Gebrauchsanweisung Life Science Kits & Assays
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- Victor Fürst
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1 Gebrauchsanweisung Life Science Kits & Assays
2 Bestellnummer: Reaktionen Ausgabe: Manual_hTAU total ELISA_d_rev14 Dieses Dokument beschreibt den Status zum Zeitpunkt der Veröffentlichung und muss nicht zwingend mit zukünftigen Versionen übereinstimmen. Änderungen vorbehalten! Ausdruck und Weiterverwendung mit Quellenangabe gestattet. Copyright 2017, Analytik Jena AG, AJ Roboscreen GmbH Hersteller: AJ Roboscreen GmbH Hohmannstraße Leipzig Made in Germany! Telefon Fax Herausgeber: Analytik Jena AG Konrad-Zuse-Straße Jena Deutschland info@analytik-jena.com
3 Einleitung Inhalt 1 Einleitung Zweckbestimmung Gewährleistung und technische Hilfe Hinweise für den Gebrauch der Gebrauchsanweisung Sicherheitshinweise Testprinzip Leistungsbewertung Komponenten des Tests Vorbereitung der Komponenten X Waschpufferlösung Standards D3.1 - D Kontrollen D7 und D HRP-Konjugat Lagerung und Verfallsdatum Nicht im Kit enthaltene Komponenten Durchführungshinweise Probengewinnung und -aufbewahrung Probengewinnung Probenlagerung Probenverdünnung Testablauf Datenanalyse Qualitätskriterien des Tests Berechnung der unbekannten Tau-Konzentration Erwartungswerte htau total ELISA Rev 14 1
4 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Zweckbestimmung Der htau total ELISA ist ein Enzymimmuntest für die quantitative Bestimmung von Tau in Rückenmarksflüssigkeit (CSF) des Menschen zur Unterstützung der Diagnose einer Alzheimer-Erkrankung. Die Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung (AD) ist durch drei Stadien charakterisiert, die durch das US National Institute on Aging workgroups definiert wurden als: ein präklinisches Stadium der AD, das Stadium mit mild-kognitiven Störungen aufgrund AD und das dementielle Stadium aufgrund AD. Die Messung von Tau zeigt im Vergleich zu anderen verfügbaren diagnostischen Tests eine mindestens ebenso hohe diagnostische Spezifität und Sensitivität für die Bestätigung einer Alzheimer-Erkrankung. 1.2 Gewährleistung und technische Hilfe Der Hersteller garantiert die korrekte Funktion des Tests bei der Durchführung nach Gebrauchsanweisung. Während des Gewährleistungszeitraums erbringt der htau total ELISA präzise und reproduzierbare Daten, in Verbindung mit einer hervorragenden Sensitivität. Gewährleistung wird nur bei Einhaltung der Prinzipien der guten Laborpraxis (GLP) und der Hinweise des Herstellers gegeben. Für die Verbesserung der Anwendung oder des Designs behält sich Analytik Jena AG das Recht auf Austausch oder Änderung des Tests vor. Der Hersteller kann jederzeit hinsichtlich technischer Unterstützung zur Quantifizierung des Tau in CSF kontaktiert werden. GEBRAUCHSHINWEISE BEACHTEN Diese Gebrauchsanweisung muss vor Anwendung des Tests sorgfältig gelesen werden. Den Gebrauchshinweisen ist entsprechend zu folgen. Bei Abweichung von den Gebrauchshinweisen können zuverlässige Ergebnisse nicht garantiert werden. 2 Rev 14 htau total ELISA
5 Einleitung 1.3 Hinweise für den Gebrauch der Gebrauchsanweisung Für die vereinfachte Darstellung und bessere Orientierung verwendet diese Gebrauchsanweisung die folgenden Symbole: Referenz Katalognummer N Inhalt Enthält ausreichend Reagenzien für <N> Tests Lagerungstemperaturbereich Gebrauchshinweise beachten Haltbarkeitsdatum Hergestellt durch Für den einmaligen Gebrauch Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: AD CSF CV ELISA GLP HRP OD RT TMB Alzheimer s disease (Alzheimer-Erkrankung) Cerebrospinal fluid (Rückenmarksflüssigkeit) Coefficient of variation (Variationskoeffizient) Enzyme-linked immunosorbent assay (Enzymimmuntest) Good Laboratory Practice (Gute Laborpraxis) Horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) Optische Dichte Raumtemperatur (18-25 C) Tetramethylbenzidine htau total ELISA Rev 14 3
6 Sicherheitshinweise 2 Sicherheitshinweise Wir empfehlen, vor Verwendung des Tests, dieses Kapitel sorgfältig zu lesen, um die Sicherheit des Anwenders und eine fehlerfreie Anwendung zu gewähren. Alle Sicherheitshinweise und zusätzliche Informationen dieser Gebrauchsanweisung müssen jederzeit eingehalten werden. Lesen Sie die Gebrauchshinweise vollständig und stellen Sie sicher, dass Sie alles verstanden haben, bevor Sie den Test verwenden. Informieren Sie den entsprechenden Lieferanten innerhalb einer Woche nach Erhalt des Tests schriftlich, wenn der Test substantielle Schäden aufweist. Zerstörte Komponenten dürfen nicht für die Testdurchführung verwendet werden, sollten aber aufbewahrt werden bis die Gründe der Transportschäden geklärt sind. Halten sie die Regeln der Guten Laborpraxis und die Sicherheitshinweise ein. Benutzen Sie Laborkleidung, Einmalhandschuhe und Schutzbrillen immer, wenn deren Anwendung notwendig ist. Reagenzien des Tests, die gefährliche Substanzen enthalten, können zu Schädigungen der Augen und der Haut führen. Beachten Sie die Hinweise unter KOMPONENTEN DES TESTS und auf den Etiketten. Bei Bedarf sind Sicherheitsdatenblätter des Produktes verfügbar. Alle Reagenzien sollten als gefährlicher Abfall und in Übereinstimmung mit den nationalen Vorschriften gehandhabt werden. Reinigungspersonal muss hinsichtlich der potentiellen Risiken und des Umgangs mit diesen Substanzen durch kompetente Personen eingewiesen werden. Vermeiden Sie jeden direkten Kontakt mit der Stopplösung, diese kann die Haut schädigen und zu Verätzungen führen. 4 Rev 14 htau total ELISA
7 Sicherheitshinweise NUR ZUM EINMALGEBRAUCH! Der Test ist nur zum Einmalgebrauch bestimmt! ACHTUNG! Keine Komponenten des Produktes essen oder trinken! Der Tests sollte nur durch erfahrenes Laborpersonal und in einer Laborumgebung verwendet werden! htau total ELISA Rev 14 5
8 Testprinzip 3 Testprinzip Dieser Test verwendet einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch die Aminosäuren des humanen Tau-Proteins erkennt und an die Oberfläche der Mikrotiterplatte immobilisiert wurde. Tau-Protein aus Proben, Standards und Kontrollen wird durch diesen Antikörper gefangen, gefolgt vom Nachweis durch einen weiteren HRP-konjugierten monoklonalen Antikörper, der spezifisch die Aminosäuren des human Tau-Protein bindet. Die Menge des gebundenen konjugierten Antikörpers wird durch Verwendung des Färbesubstrates Tetramethylbenzidine (TMB) bestimmt. Die Konzentration an Tau-Protein ist proportional zur gemessenen optischen Dichte. 1. Gebrauchsfertig: Fangantikörper beschichtet in den Kavitäten der Platte. 2. Binden des humanen Tau-Proteins durch den Fangantikörper. 3. Nachweis des gebundenen Tau durch HRP-konjugierten Antikörper spezifisch für humanes Tau- Protein. 6 Rev 14 htau total ELISA
9 Leistungsbewertung 4 Leistungsbewertung Die Tabelle zeigt typische Daten der Standardkurve nur beispielhaft und nicht zur Kalkulation anwendbar. Standard Tau (pg/ml) OD mean OD/OD max (%) D , D ,664 54,1 D ,747 24,3 D ,333 10,8 D ,245 7,8 D ,149 4,8 Die Tabelle stellt die ermittelte Sensitivität und Spezifität im Verhältnis zu dem bestimmten Cut-Off dar. Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze) 25 pg/ml Mittelwert der OD der Negativkontrolle (BLANK) + 3 x SD Cut-Off 399 pg/ml Jedes Labor muss ein eigenes Cut-Off-Level ermitteln. Klinische Sensitivität 86 % AD/MCI-Patienten (n=58) Klinische Spezifität 100 % Kontrollpatienten (n=42) htau total ELISA Rev 14 7
10 Leistungsbewertung Ermittlung signifikanter Differenzen (p<0,001) der Konzentration an Tau-Protein mittels htau total ELISA zwischen CSF-Proben von Patienten mit Alzheimer- Erkrankung (n=58) und Kontrollpatienten (n=42). 8 Rev 14 htau total ELISA
11 Komponenten des Tests 5 Komponenten des Tests Komponente 96 Beschreibung Mikrotiterplatte D1 40X Waschpuffer D2 12 x 8 Beschichtete Immunstrips, die Anti-Tau- Antikörper enthalten, blockiert und stabilisiert sind. Gebrauchsfertig. 1 x 50 ml 40X Waschpuffer enthält PBS, Detergenz und Proclin 300. Standards 6 x 3 Lyophilisierte Tau-Standards (STD) zur Herstellung einer Standardkurve für die Quantifizierung von Tau in unbekannten CSF-Proben. Enthalten PBS, Protein und Proclin 300. D pg Tau D pg Tau D pg Tau D pg Tau D pg Tau D pg Tau Negativkontrolle D4 15X HRP- Konjugat D5 Verdünnungspuffer D6 1 ml Negativkontrolle (BLANK), enthält PBS, Protein, Detergenz und Proclin 300. Gebrauchsfertig. 1 ml Monoklonaler Anti-Tau-Antikörper konjugiert mit Meerrettichperoxidase, 15X-Konzentrat, enthält PBS, Protein, Detergenz und Proclin ml Verdünnungspuffer enthält PBS, Protein, Detergenz und Proclin 300. Gebrauchsfertig. htau total ELISA Rev 14 9
12 Komponenten des Tests Komponente 96 Beschreibung Kontrolle hoch D7 Kontrolle niedrig D8 Färbelösung D9 3 Tau Hoch-Positivkontrolle (CTRL), enthält PBS, Protein und Proclin Tau Niedrig-Positivkontrolle (CTRL), enthält PBS, Protein und Proclin ml TMB/Peroxid-Lösung. Gebrauchsfertig. Stopplösung D10 25 ml 1 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. Klebefolie 2 Gebrauchsanweisung 1 10 Rev 14 htau total ELISA
13 Vorbereitung der Komponenten 6 Vorbereitung der Komponenten 6.1 1X Waschpufferlösung Verdünnung des 40X Waschpuffers D2 unter Verwendung von deionisiertem oder bi-destilliertem Wasser vor Durchführung des ersten Waschschrittes im Testablauf. Volumen an 1X Waschpuffer Volumen an 40X Waschpuffer D2 Volumen an deionisiertem oder bi-destilliertem Wasser 400 ml 10 ml 390 ml 600 ml 15 ml 585 ml 800 ml 20 ml 780 ml 1000 ml 25 ml 975 ml 6.2 Standards D3.1 - D3.6 Zugeben von 1,0 ml Verdünnungspuffer D6 zu jedem Standardröhrchen D3.1 D3.6 und kurzes Mischen z. B. für 2 s mittels Vortexer. 6.3 Kontrollen D7 und D8 Zugeben von 1,0 ml Verdünnungspuffer D6 zu jedem Kontrollröhrchen D7 und D8 und kurzes Mischen z. B. für 2 s mittels Vortexer. htau total ELISA Rev 14 11
14 Vorbereitung der Komponenten 6.4 HRP-Konjugat Verdünnung des 15X HRP-Konjugates D5 im 1:15-Verhältnis unter Verwendung von Verdünnungspuffer D6. Mischen mittels Schütteln der Röhrchen. Anzahl der Immunstrips Volumen an 15X HRP D5 Volumen an Verdünnunsgpuffer D ,3 ml 4,2 ml 5 8 0,6 ml 8,4 ml ,9 ml 12,6 ml 12 Rev 14 htau total ELISA
15 Lagerung und Verfallsdatum 7 Lagerung und Verfallsdatum Der Test wird bei Umgebungstemperatur geliefert und sollte anschließend bei 6 ± 4 C gelagert werden. Der Test ist vor Hitze und direktem Sonnenlicht zu schützen. Unter diesen Bedingungen hat der Test eine, wie auf der Verpackung angegebene, Haltbarkeit bei gleichbleibender Leistungsfähigkeit und Stabilität. Die vorbereiteten und angebrochenen Komponenten haben folgende Haltbarkeiten: Komponente Vorbereitungsschritt Haltbarkeit D1 D2 D3.1-D3.6 Beschichtete Immunstrips nach Öffnung, Herausnehmen von Strips und Verschließen der Tüte. 1X Gebrauchsfertige Waschlösung. Standards D3.1-D3.6 aufgelöst in D6. Bei 6 ± 4 C bis zu 4 Wochen. Bei 6 ± 4 C bis zu 1 Woche. Bei 6 ± 4 C bis zu 4 h. D7, D8 Kontrollen D7 und D8 aufgelöst in D6. Bei 6 ± 4 C bis zu 4 h. D5 Gebrauchsfertiges HRP-Konjugat 1:15 verdünnt. Bei 6 ± 4 C bis zu 4 h. 8 Nicht im Kit enthaltene Komponenten Kalibrierte Mikroliterpipetten mit CV < 3%, Volumen: μl; μl. 8-Kanal Mikroliterpipette mit Reagenzreservoirs. Plattenschüttler rpm z. B. Rotamax 120. Vortexer. Automatischer oder Semiautomatischer ELISA-Plattenwascher. Bi-destilliertes oder de-ionisiertes Wasser. Zellstoff, Pipettenspitzen, Stoppuhr. ELISA-Platten-Reader mit Absorption bei 450 and 620 nm. Polypropylen-Röhrchen zur Probenverdünnung. htau total ELISA Rev 14 13
16 Durchführungshinweise 9 Durchführungshinweise Eine unsachgemäße Behandlung der Proben und Änderungen des Testablaufes können die Ergebnisse beeinflussen. Die angegebenen Volumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbehandlungsschritte müssen exakt eingehalten werden. Stellen Sie sicher, dass die benötigten Reagenzien, Materialien und Geräte vor der Durchführung vorbereitet sind. Die Färbelösung D9 sollte auf Raumtemperatur (21.5 ± 3.5 C) erwärmt sein. Verdünnungspuffer D6 und 15X-HRP-Konjugat D5 sollten vor Gebrauch gemischt werden. Schützen Sie Reagenzien, Pipetten, Immunstrips und Röhrchen vor Kontaminationen durch Verwendung von unterschiedlichen Einmalverbrauchsartikeln zwischen verschiedenen Proben und Komponenten. Verwenden Sie keine Kavität, kein Röhrchen oder Reagenz mehr als einmal. Es ist empfohlen, in Zweifachbestimmung zu Messen und ein Pipettierschema zu verwenden. 1X-HRP-Konjugatlösung, Färbelösung D9 und Stopplösung D10 sollten mit einer 8-Kanal-Pipette auf die Immunstrips übertragen werden. Gewaschen werden sollte mit 8-Kanal-Pipette oder ELISA-Platten- Wascher. Das Austrocknen oder Strapazieren der Immunstrips ist zu vermeiden das exakte Waschen aller Kavitäten sollte kontrolliert werden. 10 Probengewinnung und -aufbewahrung Die Alzheimer s Biomarker Standardization Initiative gibt die folgenden Empfehlungen für prä-analytische und analytische Aspekte der AD- Biomarkertestung in CSF (Vanderstichele et al., Standardization of preanalytical aspects of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: a consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimers Dement Jan;8(1):65-73). 14 Rev 14 htau total ELISA
17 Probengewinnung und -aufbewahrung 10.1 Probengewinnung Die Lumbalpunktion kann vertrebal zwischen Lendenwirbel L3-L5 beim sitzenden oder liegenden Patienten durchgeführt werden. Eine schmale (0,7 mm, 22 G), idealerweise nicht-traumatische Kanüle sollte verwendet werden. Schmale-Gauge-Kanülen hinterlassen kleinere Löcher in der Dura mater, was die Heilung unterstützt. Die Verwendung einer nichttraumatischen Kanüle reduziert die Gefahr einer Blutkontamination des/der CSF. Jedes Labor sollte nur Polypropylenröhrchen verwenden. Glas- oder Polystyrenröhrchen dürfen unter keinen Umständen verwendet werden. Röhrchen mit kleinstmöglichem Volumen sollten benutzt werden und mindestens zu 50% gefüllt werden. Es ist wichtig für jede Probe mit der Einlagerung alle Details zu erfassen, so dass bei jeder Verwendung eine präzise Probenhistorie existiert. Eine Zentrifugation ist nur bei visuell hämorrhagischen Proben notwendig. Die zügige Zentrifugation sollte bei 2000 x g und Raumtemperatur für 10 min erfolgen Probenlagerung Es wird empfohlen, die Proben bei -80 C einzufrieren und zu lagern. Es wird empfohlen, die Anzahl an Auftau- und Einfrierzyklen auf ein Maximum von 1-2 Mal einzuschränken. Proben sollten nicht länger als 2 Jahre gelagert werden. Hinweis Zur Verdünnung von CSF sind Polypropylenröhrchen zu verwenden. Alternativ kann die Verdünnung direkt auf der Immunplatte D1 erfolgen Probenverdünnung Für die genaue Bestimmung der Tau-Konzentration in CSF sind die Proben 1:4 mit Verdünnunsgpuffer D6 (1 Teil Probe und 3 Teile D6 z. B. 25 und 75 μl) vor Testbeginn zu verdünnen. Die Verwendung bekannter und vorgetesteter Polypropylenröhrchen wird empfohlen. Alternativ kann die htau total ELISA Rev 14 15
18 Probengewinnung und -aufbewahrung direkte Verdünnung im Immunstrip durch Übertragung von 75 μl D6 gefolgt von 25 μl je Probe pro Kavität erfolgen. Bei Proben, die eine höhere OD als die OD des höchsten Standards D3.1 zeigen, sollte eine höhere Verdünnung als 1:4 mit Verdünnungspuffer D6 erfolgen. 16 Rev 14 htau total ELISA
19 Testablauf 11 Testablauf 1. Je 100 μl Standards, Kontrollen, BLANK und vor-verdünnte Patientenproben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Alternativ 75 μl Verdünnungspuffer D6 pro Kavität, gefolgt von 25 μl Patientenprobe auftragen, und durch 2-3 maliges Pipettieren mischen. 2. Platte mit Deckel oder Klebefolie verschliessen und auf einem Plattenschüttler bei 150 rpm und RT für 2 h ± 10 min inkubieren. 3. Waschen der Platte 5 x mit 300 μl an 1X Waschlösung pro Kavität unter Nutzung eines automatischen ELISA-Platten-Waschers. 4. Je 100 μl 1X-HRP-Konjugat pro Kavität auftragen. 5. Verschließen der Platte mit Deckel oder Klebefolie und Inkubation bei RT für 90 min ± 10 min. 6. Waschen der Platte 5 x mit 300 μl an 1X Waschlösung pro Kavität unter Nutzung eines automatischen ELISA-Platten-Waschers. Hinweis Alternativ können bei manueller Durchführung das Ausschütten der Lösungen und das Ausklopfen der Immunstrips auf Zellstoff durchgeführt werden μl Färbelösung D9 in jede Kavität pipettieren. 8. Platte bei RT im Dunkeln für 30 min inkubieren. 9. Stoppen des Substratumsatzes durch Zugabe von 150 μl Stopplösung D10 in jede Kavität. Vorsichtiges Mischen der befüllten Kavitäten im Platten-Reader. 10. Die Messung der optischen Dichte sollte mit einem Photometer (Platten-Reader) bei 450 nm gegen eine Referenz-Wellenlänge von 620 nm innerhalb von 15 min nach Zugabe von Stopplösung D10 erfolgen. Hinweis Bei Proben mit hohem Tau-Gehalt kann der Farbstoff durch sehr intensive Färbung ausfallen. Deshalb sollte die Verzögerung nicht mehr als 10 min betragen. htau total ELISA Rev 14 17
20 Datenanalyse 12 Datenanalyse 12.1 Qualitätskriterien des Tests OD 450/620 nm der Negativkontrolle D4 (BLANK) sollte < 0,1 sein. Die Konzentration der Positivkontrollen D7 und D8 sollte sich innerhalb des angegebenen Bereiches des Chargenspezifischen Zertfikates befinden. OD 450/620 nm des Standards D3.1 sollte > 2,0 sein. Für jede Durchführung sollte R 2 der Doppelbestimmungen der Standardkurve > 0,99 sein Berechnung der unbekannten Tau-Konzentration Zur Bestimmung der Probenkonzentration wird die Verwendung von logarithmierten Werten (LN) der Standard-OD s und Standardkonzentrationen zum Auftragen auf die X-Achse (OD) und Y-Achse (Konzentration) eines linearen Diagramms oder zur Durchführung einer linearen Regressionsanalyse empfohlen. Die logarithmierten Werte der gemessenen Proben-OD s müssen für diese Regressionsanalyse verwendet werden, um mit nachfolgender Exponentialfunktion die Konzentration in pg/ml oder ng/l zu kalkulieren. Hinweis Der Verdünnungsfaktor von 4 muss in die Kalkulation der realen Tau- Konzentration nach Exponieren einbezogen werden. Eine automatische Datenanalyse üblicher Reader-Softwares kann ebenfalls für die Quantifizierung verwendet werden; die logistische Regression mit 4 oder 5 Parametern oder Logit-log-Methode wird empfohlen. Die Standardkurve zeigt typischerweise einen linearen Verlauf zwischen dem Plateau des höchsten Standards D3.1 (1000 pg/ml) und dem Plateaus des niedrigsten Standards D3.6 (25 pg/ml). 18 Rev 14 htau total ELISA
21 Hinweis Proben mit einer gemessenen OD kleiner OD des niedrigsten Standards D3.6 sind hinsichtlich der Konzentration an TAU Protein mit 12,5 pg/ml, d.h. 1/2 Konzentration Standard D3.6, zu kalkulieren, wenn nicht die Möglichkeit einer Konzentrationerhöhung der Probe besteht. 13 Erwartungswerte Hinweis Die Deutsche Gesellschaft für Liquordiagnostik und Klinische Neurochemie e.v. in der Deutschen Gesellschaft für Neurologie empfiehlt altersabhängig folgende Referenzbereiche für Tau in CSF: <50 Jahre Jahre >70 Jahre <300 pg/ml <450 pg/ml <500 pg/ml htau total ELISA Rev 14 19
22 de de. 09/17 Analytik Jena AG, Jena
23 Headquarters Analytik Jena AG Konrad-Zuse-Str Jena Germany Phone Fax info@analytik-jena.com Pictures: Analytik Jena AG Subject to changes in design and scope of delivery as well as further technical development! Analytik Jena AG
Gebrauchsanweisung Life Science Kits & Assays
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