Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg.

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Benedikt Sternberg
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1 3 Reinigung und Charakterisierung eines chitosanbindenden Faktors aus Erbsensamen (Pisum sativum) und seine Funktion bei der Abwehr phytopathogener Pilze Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg Vorgelegt von Paula Torres Londono aus Bogota / Kolumbien Würzburg 1997

2 -I- INHALTSVERZEICHNIS A. EINLEITUNG 1 I. PFLANZEN-PATHOGEN WECHSELWIRKUNGEN: DEFINITIONEN 3 1. Pathogenität und Virulenz 3 2. Inkompatible Interaktion 3 3. Kompatible Interaktion 4 II. DIE GENETISCHE GRUNDLAGE, DAS GEN-FÜR-GEN MODELL 4 III. DAS ABWEHRSYSTEM 5 1. Konstitutive Abwehrmechanismen 5 2. Induzierbare Abwehrmechanismen 6 a. Elicitor-Rezeptor 6 b. Transduktion 8 c. Kohlenhydrateinlagerungen _ 9 d. Hypersensitive-Reaktion (HR) 9 e. Oxidativer Burst in der HR 10 f. Resistenzproteine 10 g. Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL) 10 h. Hydroxyprolinreiche Proteine (HPRP) 12 i. Pathogenesis-related proteins (PRP) 13 IV. DER ZUCKER-CODE Wachstumsfaktoren Nodulationsfaktoren, Vorboten einer Symbiose Suppressoren Elicitoren 17

3 -II- V. BIOLOGIE VON FUSARIUM SOLANI F. SP. PISI Die Wurzelfäule Biologie von Fusarium solanif. sp. pisi Epidemiologie Virulenz-Faktoren 23 VI. ERBSEN-FUSARIUM WECHSELWIRKUNGEN Kompatible Reaktion (Fusarium solanif. sp. pisi) Inkompatible Reaktion (F. solanif.sp. phaseoli) 28 VII. ROLLE VON CHITOSAN BEI ERBSEN-FUSARIUM- WECHSELWIRKUNGEN Einfluß auf Pflanzenzellen Einfluß auf Pilz-Zellen Entstehung von Chitosan-Oligomeren 29 VIII. ARBEITSZIEL 30 Warum der Name "Wu Wei" 31 B. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON WU WEI, EINEM CHITOSANBINDENDEN FAKTOR AUS DEN ERBSENSAMEN 32 I. VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON LECTINEN Untersuchung auf agglutinierende Aktivität 32

4 -III- 2. Rohextraktherstellung 33 a. Optimierung der Extraktionsbedingungen 33 b. Laufschema zur Herstellung des Untersuchungsmaterials (S2) Bestimmung der Zuckerbindungsspezifität 35 II. ISOLIERUNG UND REINIGUNG Affinitätschromatographische Versuche zur Lectinisolierung 36 a. Affinitätschromatographie an Sephadex G b. Affinitätschromatographie an Chitosan Ultrafiltration Hydrophobe Chromatographie Ionenaustausch Chromatographie Gelfiltration Kapillar-Elektrophorese (CE) 42 III. BIOLOGISCHE UND PHYSIKALISCH-CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON WU WEI Spezifische agglutinierende Aktivität Hitzestabilität Molekulargewichtsbestimmung mittels Gelfiltration Aminosäureanalyse mittels HPLC 46 a. Cystein-Bestimmung nach Ellman (1958) Zuckeranalyse 50 IV. AGGLUTINIERENDE AKTIVITÄT IM ERBSENSAMEN-EXUDAT NACH UNTERSCHIEDLICHEN QUELLZEITEN Untersuchung des Quellwassers nach unterschiedlichen Inkubationszeiten Untersuchung der Bindungsspezifität der agglutinierenden Aktivität im Quellwasser 55

5 -IV- C. BIOLOGISCHE WECHSELWIRKUNGEN VON WU WEI 56 I. UNTERSUCHUNG DER HEMMWIRKUNG VON WU WEI AUF DAS WACHSTUM VON ERBSEN-PATHOGENEN UND -NICHT-PATHOGENEN PILZEN 56 II. WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN WU WEI UND CHITOSAN-OLIGOMEREN IM PILZ-HEMMTEST 59 III. EINFLUSS VON AMINOZUCKERN AUF DIE ANTIMYKOTISCHE WIRKUNG VON WU WEI 62 IV. ENZYMATISCHE AKTIVITÄTSBESTIMMUNG Nachweis von Hydrolasen-Aktivität Untersuchung der gemeinsamen Wirkung von Wu Wei und der Chitinase-Aktivität 65 V. UNTERSUCHUNG DER WIRKUNG VOM PISUM SATIVUM LECTIN (PsL) AUF DAS PILZ-WACHSTUM. 66 VI. UNTERSUCHUNG DER ELICITORISCHEN WIRKUNG VON WU WEI 67 VII. UNTERSUCHUNG DER AKTIVITÄT VON WU WEI AUF DAS WACHSTUM VON RAUPEN AUS SPODOPTERA LITTORALIS 70 VIII. UNTERSUCHUNG DER WIRKUNG VON WU WEI AUF DIE LYMPHOZYTEN-PROLIFERATION 71

6 - V- D. AUSBLICK 76 E. ZUSAMMENFASSUNG 77 F. EXPERIMENTELLER TEIL 79 I. MATERIAL Pflanzenmaterial Mikroorganismen Reagenzien Geräte 81 II. METHODEN Untersuchung auf agglutinierende Aktivität 82 a. Herstellung der Erythrozytensuspension 83 b. Agglutinationstest Bestimmung der Zuckerbindungsspezifizität 83 a. Hemmtest Einfluß von ph-wert und Ionenstärke auf die Extraktion der 84 agglutinierenden Aktivität a. Pufferherstellung 84 b. Rohextraktherstellung Hemmversuche zur Bestimmung der Bindungs-Spezifität Affinitätschromatographie an Sephadex G Affinitätschromatographie an Chitosan Hydrophobe Chromatographie Ionenaustausch Chromatographie Ultrafiltration 87

7 -VI- 10. SDS-PAGE nach Laemmli (1970) 88 a. Denaturierung und Reduktion von Proteinen für die SDS-PAGE 88 b. Herstellung der SDS-Polyacrylamidgele und Elektrophoresebedingungen 88 c. Coomassie Färbung Kapillar Elektrophorese (CE) Molekulargewichtsbestimmung mittels Gelfiltration Proteinbestimmungsmethoden 92 a. Spektralphotometrische Bestimmung 92 b. BCA-Proteinbestimmung nach Smith et al. (1985) 92 c. Proteinbestimmung auf Mikrotestplatten mit Fluorescamin Aminosäureanalyse mittels HPLC Zuckeranalyse 98 a. Bestimmung der Monosccharide 98 b. Bestimmung der Uronsäuren Untersuchung des Quellwassers nach unterschiedlichen 100 Inkubationszeiten 17. Untersuchung der Hemmwirkung von Wu Wei auf das Pilzwachstum 100 a. Pilzkulturen ( 101 b. Anzucht der verschiedenen Pilze 102 c. Impfung 102 d. Herstellung der Nährlösung (NL) 102 e. Herstellung der Test-Sporensuspension (TSS) 103 f. Versuchsansatz Enzymatische Aktivitätsbestimmung Herstellung von Chitosan-Oligomeren mit salpetriger Säure 105 (nach Kobayashi et al., 1994) 20. Untersuchung der elicitorischen Wirkung von Wu Wei 105 a. Vorbereitung des Pflanzenmaterials 105 b. Pisatin Nachweis Wirkung von Wu Wei auf das Wachstum von Raupen aus Spodoptera littoralis 106 a. Zubereitung des Biotest-Futters 106 b. Durchführung des Biotests Wirkung von Wu Wei auf die Lymphozyten-Proliferation 107 a. Zellkulturen und Vermehrungsversuche 107 G. ANHANG 108

8 - VII - I. UNTERSUCHUNG DER WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN PSL UND WU WEI MITTELS ELISA Bindung im Abhängigkeit von der Konzentration von Wu Wei Bindungsaffinität in Abhängigkeit vom ph-wert 111 II. UNTERSUCHUNG DER AGGLUTINIERENDEN AKTIVITÄT IN DEN SAMEN VON IBERIS AMARA EXTRAKTIONSBEDINGUNGEN Optimierung der Extraktionsbedingungen 113 a. Einfluß des ph-werts 114 b. Einfluß der Ionenstärke Extraktionsschema ISOLIERUNG UND REINIGUNG Bestimmung der Zuckerbindungsspezifität Affinitätschromatographische Versuche Ionenaustausch-Chromatographie CHEMISCH-PHYSIKALISCHE UND BIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN Temperaturresistenz Molekulargewichts-Bestimmung mittels Gelfiltration Untersuchung der BIutgruppen-MN-Spezifität DISKUSSION 123 H. LITERATURVERZEICHNIS 124

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