CLOSTRIDIUM BOTULINUM NEUROTOXINE TYP C UND D ELISA-TESTKIT (BIO K 300)

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1 Gebrauchsinformation Zul.-Nr. : In vitro-diagnostikum Version BIO K vom 02/05/13 CLOSTRIDIUM BOTULINUM NEUROTOXINE TYP C UND D ELISA-TESTKIT (BIO K 300) ELISA-Testkit zum Antigennachweis der Neurotoxine vom Typ C und D von Clostridium I - ANWENDUNGSGEBIET botulinum Test für Kulturüberstände Indirekter Sandwich-ELISA-Test Diagnosetest für alle Tierarten Die Sporen des weltweit verbreiteten Bakteriums Clostridium botulinum (C. botulinum) werden im Erdboden, in Sedimenten sowie in Pflanzen, die auf bakterienkontaminiertem Boden wachsen, gefunden (Sugiyama, 1986). C. botulinum-bakterien können verschiedene Neurotoxine der Typen A bis G produzieren. Basierend auf dem Typ der produzierten Neurotoxine können die Stämme von C. botulinum in 4 Gruppen (I bis IV) aufgeteilt werden. Die C. botulinum-bakterien der Gruppe III produzieren die Neurotoxine vom Typ C und D und deren Mosaik- Isoformen : C/D oder D/C (Moriishi et al., 1996). Diese Bakterien der Gruppe III gelten klassischerweise als Urheber des Botulismus bei Tieren, so auch beim Rindvieh (Sunagawa et al., 1992; Tsukamoto et al., 2005). Der biologische Inokulationstest bei der Maus gilt als Referenz für die Diagnose des Botulismus beim Rindvieh. Dieser Test ist jedoch sehr kostspielig und aus ethischen Gründen des Tierschutzes sehr umstritten. Der Sandwich-ELISA-Test BIO K 300 von Bio-X stellt eine Alternative dar, da er die Komplexe der Neurotoxine vom Typ C und D aufspürt (Brooks et al., 2010). Dazu wird der Darminhalt von vermeintlich an Botulismus verendeten Tieren während 10 Minuten bei 80 C erhitzt, bevor er während 5 Tagen unter anaeroben Bedingungen inkubiert wird, um eine maximale Produktion der Neurotoxine vom Typ C und D zu ermöglichen (Brooks et al., 2011). II - TESTPRINZIP Die Reihen A, C, E und G der Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen sind mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet, der die Neurotoxine vom Typ C und D von C. botulinum erkennt. Die Reihen B, D, F und H sind mit einem unspezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet. Diese negativen Kontrollreihen (unspezifische Bindung) erlauben die Anzahl falsch positiver Resultate stark einzuschränken. Die Kulturüberstände (5tägige Inkubation des Darminhalts von vermeintlich an Botulismus verendeten Tieren) werden während einer Stunde bei +21 C +/- 3 C auf der Platte inkubiert. Nach einem Waschvorgang wird das Konjugat ein monoklonaler, an Biotin gebundener spezifischer anti-c. botulinum Neurotoxine Typ C und D Antikörper in die Vertiefungen verteilt und während einer Stunde bei +21 C +/- 3 C inkubiert. Nach einem erneuten Waschvorgang wird an das Peroxidaseenzym gebundenes Avidin, welches Biotin spezifisch bindet, zugefügt. Nach einer weiteren einstündigen Inkubationszeit bei +21 C +/- 3 C und einem weiteren Waschvorgang wird die TMB-Substrat-Lösung zugefügt. Das darin enthaltene Chromogen TMB (Tetramethylbenzidine) reagiert empfindlicher als andere mit der Peroxidase reagierende Farbstoffe und ist nicht kanzerogen. Enthält die Probe die Neurotoxine vom Typ C und D von C. botulinum, bleibt das Konjugat in der mit dem spezifischen Antikörper beschichteten Vertiefung haften und das Enzym katalysiert die Verwandlung des farblosen Chromogens in ein blaues Endprodukt. Die Farbintensität ist proportional zum Toxingehalt der Probe. Die Enzymreaktion wird durch Säurezufuhr gestoppt und die optische Dichte in einem 1

2 Spektralphotometer gemessen. Die gemessene optische Dichte der negativen, mit unspezifischen Antikörpern beschichteten Vertiefung wird von derjenigen abgezogen, die man auf der entsprechenden positiven, mit spezifischen Antikörpern beschichteten Vertiefung abgelesen hat. Ein positives Kontrollantigen ist im Kit enthalten, um die Validität der erhaltenen Resultate sicherzustellen. III - BESTANDTEILE DER TESTPACKUNG - Testplatten: Mikrotiterplatten zu je 96 Vertiefungen, 12 Streifen zu je 8 Reaktionsvertiefungen : Waagerechte Reihen A, C, E, G : beschichtet mit einem spezifischen monoklonalen anti-c. botulinum Neurotoxine Typ C und D Antikörper. Waagerechte Reihen B, D, F, H : negative Kontrolle, beschichtet mit einem unspezifischen monoklonalen Antikörper. Die Mikrotiterplatten zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Waschkonzentrat: 1 x 100 ml (20 x konzentriert), zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Verdünnungspuffer: 1 x 50 ml (5 x konzentriert) gefärbte Lösung, zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Konjugatkonzentrat: 1 Fläschchen Konjugatkonzentrat (50 x konzentriert); monoklonale, an Biotin gebundene spezifische anti-c. botulinum Neurotoxine Typ C und D Antikörper. Das Konjugatkonzentrat zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Avidinkonzentrat: 1 Fläschchen Avidinkonzentrat (50 x konzentriert); an das Peroxidaseenzym gebundenes Avidin, zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Positives Kontrollantigen: 1 Fläschchen gebrauchsfertige Kontrollantigenlösung, zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - TMB-Substrat-Lösung: 1 Flasche gebrauchsfertige TMB-Substrat-Lösung, zwischen +2 C und +8 C lichtgeschützt aufbewahren. - Stopplösung : 1 Flasche gebrauchsfertige Stopplösung, 1 M Phosphorsäure (ätzend). BIO K 300/1 BIO K 300/2 Mikrotiterplatten 1 2 Waschkonzentrat 1 X 100 ml (20 X) 1 x 100 ml (20 X) Verdünnungspuffer, gefärbt 1 X 50 ml (5 X) 1 x 50 ml (5 X) Konjugatkonzentrat 1 X 0,3 ml (50 X) 1 X 0,5 ml (50 X) Avidinkonzentrat 1 X 0,3 ml (50 X) 1 X 0,5 ml (50 X) Positives Kontrollantigen 1 X 2 ml 1 X 4 ml TMB-Substrat-Lösung 1 X 12 ml 1 x 25 ml Stopplösung 1 X 6 ml 1 x 15 ml IV - ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES UND NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL UND GERÄT Destilliertes Wasser, Messzylinder, Bechergläser, erwärmbares Wasserbad, Plastikröhrchen, Glasröhrchen, Röhrchenständer, Pipettenspitzen, Reagenzbehälter für Mehrkanalpipetten, Deckel für Mikrotiterplatten, Abklebefolie für Mikrotiterplatten, Ein- und Mehrkanalpipetten, Inkubator (30 C und 37 C), Mikrotiterplatten- Spektralphotometer, Mikrotiterplatten-Washer und Mikrotiterplatten-Schüttler (fakultativ). Gelatine-Puffer: Gelatine, Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4 Nährmedium für anaerobe Bakterienkultur - Brain Heart Infusion (BHI-) Agar (Hirn-Herz-Aufguss-Bouillon) (Becton Dinkinson Biosciences : ) - Cooked Meat Medium (CMM) (Fleischbouillon) (Oxoid : CM0081) V - HINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN - Dieser Test ist ausschließlich für den tiermedizinischen Gebrauch und die In-vitro-Diagnostik bestimmt. - Die Reagenzien müssen zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. - Das Waschkonzentrat und der konzentrierte Verdünnungspuffer können bei Zimmertemperatur gelagert werden. Die verdünnten, gebrauchsfertigen Lösungen können 6 Wochen verwendet werden, wenn sie zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. - Nichtverwendete Teststreifen müssen unverzüglich in die Aluminiumverpackung zurückgelegt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass der Trockenmittelbeutel nicht feucht und die Verpackung wieder luftdicht 2

3 verschlossen wird. Unter diesen Bedingungen können die Streifen bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendet werden. - Keine Reagenzien aus verschiedenen Testpackungen benutzen. - Die Qualität des Wassers, das zur Herstellung der verschiedenen für den Test benötigten Lösungen dient, ist sehr wichtig. Es darf keine oxidativen Stoffe (z.b. Bleichlauge) oder Schwermetallsalze enthalten, denn sie könnten mit dem Chromogen TMB reagieren. - Lösungen, die durch Bakterien oder Pilze verunreinigt sind, müssen entfernt werden. - Die Stopplösung enthält 1 M Phosphorsäure (ätzend). Vorsichtig manipulieren. - Die von C. botulinum produzierten Neurotoxine sind äußerst aktiv und hochgefährlich. Die biologischen Proben und im Besonderen die Bakterienkulturen sind mit äußerster Vorsicht zu manipulieren. Es ist verpflichtend, dass alle Proben sowie jegliche Materialien, die mit den Proben in Kontakt gekommen sind, durch Verbrennung vernichtet werden, bevor sie unter Anwendung der landeseigenen Gesetzgebung entsorgt werden können. - Das Testprotokoll muss genauestens befolgt werden, um die Validität der Resultate zu garantieren. Insbesondere sind die Inkubationszeiten und -temperaturen sowie das genaue Abmessen der Reagenz- und Verdünnungsvolumen zu beachten. VI - VORBEREITUNG DER REAGENZIEN - Waschlösung: Durch die Lagerung des Waschkonzentrats bei niedrigen Temperaturen können spontan Kristalle entstehen. Wird lediglich ein Teil des Konzentrats gebraucht, so ist es auf +21 C +/- 3 C zu erwärmen, bis die Kristalle sich völlig gelöst haben. Nach gründlichem Durchmischen wird das benötigte Volumen entnommen. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Waschlösung wird 1 Teil Waschkonzentrat (20 x konzentriert) mit 19 Teilen destilliertem oder demineralisiertem Wasser verdünnt. Die verdünnte Lösung zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Verdünnungspuffer: Dient zur Verdünnung des Konjugat- und des Avidinkonzentrats. Vor Entnahme von Teilmengen die Lösung gründlich durchmischen. Durch die Lagerung des konzentrierten Verdünnungspuffers bei +21 C +/- 3 C kann eine Sedimentbildung auf dem Flaschenboden verhindert werden. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wird 1 Teil Verdünnungspuffer (5 x konzentriert) mit 4 Teilen destilliertem oder demineralisiertem Wasser gemischt. Die verdünnte Lösung zwischen +2 C und +8 C aufbewahren. - Konjugatlösung: Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wird 1 Teil Konjugatkonzentrat (50 x konzentriert) mit 49 Teilen gebrauchsfertigem Verdünnungspuffer gemischt (z.b. : für einen Teststreifen : 20 µl Konjugatkonzentrat mit 980 µl Verdünnungspuffer mischen). - Avidinlösung: Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wird 1 Teil Avidinkonzentrat (50 x konzentriert) mit 49 Teilen gebrauchsfertigem Verdünnungspuffer gemischt (z.b. : für einen Teststreifen : 20 µl Avidinkonzentrat mit 980 µl Verdünnungspuffer mischen). - Positives Kontrollantigen: Die Kontrollantigenlösung ist gebrauchsfertig. - TMB-Substrat-Lösung: Die TMB-Substrat-Lösung ist gebrauchsfertig. - Stopplösung: Die Stopplösung ist gebrauchsfertig. VII - AUFBEREITUNG DER PROBEN - Vorbereitung des Materials : - Gelatine-Puffer : Gelatine 0,2% Na 2 HPO 4 80 mm KH 2 PO 4 12 mm ph-wert auf 6,5 einstellen. - Nährmedium für anaerobe Bakterienkultur 37 g BHI-Agar in 1 Liter destilliertem Wasser auflösen und in Glasröhrchen zu je 20 ml verteilen. 1 g Fleischbouillon (CMM) pro Röhrchen zufügen und im Autoklav sterilisieren. Es ist vorteilhaft, die Bakterienkultur auf einem frisch hergestellten Nährmedium anzulegen, sobald dieses in ruhiger Stellung auf 35 C abgekühlt ist. Falls die Röhrchen mit dem Nährmedium nicht sofort verwendet werden, müssen sie während 15 Minuten im kochenden Wasserbad oder im Autoklav regeneriert werden, um den gelösten Sauerstoff zu eliminieren. Die Röhrchen in ruhiger Stellung auf 35 C abkühlen lassen und die Kultur anlegen. 3

4 - Biologische Proben: Die zu testenden Proben können aus dem Inhalt folgender Organe des Magen-Darm- Trakts entnommen werden : Pansen, Labmagen, Dünndarm, Dickdarm. 1 g Probenmaterial mit 5 ml Gelatine-Puffer in einem Glasröhrchen mischen und während 10 Minuten bei 80 C erhitzen. Die Dauer und die Temperatur des Erhitzens sind unbedingt zu respektieren. Mit je 100 µl dieser Probenlösung eine Kultur in 2 frisch präparierte Röhrchen mit 20 ml Nährmedium für anaerobe Bakterien anlegen. Dabei ist darauf zu achten, dass die Bakterienkultur in den Fleischpartikeln auf dem Grund des Röhrchens angelegt wird. Je ein Röhrchen bei 30 C und eins bei 37 C während 5 Tagen unter anaeroben Bedingungen inkubieren. - Kulturüberstände: Die Kulturüberstände der beiden Röhrchen werden separat für den Test genutzt und unverdünnt aufgetragen. VIII - TESTDURCHFÜHRUNG 1- Alle Reagenzien vor Gebrauch auf +21 C +/- 3 C bringen. 2- Die benötigten Streifen aus der Umhüllung nehmen und in den Rahmen geben. 3- Die unverdünnten Kulturüberstände und das positive Kontrollantigen zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. Dabei folgende Anordnung beachten : Probe 1 in Vertiefung A1 und B1, Probe 2 in Vertiefung C1 und D1, usw Positives Kontrollantigen z.b. in Vertiefung E1 und F1. 4- Eine Stunde bei +21 C +/- 3 C mit Deckel inkubieren. 5- Waschvorgang: die Platte mit einer schnellen Handbewegung über einem Behälter entleeren, der mit einer bakterieninaktivierenden Substanz (oxydierendes Produkt oder Ähnliches) gefüllt ist. Die Platte auf sauberer, saugender Unterlage gut ausklopfen. Danach die Vertiefungen vorsichtig mittels einer Spritzflasche mit der Waschlösung füllen und sie wieder mit einer schnellen Handbewegung über dem Behälter entleeren. Diesen Waschvorgang noch zweimal wiederholen, wobei besonders darauf zu achten ist, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen bilden und die Vertiefungen nicht austrocknen. 6- Die Platte auf sauberer, saugender Unterlage ausklopfen. 7- Die gebrauchsfertige anti-c. botulinum Neurotoxine Typ C und D Konjugatlösung zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. 8- Eine Stunde bei +21 C +/- 3 C mit Deckel inkubieren. 9- Platte waschen wie unter 5. und 6. beschrieben. 10- Die gebrauchsfertige Avidinlösung zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. 11- Eine Stunde bei +21 C +/- 3 C mit Deckel inkubieren. 12- Platte waschen wie unter 5. und 6. beschrieben. 13- Die TMB-Substrat-Lösung zu je 100 µl pro Vertiefung verteilen. Die TMB-Substrat-Lösung muss vor dem Auftragen absolut farblos sein. Sollte eine Blaufärbung sichtbar sein, bedeutet dies eine Verunreinigung der Lösung oder des Pipettenmaterials. In diesem Fall die kontaminierte Lösung entsorgen und neues TMB- Substrat mit absolut sauberem Material entnehmen Minuten bei +21 C +/- 3 C ohne Deckel und lichtgeschützt inkubieren. Die Zeitangabe dient als Anhaltspunkt. Unter gewissen Umständen kann sie verkürzt oder verlängert werden µl Stopplösung pro Vertiefung zufügen und unmittelbar danach die optische Dichte (OD) mit einem Plattenspektralphotometer (ELISA Reader) bei einer Wellenlänge von 450 nm messen. Die Zügigkeit dieses Vorgangs ist wichtig, denn das Chromogen TMB kann unter gewissen Bedingungen in den Vertiefungen kristallisieren und so zu falschen Messwerten führen (z.b. bei einem sehr hohen OD-Wert). IX - AUSWERTUNG DER RESULTATE Für jede Probe muss die Differenz der Extinktionen (Delta OD) zwischen der mit spezifischen Antikörpern und der entsprechenden, mit unspezifischen Antikörpern beschichteten Reaktionsvertiefung berechnet werden. Dazu wird von jedem OD-Wert der Reihen A, C, E und G der entsprechende OD-Wert der Reihen B, D, F und H abgezogen. Eventuellen negativen OD-Werten muss Rechnung getragen werden. Zum Beispiel : Probe 1 : A1 B1, Probe 2 : C1 D1. Das Gleiche gilt auch für das positive Kontrollantigen : E1 F1. Der Test ist nur dann valide, wenn die Differenz der Extinktionen (Delta OD) für das positive Kontrollantigen nach 10 Minuten in der TMB-Substrat-Lösung über folgendem Wert liegt (Validation) : 0,796 Jeder erhaltene Wert (Delta OD) einer Probe wird durch den Wert des positiven Kontrollantigens geteilt und das Ergebnis mit 100 multipliziert, um die Resultate als Prozentwert auszudrücken. 4

5 Delta OD Probe %Wert = x 100 Delta OD pos. Kontrollantigen A1 B1 Zum Beispiel : %Wert Probe 1 = x 100 E1 F1 Eine Probe wird als positiv gewertet, wenn der errechnete Prozentwert über folgendem Grenzwert liegt (siehe auch Tabelle des beigefügten Chargenprüfprotokolls) : > 9,42 %. X - BESTELLINFORMATIONEN BIO-X C. BOTULINUM NEUROTOXINE TYP C UND D ELISA-TESTKIT: 1 X 48 Tests BIO K 300/1 2 X 48 Tests BIO K 300/2 XI - REFERENZEN Brooks C. E., Clarke H. J., Finlay D. A., McConnell W., Graham D. A. and Ball H. J. (2010) Culture enrichment assists the diagnosis of cattle botulism by a monoclonal antibody-based sandwich ELISA. Veterinary Microbiology, 144, Brooks C. E., Clarke H. J., Graham D. A. and Ball H. J. (2011) Diagnosis of botulism types C and D in cattle by a monoclonal antibody-based sandwich ELISA. Vet. Rec Apr 30, 168 (17), 455. Epub 2011 Apr 11. Moriishi K., Koura M., Abe N., Fujinaga Y., Inoue K. and Oguma K. (1996) Mosaic structures of neurotoxins produced from Clostridium botulinum types C and D organisms. Biochimica Biophysica Acta, 1307, Sugiyama H. (1986) Clostridium botulinum. Pathogenesis of bacterial infections in Animals. Editors Carlton L. Gyles and Charles O. Thoen. Published by The Iowa State University Press. Chapter 8, p Sunagawa H., Ohyama T., Watanabe T. and Inoue K. (1992) The complete amino acid 480 sequence of the Clostridium botulinum type D neurotoxin, deduced by nucleotide 481 sequence analysis of the encoding phage d-16 phi genome. Journal of Veterinary Medical Science, 54, Tsukamoto K., Kohda T., Mukamoto M., Takeuchi K., Ihara H., Saito M. and Kozaki S. (2005) Binding of Clostridium botulinum type C and D neurotoxins to 500 ganglioside and phospholipid. Journal of Biological Chemistry, 280,