CATTLETYPE BHV1 gb Ab

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1 CATTLETYPE BHV1 gb Ab ELISA-Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Bovines Herpesvirus 1 Labor Diagnostik Leipzig Gebrauchsinformation in vitro-diagnostikum für Rinder Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach 17 c TierSG zugelassen. Zulassungs-Nr.: FLI-B 491 Verwendungszweck Der CATTLETYPE BHV1 gb Ab ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay (ELISA) im Mikrotiterplattenformat zum Nachweis von Antikörpern gegen das Glykoprotein B des Bovinen Herpesvirus 1 (BHV1) in Serum, Plasma und Milchproben von Rindern. Nach Probenaufbereitung mit einem geeigneten Konzentrierungsverfahren (z. B. CATTLETYPE Milk Prep, Artikelnummer ) ist der CATTLETYPE BHV1 gb Ab auch zur Untersuchung von Poolproben anwendbar. Allgemeine Informationen Das Bovine Herpesvirus 1 ist der Erreger der Infektiösen Bovinen Rhinotracheitis (IBR), einer Atemwegserkrankung, die mit Tracheitis, Rhinitis und Fieber einhergeht. Weiterhin können BHV1-Infektionen Infektiöse Pustuläre Vulvovaginitis (IPV), Balanoposthitis und Spontanaborte verursachen. Bei BHV1 kann nach klinisch manifester Infektion ein Stadium der Latenz entstehen. Durch Reaktivierung des Virus kann es zur Weiterverbreitung der Infektion kommen. Der CATTLETYPE BHV1 gb Ab ELISA ermöglicht den zuverlässigen Nachweis von Antikörpern gegen BHV1 in Serum-, Plasma- und Milchproben von Rindern, die mit BHV1 infiziert sind oder mit einem Impfstoff vakziniert wurden, der das Glykoprotein B (gb) des BHV1 enthält. Beschreibung des Testprinzips Der CATTLETYPE BHV1 gb Ab funktioniert nach dem Prinzip eines kompetitiven ELISA. Die Mikrotiterplatte ist mit inaktiviertem BHV1-Antigen beschichtet. BHV1-spezifische Antikörper aus der Probe binden während der Probeninkubation an das immobilisierte Antigen, nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Anschließend wird ein Meerrettichperoxidase (HRP)-markierter, gb-spezifischer monoklonaler Antikörper zugegeben, der nicht an sein Epitop auf dem Antigen binden kann, wenn dieses bereits von spezifischen Antikörpern aus der Probe blockiert ist. Ungebundenes HRP-Konjugat wird herausgewaschen und die Farbreaktion durch Zugabe des Substrates gestartet. Nach Abstoppen der Reaktion wird die optische Dichte im Photometer gemessen. Der Hemmwert (prozentuale Blockierung) der Probe wird aus der optischen Dichte der Probe und der Negativkontrolle, die keine spezifischen Antikörper enthält, berechnet. Bestellinformation CATTLETYPE BHV1 gb Ab 5x 96 Bestimmungen Artikelnummer /5 20x 96 Bestimmungen Artikelnummer /20

2 - 2 - Reagenzien 1. Testplatte, 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen bzw. Testplatte, Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit nicht-infektiösem BHV1-Antigen 5er Kit 5 20er Kit 2. Waschlösung (10 ), enthält Tween und Konservierungsmittel 3x 125 ml 1,0 l 3. Probenverdünner, enthält Tween und Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 30 ml 125 ml 4. Positivkontrolle, BHV1-reaktives Serum vom Rind, in Puffer mit Proteinstabilisatoren 3,5 ml 2x 3,5 ml 5. Negativkontrolle, BHV1-negatives Serum vom Rind, in Puffer mit Proteinstabilisatoren 3,5 ml 2x 3,5 ml 6. Anti-gB-HRP Konjugat, Meerrettichperoxidasekonjugierter gb-spezifischer monoklonaler Antikörper in Puffer mit Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 60 ml 240 ml 7. TMB (Tetramethylbenzidin) Substratlösung, gebrauchsfertig (Vorsicht!) 60 ml 240 ml 8. Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig (Vorsicht!) 60 ml 240 ml 20 Benötigte Geräte und Materialien, die nicht mitgeliefert werden Bechergläser, Messzylinder, Präzisionspipetten, Mehrkanalpipetten, Einwegpipettenspitzen, Pipettierwannen, Deckel oder Abklebefolie für Testplatten, ggf. Plattenrüttler, manuelles oder automatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten, Mikrotiterplatten-Photometer, destilliertes Wasser Lagerung, Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise Lagern Sie die Reagenzien bei 2-8 C und bringen Sie diese erst unmittelbar vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C). Waschlösung (10x, Flasche 2) und Stopplösung (Flasche 8) können bei Raumtemperatur gelagert werden. Die gebrauchsfertige Waschlösung sollte nicht länger als 24 Stunden bei Raumtemperatur bzw. 1 Woche bei 2-8 C aufbewahrt werden. Nicht benutzte Teststreifen sollen bis zur Verwendung im wieder verschlossenen Plattenbeutel mit Trockenmittel bei 2-8 C gelagert werden. Nach erstmaliger Öffnung des Beutels sind die Teststreifen mindestens 6 Wochen haltbar. Den Test sollten nur für Labortätigkeit qualifizierte Personen ausführen. Lagern Sie die TMB Substratlösung im Dunkeln und setzen Sie diese während der Testdurchführung nicht starkem Lichteinfluss oder direktem Sonnenlicht aus. Die Bestandteile des Testkits dürfen nicht verunreinigt und nicht mit Bestandteilen aus anderen Chargen vermischt werden. Benutzen Sie die Bestandteile des Testkits nicht nach Ablauf des Verfallsdatums. Das für die Verdünnung der Waschlösung (10x) verwendete Wasser, insbesondere Wasser aus Ionenaustauscheranlagen, kann bei ungenügender Reinheit die Reaktion beeinträchtigen. Wasser mit der Qualität von bidestilliertem Wasser oder Reinstwasser (Milli-Q) ist geeignet. Die für ELISA-Prozeduren übliche Umsichtigkeit wie die Verwendung sorgfältig gereinigter Glasmaterialien, sorgfältiges Pipettieren und Waschen während der Testdurchführung und die Einhaltung konstanter Inkubationszeiten sind unabdingbare Voraussetzungen, um die Genauigkeit der Messergebnisse zu gewährleisten. Die Stopplösung enthält 2,5 % Schwefelsäure und kann Reizungen oder Verätzungen verursachen; die TMB Substratlösung kann Hautreizungen verursachen; Vorsicht! Alle Reste von Proben und mit Proben in Berührung gekommene Gegenstände sind als potenziell infektiöse Materialien zu dekontaminieren bzw. zu entsorgen. Nur für den tierärztlichen Gebrauch!

3 - 3 - Reagenzienvorbereitung Waschlösung: Waschlösung (10 ), Flasche 2, 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen, z. B. für eine Testplatte 50 ml Waschlösung (10 ) in 450 ml destilliertem Wasser verdünnen und mischen. Serum- und Plasmaproben: Es kann frisches, kühl gelagertes oder aufgetautes Serum oder Plasma verwendet werden. Nach jeder Probe die Pipettenspitze wechseln. Milchproben: Milchproben müssen vor der Untersuchung entrahmt werden. Dazu werden die Milchproben für 10 min bei 3000 x g und 10 C zentrifugiert oder bei 2-8 C über Nacht stehen gelassen. Anschließend werden die entrahmten Milchproben durch Entfernen oder Durchstechen der Rahmschicht gewonnen. Nach jeder Probe die Pipettenspitze wechseln. Testdurchführung für Serum und Plasma Alle Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C) bringen und durch Schwenken mischen. 1. Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen auf einem Arbeitsblatt. Vorschlag für die Plattenbelegung für den CATTLETYPE BHV1 gb Ab ELISA: A NK P5 P13 P21 P29 P37 P45 P53 P61 P69 P77 P85 B NK P6 P14 P22 P30 P38 P46 P54 P62 P70 P78 P86 C PK P7 P15 P23 P31 P39 P47 P55 P63 P71 P79 P87 D PK P8 P16 P24 P32 P40 P48 P56 P64 P72 P80 P88 E P1 P9 P17 P25 P33 P41 P49 P57 P65 P73 P81 P89 F P2 P10 P18 P26 P34 P42 P50 P58 P66 P74 P82 P90 G P3 P11 P19 P27 P35 P43 P51 P59 P67 P75 P83 P91 H P4 P12 P20 P28 P36 P44 P52 P60 P68 P76 P84 P92 2. In jede benötigte Kavität jeweils 50 µl gebrauchsfertigen Probenverdünner vorlegen. 3. Jeweils 50 µl der Negativ- und Positivkontrolle (in Doppelbestimmung) in die entsprechenden Kavitäten der Testplatte geben und kurz mischen (Auf- und Abpipettieren oder Plattenrüttler) 4. Jeweils 50 µl Probe in die verbleibenden Kavitäten geben und kurz mischen (Auf- und Abpipettieren oder Plattenrüttler). Die Testplatte sorgfältig abdecken h bei 37 C oder über Nacht bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren und danach die Vertiefungen durch 6. 5 waschen mit je 300 µl vorbereiteter Waschlösung, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch 7. In jede Vertiefung 100 µl gebrauchsfertiges anti-gb-hrp Konjugat geben min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren waschen mit je 300 µl vorbereiteter Waschlösung, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch 10. In jede Vertiefung 100 µl TMB Substratlösung geben min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Beginn der Zeitmessung nach dem Füllen der ersten Vertiefung. 12. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung pro Vertiefung. Die Stopplösung ist in der gleichen Reihenfolge wie die Substratlösung zuzugeben. 13. Messung der optischen Dichte (OD) im Photometer bei 450 nm und optional einer Referenzwellenlänge von nm sofort oder innerhalb von 20 min nach dem Abstoppen.

4 - 4 - Testdurchführung für Milchproben Alle Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C) bringen und durch Schwenken mischen. 1. Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen auf einem Arbeitsblatt (siehe Vorschlag für die Plattenbelegung unter Abschnitt Testdurchführung für Serum und Plasma). 2. Jeweils 100 µl der Negativ- und Positivkontrolle (in Doppelbestimmung) sowie der unverdünnten, entrahmten Milchproben in die entsprechenden Kavitäten der Testplatte pipettieren. Die Testplatte sorgfältig abdecken. 3. Über Nacht bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren waschen mit je 300 µl vorbereiteter Waschlösung, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch 5. In jede Vertiefung 100 µl gebrauchsfertiges anti-gb-hrp Konjugat geben min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren waschen mit je 300 µl vorbereiteter Waschlösung, nach jedem Waschen die Vertiefungen durch 8. In jede Vertiefung 100 µl TMB Substratlösung geben min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Beginn der Zeitmessung nach dem Füllen der ersten Vertiefung. 10. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stopplösung pro Vertiefung. Die Stopplösung ist in der gleichen Reihenfolge wie die Substratlösung zuzugeben. 11. Messung der optischen Dichte (OD) im Photometer bei 450 nm und optional einer Referenzwellenlänge von nm sofort oder innerhalb von 20 min nach dem Abstoppen. Zusatz Nach Probenaufbereitung mit einem geeigneten Konzentrierungsverfahren ist der CATTLETYPE BHV1 gb Ab ELISA auch zur Untersuchung von Sammelmilchproben anwendbar. Das Verfahren wurde für Konzentrate aus bis zu 50 Einzelmilchproben für das CATTLETYPE Milk Prep System validiert. Testvalidierung Für eine gültige Messung soll der Mittelwert (MW) der OD-Werte der Negativkontrolle einen Wert 0,75 ergeben. Die aus dem MW der OD-Werte der Positivkontrolle berechnete Blockierung soll 80 % sein. Bei ungültigen Testergebnissen sollte der Test nach gründlichem Lesen der Gebrauchsinformation wiederholt werden.

5 - 5 - Auswertung 1. Aus den OD-Werten der Negativkontrolle (NK) sowie den OD-Werten der Positivkontrolle (PK) sind jeweils die Mittelwerte (MW) zu berechnen. 2. Der Hemmwert für die einzelnen Proben ist nach der folgenden Formel zu berechnen: MW ODNK ODProbe % Hemmung = 100 MW OD NK Beurteilung für 2h-Probeninkubation Proben mit einem Hemmwert < 45 % werden als negativ befundet. Spezifische Antikörper gegen BHV1 wurden nicht nachgewiesen. Proben mit einem Hemmwert 45 % und < 55 % werden als fraglich befundet. Zur Abklärung fraglicher Ergebnisse wird eine Wiederholungsuntersuchung empfohlen. Proben mit einem Hemmwert 55 % werden als positiv befundet. Es wurden spezifische Antikörper gegen BHV1 nachgewiesen. Beurteilung für Übernacht-Probeninkubation Proben mit einem Hemmwert < 55 % werden als negativ befundet. Spezifische Antikörper gegen BHV1 wurden nicht nachgewiesen. Proben mit einem Hemmwert 55 % und < 65 % werden als fraglich befundet. Zur Abklärung fraglicher Ergebnisse wird eine Wiederholungsuntersuchung empfohlen. Proben mit einem Hemmwert 65 % werden als positiv befundet. Es wurden spezifische Antikörper gegen BHV1 nachgewiesen. V