Biosynthese, Charakterisierung und Funktion von Chlorophyll-Vorstufen in der lichtabhängig ergrünenden Mutante C-2A' von Scenedesmus obliquus

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1 3 Biosynthese, Charakterisierung und Funktion von Chlorophyll-Vorstufen in der lichtabhängig ergrünenden Mutante C-2A' von Scenedesmus obliquus DISSERTATION Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Rosemarie Kriemhild Cornelia Knaust aus Gudensberg Marburg/Lahn, 1994

2 -i- Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Die Ergrünung von Pflanzen Übersicht über die Chlorophyll-Biosynthese Die letzten Schritte der Chlorophyll-Biosynthese Vorkommen und Struktur der Chl-Vorstufen PChlid und PChl Die Reduktion von PChlid zu Chlid durch die NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase Die Veresterung von Chlorophyllid zu Chlorophyll Monovinyl- und Divinyl-Biosynthesewege der Chlorophyll- Biosynthese Monovinyl- und Divinyl-Derivate der späten Chlorophyllvorläufer Reduktion der Vinylgruppe an C-8, Problemstellung Material und Methoden Objekte und Anzucht Anzucht von Scenedesmus obliquus WT D3 und der Mutanten C-2A' und C-2A'-LHCi Anzucht der Mutante N5 von Rhodobacter sphaeroides Anzucht von Escherichia coli A7 und Lambda, Stamm Y Anzucht von Weizen zur Ernte der Wurzeln Dunkelanzucht von Gurkenkeimlingen und der Gerste- Mutante Tigrina-d Gewinnung von Pigment-Gesamtextrakten Methanolischer Gesamtextrakt Pigmentextraktion mit wäßrigem Aceton Auftrennung von Pigment-Gesamtextrakten Auftrennung über Anionenaustauscher Vorbereitung der Anionenaustauschersäule Trennung über Anionenaustauschersäule Regenerierung des Anionenaustauschers Gewinnung von Chl a und b Ausschütteln von PChlid und Chlid aus wäßrigem Aceton-Gesamtextrakt 28

3 3.3.4 Ausschütteln der Pigmente aus dem Nährmedium der Mutante N5 von Rhodobacter sphaeroides Dünnschichtchromatograpie (DC) von Pigmenten Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) von angereicherten Pigmenten Apparative Ausstattung Auftrennungen über Polethylen zur Isolierung von Monovinyl- und Divinyl-Derivaten Reversed Phase-Chromatographie (RP) Auftrennung von veresterten PChl-Formen über RP Reversed Phase-Ionenpaar-Chromatographie zur gleichzeitigen Auftrennung von MV- und DV-Derivaten von PChlid und Chlid Anreicherung der NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase aus der Mutante C-2A' von Scenedesmus obliquus Herstellung einer zellfreien Rohpräparation Auftrennung der Rohpräparation über Anionenaustauscher Vorbereitung der Anionenaustauscher-Säule Trennung des Rohhomogenates Gewinnung einer Rohpräparation von in E.coli exprimierter PChlid-Reduktase der Gerste Enzymamsätze zur /n-v/fro-photokonversion von PChl(id) zu Chl(id) Pigment-Umsetzungen mit PChlid-Reduktase aus der Mutante C-2A' von Scenedesmus obliquus Pigment-Umsetzungen mit PChlid-Reduktase der Gerste, exprimiert in E.coli Spektroskopische Methoden Absorptionsspektren Fluoreszenzspektren Cf-Plasma-Desorptions-Massenspektrometrie (PDMS) Quantitative Bestimmungsmethoden PCV-Bestimmung Quantitative Bestimmung von Pigmentkonzentrationen Gesamtextrakte Gereinigte Pigmentlösungen Quantitative HPLC-Analyse 39

4 4. Ergebnisse und Diskussionen Isolierung und Charakterisierung von Monovinyl- und Divinyl-Protochlorophyllid Monovinyl- und Divinyl-Protochlorophyllid aus Scenedesmus obliquus C-2A' und C-2A'-LHCi Isolierung von PChlid aus der Gerste-Mutante Tigrina-d PChlid aus der Mutante N5 von Rhodobacter sphaeroides Diskussion Die Isolierung und Charakterisierung von Monovinyl- und Divinyl-Protochlorophyll aus Scenedesmus C-2A' und deren verschiedene Veresterungsstufen Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von Monovinyl-Protochlorophyll (MV-PChl) und Divinyl- Protochlorophyll (DV-PChl) Massenbestimmung von MV- und DV-PChl über 252 Cf-Plasma- Desorptions-Massenspektrometrie (PDMS) Untersuchung zur Natur der mit PChl veresterten Alkohole Diskussion Die Dunkelakkumulation der MV- und DV-Derivate der Chlorophyll-Vorstufen PChlid und PChl in Scenedesmus C-2A' Dunkelakkumulation und Abbau der MV- und DV-Derivate von PChlid und PChl in Abhängigkeit vom Kulturalter Die Wirkung von ALA auf dunkel angezogene Scenedesmus C-2A' Reakkumulation von PChlid nach Belichtung wieder verdunkelter Zellen der Scenedesmus-Mutants C-2A' Diskussion Die in vifro-photokonversion von Monovinyl- und Divinyl- Derivaten von Protochlorophyllid und Protochlorophyll Die in vz'rro-photokonversion mit angereicherter PChlid- Reduktase aus Scenedesmus obliquus C-2A' Isolierung und Aktivitätsnachweis einer angereicherten PChlid-Reduktase-Fraktion aus Scenedesmus obliquus C-2A' 106

5 -iv Die in vitro-photokonversion von MV- und DV-PChlid mit angereicherter PChlid-Reduktase aus Scenedesmus obliquus C-2A' Die in vftro-photokonversion einer PChl-Gesamtfraktion mit angereicherter PChlid-Reduktase aus Scenedesmus obliquus C-2A' Die in vi'/ro-photokonversion von MV- und DV-PChlid durch PChlid-Reduktase aus Gerste, exprimiert in E.coli Diskussion Das Auftreten der Vinyl-Derivate bei der Umwandlung von PChlid zu Chlid nach kurzer Belichtung Untersuchung der entstehenden Vinyl-Derivate des Chlides nach kurzer Belichtung Diskussion Untersuchung des "späten" Chlorophyllid-Pools in 2 h belichteten Zellen von Scenedesmus obliquus C-2A Charakterisierung des "späten" Chlides aus 2 h belichteten Zellen von Scenedesmus obliquus C-2A' Die temperaturabhängige Bildung von Chlid b Diskussion Untersuchungen zu Chl a und b während der Ergrünung in Scenedesmus obliquus Isolierung und spektroskopische Charakterisierung von"frühem" Chl a und Chl b aus der Mutante C-2A' von Scenedesmus Untersuchung der Veresterungsstufen von "frühem" Chl a und b Diskussion Schlußfolgerungen Zusammenfassung Zitierte Literatur 152