BARNSTAR EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG MÄNNLICH STERILER TOMATENPFLANZEN

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "BARNSTAR EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG MÄNNLICH STERILER TOMATENPFLANZEN"

Gretel Vogel
vor 6 Jahren
Abrufe

1 Institut für Biologie und Biotechnologie bei Pflanzen Seminar: Gentechnik in der Landwirtschaft Dozent: Dr. Maik Böhmer Referentin: Rieke Knüver BARNSTAR EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG MÄNNLICH STERILER TOMATENPFLANZEN

2 2 GLIEDERUNG Einleitung Methode Herstellung der transgenen Tomatenpflanze Herstellung der Vektoren Transformation und Regeneration Ergebnisse Regeneration und Nachweis transgener Pflanzen Blütenmorphologie Pollenvitalität Kreuzung transgener Linien Wiederherstellung der Fertilität

3 3 WOZU WERDEN MÄNNLICH STERILE PFLANZEN BENÖTIGT? Nutzung des Heterosiseffekts in der Hybridzüchtung Heterosiseffekt F1-Generation der Inzuchtlinien ist deutlich ertragreicher und resistenter als die Parentalgeneration Abb. 1: Grundlegendes Prinzip der Hybridzüchtung Einleitung Methode Ergebnisse

4 4 MORPHOLOGIE DER BLÜTE EINER TOMATENPFLANZE Für die Hybridzüchtung müssen männlichen Blütenstände entfernt/ stillgelegt werden Abb. 2: Blüte einer Tomatenpflanze

5 5 WIE KANN MAN BLÜTEN MÄNNLICH STERILISIEREN? Variante 1: Manuelle Entfernung der männlichen Blütenstände Variante 2: Cytoplasmatisch männliche Sterilität (CMS) Variante 3: Herstellung transgener Pflanzen Einbringen von Barnase Barnase: aus dem Bakterium Bacillus amyloliquefaciens isolierte RNAse baut konkurrierende RNA ab

6 6 HERSTELLUNG DER TRANSGENEN TOMATENPFLANZE Material: Linien der Solanum lycopersicum L. Yellow tomato (Inzuchtlinie; zur Transformation genutzte Linie) L-30 (Inzuchtlinie; wird als männliche Pflanze genutzt und mit männlich sterilen Pflanzen gekreuzt) Barnase-Gen wird in zwei inaktive Komponenten gespalten (Bn-5 und Bn-3) Herstellung von zwei Vektoren (Vektor 1 mit Bn- 5 und Vektor 2 mit Bn-3) Transformation der Tomatenpflanze yellow tomato mittels Agrobacterium tumefaciens Hypothese: Kreuzung von Bn-5 transgenen Pflanzen mit Bn-3 transgenen Pflanzen = männlich sterile Pflanzen

7 7 HERSTELLUNG DER VEKTOREN mit Barnase-Gen (Bn-5/Bn-3), Bar-Gen und tapetumspezifischen Promotor (TA29) Abb. 3: Skizze der Vektoren für Bn-5 und Bn-3

8 8 TRANSFORMATION UND REGENERATION Transformation 1. Hypokotyle der Keimlinge wurden abgetrennt (=Explantate) 2. Explantate wurden für 12 Minuten in eine Lösung mit Agrobacterium tumefaciens eingetaucht Regeneration 1. Nach Tagen konnten herbizidresistente Knospen gewonnen werden 2. Wurden zur Regeneration auf ein spezielles Medium aufgetragen Transgene Pflanzen wurden mithilfe von Northern Blot und Southern Blot identifiziert

9 REGENERATION UND NACHWEIS TRANSGENER PFLANZEN Etwa 3000 Hypokotyle wurden als Explantate genutzt Southern Blot Analyse: 13 transgene Bn-5 Knospen mit Herbizidresistenz, davon 11 mit Hinweis auf

entsprechenden transgenen Linien integriert Regeneration: Die transgenen Pflanzen(T0) mit Hinweis auf Barnase wurden, nachdem die Wurzelkeimung auf einem Keimmedium veranlasst wurde, in ein

9 9 REGENERATION UND NACHWEIS TRANSGENER PFLANZEN Etwa 3000 Hypokotyle wurden als Explantate genutzt Southern Blot Analyse: 13 transgene Bn-5 Knospen mit Herbizidresistenz, davon 11 mit Hinweis auf Barnase (B5-1, B5-2, B5-3 B5-11) 12 transgene Bn-3 Knospen mit Herbizidresistenz, davon 10 mit Hinweis auf Barnase (B3-1, B3-2, B3-3 B3-10) Bn-5 und Bn-3 Fragment wurde in das Genom der entsprechenden transgenen Linien integriert Regeneration: Die transgenen Pflanzen(T0) mit Hinweis auf Barnase wurden, nachdem die Wurzelkeimung auf einem Keimmedium veranlasst wurde, in ein Gewächshaus umgepflanzt Abb. 4: Southern Blot Analyse der transgenen Pflanzen. A: Bn-3 transgene Pflanzen (CK=Kontrolle durch nicht-transgene Pflanze, 1-12=herbizidresistente Knospen B: Bn-5 transgene Pflanzen (CK, 1-13 vgl. oben) Einleitung Methode Ergebnisse

10 10 BLÜTENMORPHOLOGIE Es gab keine auffälligen morphologischen Unterschiede zwischen nicht-transgenen und transgenen Pflanzen Alle transgenen Pflanzen (T0) waren in der Lage, sich selbst zu bestäuben, sodass normale Früchte entstanden sind =Nachkommen (T1) Abb. 5: Vergleich von Wildtyp und transgenen Pflanzen Einleitung Methode Ergebnisse

11 POLLENVITALITÄT Pollenkörner von T0 und T1 Pflanzen sind rot, die Keimungsrate beträgt 95% (Bild 1-6 in der Abbildung) Hohe Keimungsrate lässt

11 11 POLLENVITALITÄT Pollenkörner von T0 und T1 Pflanzen sind rot, die Keimungsrate beträgt 95% (Bild 1-6 in der Abbildung) Hohe Keimungsrate lässt darauf schließen, dass die Transformation keinen nachteiligen Effekt auf die Vitalität der Polen hat Abb. 6: Vergleich von Wildtyp und transgenen Pflanzen

12 12 KREUZUNG TRANSGENER PFLANZENLINIEN Hypothese: Bn-5 transgene Pflanze x Bn-3 transgene Pflanze = Nachkommen sind männlich steril Herbizidresistente Nachkommen (T1) wurden zur Analyse gekreuzt Alle möglichen Kombinationen wurden im Gewächshaus gepflanzt, fertile Pflanzen wurden nach der Blüte aussortiert Ergebnis: viele männlich sterile Pflanzen, allerdings unterschiedliche Anzahl in den Kombinationen

13 13 KREUZUNG TRANSGENER PFLANZENLINIEN Abb. 7: Ergebnisse der PCR-Analyse der Kreuzungen zwischen Bn-5 und Bn-3 Pflanzen der T1 Generation (Genotyp)

14 KREUZUNG TRANSGENER PFLANZENLINEN PCR: Männlich sterile Pflanzen wurden mittels Barnase und Bar Primern identifiziert Alle männlich sterilen Pflanzen beinhalten das Barnase Gen

14 14 KREUZUNG TRANSGENER PFLANZENLINEN PCR: Männlich sterile Pflanzen wurden mittels Barnase und Bar Primern identifiziert Alle männlich sterilen Pflanzen beinhalten das Barnase Gen Fertile Pflanzen ohne Barnase und ohne Bar Gen Northern Blot: Barnase Gen wird nur in männlich sterilen Pflanzen exprimiert Abb: 8: PCR Analyse (oben) und Northern Blot Analyse (unten)

WIEDERHERSTELLUNG DER FERTILITÄT 15 Inzuchlinien ( yellow tomato / L-30 ) x männlich sterilen Pflanzen (Ms-1/ Ms-2) Ms-1= F1 von B3-1-1 x B5-1-1 Ms-2= F1 von B5-4-1 x B3-7-1 Ergebnis der Analyse Alle

15 WIEDERHERSTELLUNG DER FERTILITÄT 15 Inzuchlinien ( yellow tomato / L-30 ) x männlich sterilen Pflanzen (Ms-1/ Ms-2) Ms-1= F1 von B3-1-1 x B5-1-1 Ms-2= F1 von B5-4-1 x B3-7-1 Ergebnis der Analyse Alle Pflanzen produzierten Früchte mit Samen Pollenkeimung aller F1 Pflanzen >90% PCR-Analyse: 50% der F1-Generation mit Bn-5 Gen und 50% mit Bn-3 Gen, keine Pflanze mit vollständigem Barnase Gen Kreuzung einer Inzuchtlinie mit männlich steriler Pflanze erzeugt fertile Nachkommen Abb. 9: Früchte und Samen der F1 Generation

16 16 AUSBILDUNG DES HETEROSISEFFEKTS Abb. 10: Pollenvitalität der F1-Generation und Co-Segregation von Bn-5 und Bn-3 Abb. 11: Vergleich des Heterosiseffekts

17 17 KREUZUNG TRANSGENER PFLANZENLINIEN UND WIEDERHERSTELLUNG DER FERTILITÄT Abb. 12: Prinzip der Herstellung männlicher Sterilität und fertiler Nachkommen durch Nutzung des Zwei-Komponenten-Barnase-Systems

18 NOCH FRAGEN?

19 QUELLENVERZEICHNIS Cao, B.H., Wei, X.S., Lei, J.J., Xiao, X., and Chen, Q.H. (2012): Inducing male sterility of tomato using two component system. Plant Cell Tissue and Organ Culture.111: Kempken, F. & Kempken, R. (2012): Gentechnik bei Pflanzen. Chancen und Risiken. Berlin Heidelberg: Springer Verlag ( , 17:43 Uhr) ( , 18:32 Uhr)

20 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 1: ( , 14:27 Uhr) Abb. 2: ( , 15:03 Uhr) Abb. 3-12: Cao, B.H., Wei, X.S., Lei, J.J., Xiao, X., and Chen, Q.H. (2012): Inducing male sterility of tomato using two component system. Plant Cell Tissue and Organ Culture.111:

21 DANKE FÜR EURE AUFMERKSAMKEIT!

Ähnliche Dokumente

Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik Dr. Maik Böhmer Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen Schlossplatz 7 Schwerpunkte: Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der Gentechnik Vorlesung 2: