Monoklonale Antikörper

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1 J.H.Peters H.Baumgarten M.Schulze Monoklonale Antikörper Herstellung und Charakterisierung Unter Mitwirkung von F. Bieber W Gerlich E.Hempelmann Th.Werfel Mit 32 Abbildungen FACHBEREICH BIOLOGIE (10) der Technischen Hochschule-Darmstod» - Brbliothek - D-6100 Darmstadt / B. R. D. Inv.-Nr.j5-A Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York Tokyo

2 Inhaltsverzeichnis 1 GRUNDLAGEN* 1.1 Grundlagen der Zellhybridisierung von Hybridomen und Selektion für die Herstellung monoklonaler Antikörper - J.H. Peters 3 2. IMMUNISIERUNG 2.1 Prinzipien und Strategien der Immunisierung M. Schulze Immunisierung von Mäusen zur Herstellung monoklonaler Antikörper J.H. Peters, M. Schulze Blutentnahme und Serumgewinnung bei der Maus H. Baumgarten, M. Schulze 25 3 ZELLFUSION 3.1 Präparation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten J.H. Peters Zellfusion zur Herstellung.von monoklonalen Antikörpern der Maus J.H. Peters Gefrierkonservierung von Zellen unmittelbar nach der Fusion J.H. Peters Gefrierkonservierung von Hybridomen in Zellkulturplatten M. Schulze 44

3 X 4 KLONAUSBEUTE UND. NOMENKLATUR 4.1 Berechnung der zu erwartenden Zahl von Hybridomklonen J.H. Peters Arbeitsbezeichnung und Benennung von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten OPTIMIERUNG DER KULTURBEDINGUNGEN 5.1 Zellkulturbedingungen für die Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters Fehlersuche bei der Herstellung und Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters, Konditioniertes Medium aus humanen Nabelschnur- Endothelzellen J.H. Peters 72 6 KONTROLLE VON ZELLKULTUREN <6.1 Fluoreszenztest zur Vitalitätsbestimmung von Zellen J.H. Peters Vitalitäts- und Aktivitäts-Bestimmung von Zellen (MTT-Test) J.H. Peters, H-. Baumgarten Bestimmung, von zellulärem Protein H. Baumgarten R4 7 ERKENNUNG UND BEHANDLUNG VON INFEKTIONEN 7.1 Bakterien- und Pilzinfektionen^" " J.H. Peters Eingrenzen einer Infektion in einer Kulturschale mit mehreren Näpfen J.H. Peters Fluoreszenztest zum Nachweis von Mykoplasmen-Infektionen adhärenter und suspendierter Zellen J.H. Peters Reinigung Mykoplasmen-infizierter Zellen durch Kokulturen mit Makrophagen J.H. Peters 102

4 XI 8 NACHWEISE VON ANTIGENSPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN 8.1 Wahl des Testsystems zur Identifikation antigenspezifischer Klone M. Schulze " Immunoassays zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen lösliche Proteine M. Schulze Direkter und indirekter ELISA zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen lösliche Antigene H. Baumgarten, M. Schulze ELISA zum Nachweis von Maus-Immunglqbulin G (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten Bestimmung der Immunglobulin-Subklasse von monoklonalen Antikörpern M. Schulze " Wahl des Testsystems zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen zelluläre Antigene H. Baumgarten Immunfluoreszenznachweis von Membranantigenen vitaler Leukozyten (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten Immunfluoreszenz-Nachweis von membrangebundenen und intrazytoplasmatischen Immunglobulinen H. Baumgarten Immunzytochemischer Nachweis von zellulären Antigenen mit,der Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP) Methode H. Baumgarten..: Tüpfel-Test zum Nachweis von Änti-Zellmembran Antikörpern H. Baumgarten..'^rr; MASSENPRODUKTION VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 9.1 Kriterien für die Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in Zellkultur oder Aszites M. Schulze Massenzellku-ltur" zur Produktion von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten 1 70

5 XII 9.3 Zubereitung von serumfreiem Iscove-Medium für Hybridomkulturen H. Baumgarten Kultivierung von Hybridomen bei erniedrigter Temperatur ~~~H. Baumgarten,, J.H. Peters Produktion von monoklonalen Antikörpern in Maus- Aszites H. Baumgarten REINIGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 10.1 Reinigung von monoklonalen Antikörpern M. Schulze Ammoniumsulfatfällung monoklonaler IgG-Antikörper aus Hybridpmaszites M. Schulze, E. Hempelmann', Protein A-Sepharose Säulen-Chromatographie H. Baumgarten Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung monoklonaler IgG-Antikörper M. Schulze MARKIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 11.1 Konjugation monoklonaler Antikörper mit Peroxidase W. Gerlich, M... Schulze Biotinylierung monoklonaler Antikörper F. Bieber CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER 'ANTIKÖRPER ' 12.1 Affinitätskonstanten-Bestimmung "~ H. Baumgarten ' Epitop-Analyse H. Baumgarten PROTEIN-ANALYTIK 13.1 Analytische SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) E. Hempelmann 227

6 XIII 13.2 Polychromatische Silberfärbung E. Hempelmann Protein-Blotting E. Hempelmann ; "* Glykoprotein-Nachweis mit Schiffs Reagenz E. Hempelmann Isoelektrische Fokussierung H. Baumgarten, Th. Werfel ANHANG 14.1 Firmenanschriften Sachverzeichnis 261