represented by circles, whose size is proportional to the number of members in the family. Domains that have been shuffled and that therefore "connect" different groups of transcription factors are indicated with rectangles, whose size is proportional to the length of the domain. DNA binding domains are colored; other domains (usually protein-protein interaction domains) are shown with hatched patterns. Dashed lines indicate that a given domain is a characteristic of the family or subfamily to which it is connected. Gene names are written in italics. Whereas many of the indicated domain-shuffling events are specific to plants, others likely predate the appearance of the three distinct eukaryotic lineages. For an expanded version of this figure and the information that was used to construct it, see supplemental material. Arabidopsis Transcription Factors: Genome-Wide Comparative Analysis Among Eukaryotes Riechmann et al, Science (2000).

23 Eukaryotic transcriptional regulators. Number of transcriptional regulators in Arabidopsis (A.t.), Drosophila (D.m.), C. elegans (C.e.), and S. cerevisiae (S.c.), classified by families on the basis of sequence similarity. The table is nonredundant: proteins are counted only once, regardless of whether they have more than one signature motif. The way in which proteins combine different DNA binding motifs were organized into families is reflected in. Families that are specific to one lineage are indicated in color. Families are listed under "Transcription factors" or "Other transcriptional regulators," as described in the text. However, this distinction is not without problems (for example, the ARID and HMG-box families). Information about the signature motif(s) or sequences that define each family is provided as an InterPro (IPR) or GenBank accession number. (Zn) indicate a zinc coordinating DNA binding motif. In the bhlh class, only proteins with a discernible basic region were included. "Other" includes some single-copy genes and small families that are not individually mentioned in the text. The results of the database searches (P, motif searches; B, BLAST) and sequence comparisons were inspected by eye.

24 Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Einsetzen von einer begrenzten Anzahl TFs in unterschiedlichen Kombinationen, um ein breites Spektrum von Expressionsmustern zu erzeugen z.b. Heterodimerisierung von Leucine zipper Proteinen verändert die Spezifität der DNA-Bindung. Eukaryotische Genregulatoren bilden häufig Komplexe auf der DNA 5 Regulator- Proteine Gen an Gen aus

25 Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Homo-, Heterodimere 3 TFs: 6 DNA-Sequenzen 4 TFs: 10 DNA-Sequenzen 5 TFs: 15 DNA-Sequenzen etc. plus Kombinationen mit Inhibitor-Bindung bzw. Repressoren

26 Koloniehybridisierung (South-Western) Methoden Identifizierung von Proteinen, die sequenzspezifisch DNA erkennen

27 Yeast one-hybrid system Methoden Fusionsprotein Aktivierungsdomäne (AD) cdna Bindung der Fusion an künstlichen Promoter führt zur Aktivierung des Reportergens (HIS3 oder lacz). Isolation von DNA-bindenden Proteinen möglich.

28 Gel-mobility shift assay Methoden Schema Fraktionierung eines Extraktes durch Chromotographie mit anschließendem gel-shift assay

29 DNA-Affinitätschromatographie Methoden

30 Lehrbücher: Splicing: Polyadenylierung: Promoteranalyse: Molecular Biology of the Cell. 4rd ed. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Martin; Roberts, K. and Walter, P. (2002) New York and London: Garland Publishing. + CD Genes VII, Lewin (2000) Oxford University Press and Cell Press. Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem and Jones (2000) American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland Lorkovic,Z.J., Wieczorek-Kirk,D.A., Lambermon,M.,H. and Filipowicz,W. (2000) Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends Plant Sci., 5, Rothnie,H.,M. (1996) Plant mrna 3'-end formation. Plant Mol. Biol., 32, Lebel,E., Heifetz,P., Thorne,L., Uknes,S., Ryals,J. and Ward,E. (1998) Functional analysis of regulatory sequences controlling PR-1 gene expression in Arabidopsis. Plant J., 16, Arabidopsis Transkriptionsfaktoren: Riechmann,J.,L, Heard,J., Martin,G., Reuber,L., Jiang,C., Keddie,J., Adam,L., Pineda,O., Ratcliffe,O.,J., Samaha,R.,R., Creelman,R., Pilgrim,M., Broun,P., Zhang,J.,Z., Ghandehari,D., Sherman,B.K. and Yu,G. (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 290, Yeast one-hybrid und yeast two-hybrid system: Homeobox Proteine:

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