Monoklonale Antikörper

Transkript

1 Hochschultext

2 J. H. Peters H. Baumgarten M. Schulze Monoklonale Antikörper Herstellung und Charakterisierung Unter Mitwirkung von F. Bieber W Gerlieh E. Hempelmann Th.Werfel Mit 32 Abbildungen Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH

3 Professor Dr. JoHANN HINrucH PETERS Dr. HORST BAUMGARTEN Dr.MATTHIAS SCHULZE Abteilung ftir Immunologie Zentrum ftir Hygiene und Humangenetik der Georg-August-Universität Kreuzbergring 57 D-3400 Göttingen ISBN DOI / ISBN (ebook) C1P-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek Peters, Johann H.: Monoklonale Antikörper: Herstellung u. Charakterisierung/ J. H. Peters; H. Baumgarten; M. Schulze. Unter Mitw. von F. Bieber... - Berlin; Heidelberg; NewYork; Tokyo: Springer, 1985 (Hochschultext) ISBN NE: Baumgarten, Horst:; Schulze, Matthias: Das Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begrundeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, der Entnahme von Abbildungen, der Funksendung, der Wiedergabe aufphotomechanischem Wege und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Die Vergütungsanspruche des 54, Abs.2 UrhG werden durch die, Verwertungsgesellschaft Wort', München, wahrgenommen. by Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1985 Ursprunglieh erschienin bei Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1985 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigen auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten Wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewähr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vomjeweiligen Anwender im Einzelfall anband anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überpruft werden

4 Vorwort Die Herstellung monoklonaler Antikörper (mak) gehört heute zu den Standardmethoden in immunologisch arbeitenden Laboratorien. Mehr und mehr hält sie aber auch Einzug in die anderen Biowissenschaften. Ihre Anwendung beschränkt sich nicht mehr allein auf die Forschung, monoklonale Antikörper haben die Diagnostik revolutioniert und sind auch als wirtschaftlicher Faktor nicht mehr fortzudenken. Die Entdecker dieser Technik, G. Köhler und C. Milstein, sind 1984 für diese epochale Entdeckung mit dem Nobelpreis ausgezeichnet worden. Nach der Phase der Entdeckung und des Umbruchs macht jede Disziplin eine Phase der Systematisierung und Standardisierung durch. Am Ende dieser Phase ist aus einer Technik, die anfangs nur mit künstlerischem Geschick beherrscht werden konnte, eine lehr- und lernbare Technik geworden. Wir selbst haben beim Aufbau dieser Technik versucht, die Einzelschritte so weit als möglich und nötig zu systematisieren und zu optimieren. Nachdem wir praktisch jeden Schritt in der Kette experimenteller Einzelschritte optimiert hatten, stellte sich heraus, daß dies zu einer sehr viel höheren (1-2 Größenordnungen) Klonausbeute führte, als bisher in der Literatur beschrieben worden war. Die Gesellschaft für Immunologie hat es sich zur Aufgabe gemacht, diese Technik einem größeren Kreis von Interessenten zu vermitteln. Auf ihre Anregung hin führen wir dazu dazu jährlich einen Kurs an der Abteilung für Immunologie der Universität Göttingen durch. Da das Kursmanuskript inzwischen zu einem beliebten Kopierobjekt geworden ist, haben wir uns entschlossen, es auszubauen und durch eine Buchveröffentlichung allgemein zugänglich zu machen. Gegenüber dem Kursmanuskript ist das hier vorliegende Buch sowohl durch eine Reihe von Übersichtskapiteln und Anleitungen zur Fehlersuche und -beseitigung als auch durch viele ergänzende Methodenbeschreibungen erweitert worden. Diese Arbeitsanleitungen sind im Stil eines "Kochbuchs" abgefaßt: Jede Methodenbeschreibung ist in sich abgeschlossen. Das Buch wendet sich an Leser, die bereits Erfahrungen mit der Zellkultur und mit immunologischen Techniken besitzen. Zum Aufbau der Hybridomtechnik sind einige Labor-Voraussetzungen notwendig:

5 VI Es muß ein Tierstall vorhanden sein, für die Zellkultur muß ein funktionierendes Zellkultur-Labor vorhanden sein, das nicht nur mit Sterilbank, Begasungs-Brutschrank, Zentrifuge, Umkehr-Phasenkontrast-Mikroskop sowie Fluoreszenz-Mikroskop, sondern auch mit einer auf Zellkultur-Bedürfnisse eingestellten Spülküche ausgestattet ist. Immunologische Nachweismethoden müssen vorhanden sein oder aufgebaut werden, schließlich müssen proteinchemische Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung des spezifischen Antikörpers und zur Charakterisierung des Antigens zur Verfügung stehen: Erst dadurch kann man den Hauptvorteil der mak, die Bereitstellung eines reinen Immun-Reagens, nutzbar machen. Das Buch kann jedoch nicht vollständig die gesamte Technik der Herstellung monoklonaler Antikörper abhandeln: es beschränkt sich auf die Darstellung von Maus-mAk. Ratten-mAk können analog mit gutem Erfolg hergestellt werden (Clark et al 1983). Die Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper erfordert jedoch vollständig andere Strategien und Methoden. Da sie erfolgreich bisher nur in wenigen Labors gelingt, scheint sie noch nicht das Stadium der Vermittelbarkeit durch Lehrbücher erreicht zu haben. Aus den vielen beschriebenen Methoden zur Herstellung von MausmAk trifft dieses Buch eine Auswahl von erprobten Techniken, die für den Einstieg in die Hybridomtechnik besonders geeignet sind und auf die dann weiter aufgebaut werden kann. Tests bis hin zur Zytochemie wurden miniaturisiert und auf das Mikrotitersystem adaptiert, so daß große Probenzahlen mit relativ geringen Mengen von Reagenzien bearbeitet werden können. Der Leser darf die Sicherheit haben, daß alle aufgeführten Methoden bei uns praktisch erprobt worden sind. Dennoch können sich Fehler eingeschlichen haben: Für Hinweise auf Fehler und für Ergänzungsvorschläge sind wir dankbar. Der Leser wird weiterhin entdecken, daß viele der beschriebenen Methoden auch für andere Bereiche der biomedizinischen Forschung nützlich sind, und daß das Buch für alle Stadien der mak-herstellung Tricks und neue Möglichkeiten aufzeigt, die noch nicht anderweitig zu lesen sind. Eine Reihe der Techniken oder technischen Details sind somit Originalmitteilungen, auch wenn dies nicht immer ausdrücklich erwähnt worden ist. Die Methodenbeschreibungen enthalten genaue Produkt- und Firmenangaben. Diese Angaben gelten insofern, als wir die Reagenzien selbst erprobt haben. Sie besagen nicht, daß ein nicht aufgeführtes Konkurrenzprodukt nicht ebenso gut oder besser ist. Insofern erheben unsere Angaben keinen Anspruch auf Vollständigkeit. Bisweilen haben wir der Firma ein "z.b." vorangestellt, um damit anzudeuten, daß dieses Produkt in vermutlich gleicher Qualität auch bei vielen anderen Firmen zu erhalten ist. Wir danken vielen Genannten und Ungenannten für Ratschläge und Diskussionen, nicht zuletzt auch den Teilnehmern unserer Kurse. Der Initiative von Herrn Prof. Dr. o. Götze als Mitglied der Fortbildungskommission der Gesellschaft für Immunologie ist das Zustandekommen des Kurses vor allem zu verdanken. Die Firma Nunc

6 VII GmbH in Wiesbaden hat sich um die Verbreitung des Scripturns verdient gemacht, der Firma Biochrom KG in Berlin danken wir für die Bereitstellung von Serumchargen. Frau Friederike Uhde, Frau Dorothea Fey und Herrn Detlef Friedrichs danken wir für ihre unermüdliche Mitarbeit. Dr. Margarethe Borg, cand. med. Angelika Fischer, Prof. Dr. M. Gahr, Dr. H. Lemke, Prof. R. Maurer und Dr. Friederike Schulze haben das Manuskript durchgesehen, Frau S. Soppa die Graphiken erstellt. Ihr und den Kollegen der Foto Repro-Abteilung des Klinikums danken wir für Fotos und Reproduktionen. Das Manuskript wurde auf Osborne 1-DQD mit WardStar Textverarbeitung geschrieben. Literatur Clark M, Cobbold S, Hale G, Waldman H (1983) Advantages of rat monoclonal antibodies. Immunol today 4:

7 Inhaltsverzeichnis GRUNDLAGEN 1.1 Grundlagen der Zellhybridisierung von Hybridomen und Selektion für die Herstellung rnonoklonaler Antikörper J.H. Peters IMMUNISIERUNG 2.1 Prinzipien und Strategien der Immunisierung M. Schulze Immunisierung von Mäusen zur Herstellung monoklonaler Antikörper J.H. Peters, M. Schulze Blutentnahme und Serumgewinnung bei der Maus H. Baumgarten, M. Schulze ZELLFUSION 3.1 Präparation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten J.H. Peters Zellfusion zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Maus J.H. Peters Gefrierkonservierung von Zellen unmittelbar nach der Fusion J.H. Peters Gefrierkonservierung von Hybridomen in Zellkulturplatten M. Schulze... 44

8 X 4 KLONAUSBEUTE UND NOMENKLATUR 4.1 Berechnung der zu erwartenden Zahl von Hybridomklonen J.H. Peters Arbeitsbezeichnung und Benennung von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten OPTIMIERUNG DER KULTURBEDINGUNGEN 5.1 Zellkulturbedingungen für die Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters Fehlersuche bei der Herstellung und Aufzucht von Hybridomen J.H. Peters Konditioniertes Medium aus humanen Nabelschnur Endothelzellen J.H. Peters KONTROLLE VON ZELLKULTUREN 6.1 Fluoreszenztest zur Vitalitätsbestimmung von Zellen J.H. Peters Vitalitäts- und Aktivitäts-Bestimmung von Zellen (MTT-Test) J.H. Peters, H. Baumgarten Bestimmung von zellulärem Protein H. Baumgarten... R4 7 ERKENNUNG UND BEHANDLUNG VON INFEKTIONEN 7.1 Bakterien- und Pilzinfektionen J.H. Peters Eingrenzen einer Infektion in einer Kulturschale mit mehreren Näpfen J.H. Peters Fluoreszenztest zum Nachweis von Mykoplasmen-Infektionen adhärenter und suspendierter Zellen J.H. Peters Reinigung Mykoplasmen-infizierter Zellen durch Kokulturen mit Makrophagen J.H. Peters

9 XI 8 NACHWEISE VON ANTIGENSPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN 8.1 Wahl des Testsystems zur Identifikation antigenspezifischer Klone M. Schulze Immunoassays zum Nachweis von monoklonalen Antikbrpern gegen lbsliche Proteine M. Schulze Direkter und indirekter ELISA zum Nachweis von monoklonalen Antikbrpern gegen lbsliche Antigene H. Baumgarten, M. Schulze ELISA zum Nachweis von Maus-Immunglo.bul in G (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten Bestimmung der Immunglobulin-Subklasse von monoklonalen Antikbrpern M. Schulze Wahl des Testsystems zum Nachweis von monoklonalen Antikörpern gegen zelluläre Antigene H. Baumgarten Immunfluoreszenznachweis von Membranantigenen vitaler Leukozyten (Biotin-Streptavidin System) H. Baumgarten Immunfluoreszenz-Nachweis von membrangebundenen und intrazytoplasmatischen Immunglobulinen H. Baumgarten Immunzytochemischer Nachweis von zellulären Antigenen mit der Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP) Methode H. Baumgarten Tüpfel-Test zum Nachweis von Anti-Zellmembran Antikbrpern H. Baumgarten MASSENPRODUKTION VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 9.1 Kriterien für die Massenproduktion von monoklonalen Antikbrpern in Zellkultur oder Aszites M. Schulze Massenzellkultur zur Produktion von monoklonalen Antikörpern H. Baumgarten

10 XII 9.3 Zubereitung von serumfreiem Iscove-Medium für Hybridomkulturen H. Baumgarten Kultivierung von Hybridomen bei erniedrigter Temperatur H. Baumgarten, J.H. Peters Produktion von monoklonalen Antikbrpern in Maus- Aszi tes H. Baumgarten REINIGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN Reinigung von monoklonalen Antikbrpern M. Schulze Ammoniumsulfatfällung monoklonaler IgG-Antikbrper aus Hybridomaszites M. Schulze, E. Hempelmann Protein A-Sepharose Säulen-Chromatographie H. Baumgarten Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung monoklonaler IgG-Antikbrper M. Schulze MARKIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN Konjugation monoklonaler Antikbrper mit Peroxidase W. Gerlich, M. Schulze Biotinylierung monoklonaler Antikbrper F. Bieber CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER Affinitätskonstanten-Bestimmung H. Baumgarten Epitop-Analyse H. Baumgarten PROTEIN-ANALYTIK Analytische SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) E. Hempelmann

11 XIII Polychromatische Silberfärbung E. Hempelmann Protein-Blotting E. Hempelmann Glykoprotein-Nachweis mit Schiff's Reagenz E. Hempelmann Isoelektrische Fokussierung H. Baumgarten, Th. Werfel ANHANG Firmenanschriften Sachverzeichnis