FLOCKTYPE Salmonella. Gebrauchsinformation

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1 FLOCKTYPE Salmonella ELISA-Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen im Huhn Gebrauchsinformation in vitro-diagnostikum für Tiere Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach 17 c TierSG zugelassen. Zulassungs-Nr.: BGVV-B 322 Verwendungszweck FLOCKTYPE Salmonella ist ein Enzymimmunoassay (ELISA) im Mikrotiterplattenformat zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Serum- oder Plasmaproben vom Huhn. Es werden Antikörper gegen die O- Antigene 1, 4, 5, 9 und 12 (z. B. S. Enteritidis, S. Infantis, S. Typhimurium, S. Virchow) nachgewiesen. Allgemeine Informationen Salmonella-Infektionen sind weltweit verbreitet und kommen bei allen Geflügelarten vor. Die besondere Bedeutung der Salmonella-Infektionen beim Wirtschaftsgeflügel besteht in der Gefahr der Übertragung der Bakterien auf den Menschen. Da die bakteriologische Identifizierung von Salmonellen in Geflügelbeständen wegen deren intermittierenden Ausscheidung schwierig ist, kann effektiv der Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen als Untersuchungsmethode verwendet werden. Die Antikörperdiagnostik mittels FLOCKTYPE Salmonella ist als Screeningmethode für Geflügelbestände prädestiniert, um Salmonelleninfektionen, frühere Expositionen oder humorale Impfreaktionen nachzuweisen: Der FLOCKTYPE Salmonella ELISA ist in Kombination mit der FlockSoft -Auswertungssoftware geeignet, die durch Impfung oder natürliche Infektion induzierten Antikörpertiter im Huhn zu erkennen und quantitativ darzustellen. Beim Screening ist je nach Herdengröße und dem erwarteten Immunstatus auf eine statistisch abgesicherte Stichprobengröße zu achten. Da die Detektion der anti-salmonellen-antikörper über die eingesetzten O- Antigene erfolgt, können positive Ergebnisse nach Exposition mit verschiedenen Serovaren auftreten. Daher sollten die serologisch positiven Ergebnisse stets durch bakteriologische Untersuchungsverfahren bestätigt werden. Beschreibung des Testprinzips Die Mikrotiterplatte ist mit einem Salmonella-Lipopolysaccharid-Antigenmix beschichtet. Während der Probeninkubation binden Salmonella-spezifische Antikörper an das immobilisierte Antigen, nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Die anschließende Detektion der gebundenen Antikörper erfolgt durch ein anti-huhn-igy-peroxidase-konjugat. Ungebundenes Konjugat wird herausgewaschen und die Farbreaktion durch Zugabe des Substrates gestartet. Nach Abstoppen der Reaktion wird die optische Dichte im Photometer gemessen; sie ist proportional zu der Konzentration der anti-salmonella-antikörper in der Probe.

2 - 2 - Reagenzien 2er Kit 5er Kit 1. Testplatte, 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen bzw. 2 Testplatte, Mikrotitrationsplatte mit 96 Vertiefungen, 5 beschichtet mit inaktiviertem Salmonella-Antigen 2. Waschpuffer (10 ), Pufferlösung mit Tween, enthält Konservierungsmittel 1x 125 ml 2x 125 ml 3. Verdünnungspuffer, Pufferlösung mit Protein und Konservierungsmittel 1x 125 ml 2x 125 ml 4. Positivkontrolle, Salmonella-reaktives Serum vom Huhn, in Puffer mit Proteinstabilisatoren, gebrauchsfertig 1x 2,5 ml 1x 2,5 ml 5. Negativkontrolle, Salmonella -negatives Serum vom Huhn, in Puffer mit Proteinstabilisatoren, gebrauchsfertig 1x 2,5 ml 1x 2,5 ml 6. Anti-IgY-HRP, Kaninchen-anti-Huhn-IgY-Peroxidasekonjugat in Puffer mit Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 1x 24 ml 1x 60 ml 7. TMB, Tetramethylbenzidinsubstratlösung, gebrauchsfertig 1x 24 ml 1x 60 ml 8. Stopplösung, 0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig (Vorsicht ätzend!) 1x 24 ml 1x 60 ml Benötigte Geräte und Materialien, die nicht mitgeliefert werden Bechergläser, Messzylinder, Präzisionspipetten, Multikanalpipetten, Einwegpipettenspitzen, Pipettierwannen, Mikrotiterplattenphotometer, Röhrchen oder Mikrotiterplatten für die Verdünnung der Proben, destilliertes Wasser Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise Lagern Sie die Reagenzien mit Ausnahme von Waschpuffer (10x) und Stopplösung bei 2-8 C und bringen Sie diese erst unmittelbar vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C). Waschpuffer (10x) kann zur Vermeidung der Ausbildung von Salzkristallen bei Raumtemperatur gelagert oder zum Auflösen von Salzkristallen auf Raumtemperatur erwärmt werden. Nichtbenutzte Teststreifen sollen bis zur Verwendung im wieder verschlossenen Plattenbeutel mit Trockenmittel bei 2-8 C gelagert werden. Nach erstmaliger Öffnung des Beutels sind die Teststreifen mindestens 6 Wochen haltbar. Den Test sollten nur für Labortätigkeit qualifizierte Personen ausführen. Lagern Sie die TMB-Substratlösung im Dunkeln und setzen Sie diese während der Testdurchführung nicht starkem Lichteinfluss oder direktem Sonnenlicht aus. Die Bestandteile des Testkits dürfen nicht verunreinigt und nicht mit Bestandteilen aus anderen Chargen vermischt werden. Benutzen Sie die Bestandteile des Testkits nicht nach Ablauf des Verfallsdatums. Das für die Verdünnung des Pufferkonzentrates verwendete Wasser, insbesondere Wasser aus Ionenaustauscheranlagen, kann bei ungenügender Reinheit die Reaktion beeinträchtigen. Wasser mit der Qualität von bidestilliertem Wasser oder Reinstwasser (Milli-Q) ist geeignet. Die für ELISA-Prozeduren übliche Umsichtigkeit wie die Verwendung sorgfältig gereinigter Glasmaterialien, sorgfältiges Pipettieren und Waschen während der Testdurchführung und Einhaltung konstanter Zeiten bei der Farbreaktion sind unabdingbare Voraussetzungen, um die Genauigkeit der Messergebnisse zu gewährleisten. Einige Bestandteile des Testkits enthalten gefährliche Stoffe (Schwefelsäure). Alle Reste von Proben und mit Proben in Berührung gekommene Gegenstände sind als potenziell infektiöse Materialien zu dekontaminieren bzw. zu entsorgen. Reagenzien- und Probenvorbereitung Waschpuffer: Waschpuffer (10 ), Flasche 2, 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnen, z. B. für eine Testplatte 25 ml Waschpuffer (10 ) in 225 ml destilliertem Wasser verdünnen und mischen.

3 Serum, Plasma: Die Proben sind 1:500 mit Verdünnungspuffer verdünnt im Test einzusetzen, z. B. 1 μl Serum oder Plasma in 499 μl Verdünnungspuffer verdünnen und mischen. Die Pipettenspitze muss nach jeder Probe gewechselt werden. Die Kontrollen sind gebrauchsfertig und müssen nicht verdünnt werden. Alternativ können die Proben ausgehend von einer Vorverdünnung (1:50 in Verdünnungspuffer) direkt in der Testplatte verdünnt werden (s. u. Testdurchführung, 1. Befüllen der Testplatte). Testdurchführung Alle Reagenzien vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-25 C) bringen und mischen. 1. Befüllen der Testplatte: Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen entsprechend der Vorlage, Negativkontrolle (NK) = A1/B1; Positivkontrolle (PK) = C1/D1; übrige Positionen für Proben. Jeweils 100 μl der gebrauchsfertigen Negativ- und Positivkontrolle (in Doppelbestimmung) sowie der 1:500 verdünnten Proben in die Kavitäten der Testplatte pipettieren. Alternativ können in alle Probenkavitäten 90 μl Verdünnungspuffer vorgelegt werden und jeweils 10 μl der 1:50 vorverdünnten Proben zupipettiert werden; anschließend gut mischen und die Testplatte abdecken. Vorlage für FLOCKTYPE Salmonella ELISA: A NK P5 P13 P21 P29 P37 P45 P53 P61 P69 P77 P85 B NK P6 P14 P22 P30 P38 P46 P54 P62 P70 P78 P86 C PK P7 P15 P23 P31 P39 P47 P55 P63 P71 P79 P87 D PK P8 P16 P24 P32 P40 P48 P56 P64 P72 P80 P88 E P1 P9 P17 P25 P33 P41 P49 P57 P65 P73 P81 P89 F P2 P10 P18 P26 P34 P42 P50 P58 P66 P74 P82 P90 G P3 P11 P19 P27 P35 P43 P51 P59 P67 P75 P83 P91 H P4 P12 P20 P28 P36 P44 P52 P60 P68 P76 P84 P min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren waschen mit je 300 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren. 4. In jede Vertiefung 100 μl gebrauchsfertiges anti-igy-hrp-konjugat geben min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen durch Absaugen oder Ausschlagen entleeren waschen mit je 300 μl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren. 7. In jede Vertiefung 100 μl TMB-Substratlösung geben min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. 9. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 μl Stopplösung pro Vertiefung. 10. Kalibrierung des Photometers gegen Luft als Leerwert, Messung der optischen Dichte (OD) im Photometer bei 450 nm und optional einer Referenzwellenlänge von nm sofort oder innerhalb von 20 min nach dem Abstoppen.

4 - 4 - Testvalidierung Für eine gültige Messung sollen die OD-Werte der Positivkontrolle einen Wert 0,7 ergeben. Die OD-Werte der Negativkontrolle sollen 0,2 sein. Auswertung 1. Aus den OD-Werten der Negativkontrolle sowie den OD-Werten der Positivkontrolle sind jeweils die Mittelwerte zu berechnen. 2. Vom OD-Wert der Probe und dem OD-Mittelwert der Positivkontrolle ist jeweils der OD-Mittelwert der Negativkontrolle abzuziehen. 3. Es ist das Verhältnis der OD der Probe zum OD-Mittelwert der Positivkontrolle nach der folgenden Formel zu berechnen: S/P-Quotient = ODProbe OD(MW)NK OD(MW)PK OD(MW)NK 4. Aus dem S/P-Quotienten bei einer Verdünnung von 1:500 kann der Endpunkttiter nach folgender Formel berechnet werden: Log10 Titer = 1,54 (Log10 S/P) + 3,77 Eine automatische Testauswertung inklusive der Titerkalkulation und der Gruppierung der Ergebnisse in 19 Titergruppen ist mit Hilfe der Software FlockSoft TM möglich. Die Zuordnung negativer Testergebnisse erfolgt zur Titergruppe 0, fraglicher Testergebnisse zur Titergruppe 1 und positiver Testergebnisse zu den Titergruppen 2 bis 18 entsprechend dem S/P-Quotienten. Nähere Informationen zur Anwendung der Software FlockSoft sind dem Handbuch zu entnehmen. Beurteilung Proben mit einem S/P-Quotienten < 0,2 werden als negativ befundet. Spezifische Antikörper gegen Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium oder andere Serovaren mit den O-Antigenen 1, 4, 5, 9 und 12 wurden nicht nachgewiesen. Proben mit einem S/P-Quotienten 0,2 und < 0,3 werden als fraglich befundet. Fragliche Ergebnisse werden der Mehrheit der positiven oder negativen Testergebnisse zugeordnet. Zur Abklärung fraglicher Ergebnisse werden Wiederholungsuntersuchungen im Abstand von einigen Wochen empfohlen. Bei erstmalig bzw. frisch geimpften oder infizierten Tieren können fragliche Testergebnisse ein Hinweis auf eine beginnende Zunahme spezifischer Antikörper sein. Bei mehrfach geimpften Tieren sind fragliche Testergebnisse ein Hinweis auf eine unzureichende Bildung oder die Abnahme spezifischer Impfantikörper. Proben mit einem S/P-Quotienten 0,3 werden als positiv befundet. Es wurden spezifische Antikörper gegen Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium oder andere Serovaren mit den O- Antigenen 1, 4, 5, 9 und 12 nachgewiesen. V

5 FLOCKTYPE Salmonella ELISA Test Kit to detect Antibodies to Salmonella in the Chicken Instructions for Use In-vitro Diagnostic Kit for Veterinary Medicine, registered in accordance with 17c of the German Law on Animal Diseases. Registration No. BGVV B-332 Applications FLOCKTYPE Salmonella is an enzyme immunoassay (ELISA) in the micro titre plate format for the detection of antibodies to Salmonella in chicken serum and plasma. Antibodies to the O-antigens 1, 4, 5, 9 and 12 (for example S. Enteritidis, S. Infantis, S. Typhimurium, S. Virchow) are detected. General Information Salmonella infections are spread worldwide and are common to all poultry species. The main danger of Salmonella infections in poultry is the transmission of certain serotypes to man. Intermittent excretion of the enteritis bacteria makes the bacteriological recognition difficult. Therefore the enzyme immunoassay for the detection of antibodies against Salmonella is the efficient examination method. Antibody diagnostics with FLOCKTYPE Salmonella is the preferred screening method in poultry flocks to detect Salmonella infections or humoral vaccination responses. The FLOCKTYPE Salmonella ELISA in combination with the FlockSoft software is capable of detecting the antibody titre in the chicken induced by vaccination or by natural infections and of quantitatively depicting the results. It is important to analyse a statistically confirmed amount of animals with respect to the flock size and the expected immune status. In this test kit the anti-salmonella-antibodies are detected via the O-antigen and positive results can be obtained after contact with different serotypes. Therefore it is recommended to confirm serologically positive results with bacteriological methods. Description of the Test Principle The micro titre plate is coated with Salmonella-LPS antigen mix. During the sample incubation, antibodies specific to Salmonella bind to the immobilised antigen; unbound material is removed by washing. Specific serum antibodies bound to the solid phase through the antigen are then detected with an anti-chicken-igyperoxidase conjugate. The reaction is visualised with the soluble chromogenic substrate TMB. After quenching the reaction, the optical density is measured in the photometer. This correlates with the activity or the anti- Salmonella-antibodies in the sample.

6 - 6 - Reagents 2 plate kit 5 plate kit 1. Test plate, contains 12 micro titre strips with 8 wells each or 2 Test plate, micro titre plate with 96 wells, 5 coated with non-infectious Salmonella LPS-antigen 2. Wash buffer concentrate (10 ), buffer solution with Tween and preservative 1x 125 ml 2x 125 ml 3. Dilution buffer, buffer with protein and preservative 1x 125 ml 2x 125 ml 4. Positive Control, Salmonella -reactive chicken serum in buffer with protein stabilisers and preservative, ready-to-use 1x 2.5 ml 1x 2.5 ml 5. Negative Control, Salmonella -negative chicken serum in buffer with protein stabilisers and preservative, ready-to-use 1x 2.5 ml 1x 2.5 ml 6. Anti-IgY-HRP, rabbit anti-chicken IgY-horseradish peroxidase conjugate in buffer with protein stabilisers and preservatives, ready-to-use 1x 24 ml 1x 60 ml 7. TMB, tetramethylbenzidine substrate solution, ready-to-use 1x 24 ml 1x 60 ml 8. Stop solution, 0.5 M sulfuric acid, ready-to-use, corrosive! 1x 24 ml 1x 60 ml Additional Material and Equipment Required Beakers, measuring cylinders, analytical pipettes, multi channel pipettes, disposable pipette tips, pipetting troughs, micro titre plate spectrophotometer, tubes or plates for diluting the samples, distilled water Precautions and Warnings Store the reagents excepted wash buffer (10x) and stop solution at 2-8 C and only bring them to room temperature (18-25 C) immediately before use. To dissolve crystallized salt in the wash buffer (10x) warm up the buffer to room temperature. Wash buffer (10x) can be stored at room temperature to avoid salt crystallisation. Store the remaining test strips in the re-sealed pack with desiccant at 2-8 C until next use. The test strips can be stored at least for 6 weeks after first opening of the plate pack. The test should only be performed by persons qualified for laboratory work. Store the TMB substrate solution in the dark and do not expose this to intense light or to sunlight during the performance of the test. The components of the test kit must not be contaminated or mixed with components from other batches. Do not use the components of the test kit past expiration date. The water used for diluting the buffer concentrate, particularly water from ion-exchange plants, may interfere with the reaction if it is not pure enough. Water of the quality of double distilled water or highly purified water (Milli-Q) is suitable. To guarantee the precision of the results, it is absolutely essential to observe the usual precautions for ELISA procedures, including the use of carefully purified glass materials, careful pipetting and washing during the test, and keeping to constant times during the colour reaction. The kit contains hazardous substances (sulphuric acid). All sample residues and objects which have come into contact with samples must be decontaminated or disposed of as potentially infective material. Preparation of Reagents and Samples Wash buffer: Wash buffer concentrate (10x), bottle 2, dilute 1:10 with distilled water, e.g., for one test plate dilute 25 ml wash buffer (10x) in 225 ml distilled water and mix.

7 - 7 - Serum, plasma: Before using the samples in the assay, dilute them 1:500 with dilution buffer, e.g. 1 μl sample is diluted in 499 μl dilution buffer and mixed. Be sure to change pipette tips for each sample. Controls are ready-to-use, do not dilute them. Alternatively, serum/plasma samples can be diluted from a pre-dilution (1:50 in dilution buffer) directly in the test plate (see Test Procedure, 1. Filling the test plate). Test Procedure Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use and mix well. 1. Filling the test plate: Record the positions of the controls and samples in a test protocol, e.g. negative control (NC) = A1/B1; positive control (PC) = C1/D1; other positions of the samples. Pipette 100 μl of each of the ready-to-use negative and positive controls (in duplicates) and the 1:500 diluted samples into the test plate wells. Alternatively, pipette 90 μl of dilution buffer in each well and add 10 μl of the 1:50 pre-diluted sample. Mix well and cover the test plate. Template for FLOCKTYPE Salmonella ELISA A NC S5 S13 S21 S29 S37 S45 S53 S61 S69 S77 S85 B NC S6 S14 S22 S30 S38 S46 S54 S62 S70 S78 S86 C PC S7 S15 S23 S31 S39 S47 S55 S63 S71 S79 S87 D PC S8 S16 S24 S32 S40 S48 S56 S64 S72 S80 S88 E S1 S9 S17 S25 S33 S41 S49 S57 S65 S73 S81 S89 F S2 S10 S18 S26 S34 S42 S50 S58 S66 S74 S82 S90 G S3 S11 S19 S27 S35 S43 S51 S59 S67 S75 S83 S91 H S4 S12 S20 S28 S36 S44 S52 S60 S68 S76 S84 S92 2. Incubate for 30 min at room temperature and then empty the wells by aspiration or tapping. 3. Rinse each well 3x with 300 μl of prepared wash buffer. Remove the buffer after each rinse. 4. Add 100 μl ready-to-use anti-igy-hrp to each well. 5. Incubate for 30 min at room temperature and then empty the wells by aspiration or tapping. 6. Rinse each well 3x with 300 μl of prepared wash buffer. Remove the buffer after each rinse. 7. Add 100 μl TMB substrate solution to each well. 8. Incubate for 10 min at room temperature in the dark. 9. Stop the reaction by adding 100 μl stop solution per well. 10. Calibrate the spectrophotometer against air as blank. Measure the optical density (OD) in the spectrophotometer at 450 nm immediately or within 20 min after stopping the reaction. Measuring at a reference wavelength ( nm) is optional.

8 - 8 - Test Validation For the assay to be valid the values of the measured OD for the positive control must be 0.7; the values of the measured OD for the negative control must be 0.2. Calculation 1. Calculate the mean values (MV) of the measured OD for the negative control (NC) and the positive control (PC). 2. Subtract the mean OD of NC from the OD of the sample and from the mean OD of PC. 3. The ratio sample to mean PC is calculated according to the following equation: S/P ratio = ODsample OD(MV)NC OD(MV)PC OD(MV)NC 4. Endpoint titres are calculated from the S/P ratio at a 1:500 dilution using the following equation: Log10 Titre = 1.54 (Log10 S/P) Data analysis, titre calculation, and the classification of the results can be easily performed by using the FlockSoft software. Negative test results are classified into titre group 0, doubtful results into titre group 1, and positive test results into titre groups 2 to 18 depending on the S/P ratio. Please refer to the FlockSoft manual for further information. Evaluation Samples with the S/P ratio < 0.2 are diagnosed as negative. Specific antibodies to Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium ore other serotypes with O-antigenes 1, 4, 5, 9 and 12 could not be detected. Samples with the S/P ratio 0.2 and < 0.3 are diagnosed as doubtful. Doubtful results should be grouped to the majority of the positive or negative test results. It is recommended to re-test doubtful results after a few weeks. Doubtful results from recently vaccinated animals may indicate a beginning increase in the formation of specific antibodies. Doubtful results from animals with repeated vaccinations may indicate an insufficient formation or a decrease of specific antibodies. Samples with the S/P ratio 0.3 are diagnosed as positive. Specific antibodies to Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium ore other serotypes with O-antigenes 1, 4, 5, 9 and 12 were detected. V