Die Uterus-Superfusion - ein Modell zur Beurteilung lokaler steroidaler Effekte
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- Hedwig Schäfer
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1 Aus dem Institut für Ernährungswissenschaft Bergholz Rehbrücke der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Potsdam Eingereicht über das Institut für Veterinär-Physiologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Die Uterus-Superfusion - ein Modell zur Beurteilung lokaler steroidaler Effekte INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE (Dr. med. vet.) an der Freien Universität Berlin vorgelegt von Afra Geißler Tierärztin aus Meiningen Berlin 2002 Journal-Nummer 2638
2 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Dekan: Univ.-Prof. Dr. Michael F. G. Schmidt Betreuer: Univ.-Prof. Dr. Florian J. Schweigert 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Holger Martens 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Florian J. Schweigert 3. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Ortwin Simon Deskriptoren Tag der Promotion: 6. November 2002
3 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Schrifttum Uterus und Vagina bei der Maus Anatomie Histologie Umbauvorgänge im Verlauf des Zyklus Der Zyklus der Maus Die Uterusflüssigkeit Die Proteine der Uterusflüssigkeit Proteinveränderungen in der Uterusflüssigkeit Veränderungen der Proteine während des Zyklus und der Gravidität Veränderungen der Proteine unter Östradiol- und Progesteroneinfluß Steroidhormone Östradiol Progesteron Der Progesteronrezeptor (PR) Verschiedene Techniken der Organdurchspülung Allgemeine Betrachtung Das Modell der Superfusion Das Modell der Perfusion Das Modell der Mikrodialyse 28
4 3 Material und Methoden Tiere und Auswahlkriterien Methoden Die Zyklusbestimmung der Maus Die Superfusion des Mäuseuterus Proteinbestimmung im Superfusat Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) der fraktioniert aufgefangenen Superfusate Massenspektrometrische Untersuchung Immunhistologischer Nachweis des Progesteronrezeptors (PR) im Uterus der Maus Molekularbiologischer Nachweis von CytochromP26 (CYP26) mittels in situ-hybridisierung Hämalaun-Eosin-Färbung (HE-Färbung) Statistische Auswertung 44 4 Ergebnisse Der Vaginalabstrich der Maus Proteinbestimmung in den Superfusaten Allgemeine Betrachtung Beurteilung der Uterusspülung (Ut.) Beurteilung der Kontrolle (K) Beurteilung der Östradiolbehandlungen Beurteilung der Progesteronbehandlungen Elektrophoretische Proteinmusterbestimmung der Superfusate Auswertung der massenspektroskopischen Untersuchung Die Expression des Progesteronrezeptors (PR) im Uterus der Maus Progesteronrezeptorstatus der Lamina epithelialis mucosae 60
5 4.3.2 Progesteronrezeptorstatus der Glandulae uterinae der Lamina propria mucosae Progesteronrezeptorstatus des Stroma endometrii Progesteronrezeptorstatus des Myometriums Nachweis von CytochromP26 (CYP26) im Uterus 66 5 Diskussion Die Superfusionslösungen Die Proteine der Uterusflüssigkeit unter Steroidhormon-Einfluß Elektrophoretische und massenspekrometrische Betrachtung Maus-Serumalbumin Laktoferrin Die Expression des Progesteronrezeptors (PR) Der Progesteronrezeptor unter Östradioleinfluß Der Progesteronrezeptor unter Progesteroneinfluß Retinsäure und CytochromP26 (CYP26) Das Modell der Superfusion 86 6 Schlußfolgerung 89 7 Zusammenfassung Summary 93 Literaturverzeichnis 95
6 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung Aqua dest. destilliertes Wasser BSA bovines Serumalbumin CYP26 CytochromP26 DAB 3,3`-Diaminobenzidintetrahydrochlorid-Dihydrat DEPC Diethylpyrocarbonat-Wasser DMSO Dimethylsulfoxid EGF engl. epidermal growth factor ER/ERs Östradiolrezeptor/en h Stunde HB-EGF engl. heparin-binding epidermal growth factor hcg humanes Choriongonadotropin HRE Hormon-Responsives-Element HSP heat-shock-protein Ig G Immunglobulin G IGF engl. insulin-like growth factor K Kontrolle kda Kilodalton MALDI-TOF-MS engl. matrix-assisted laser-desorption/ ionisation-time of flight-mass spectrometrie; Matrix-unterstützte Laser-Desorption-Ionisations- Massenspektrometrie mrna Boten-RNA MW Mittelwert p. c. post coitum p. o. post ovulationem PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase PMSG engl. pregnant mare serum gonadotropin PR/PRs Progesteronrezeptor/en
7 RAR RXR s SDS Tab. TAF TBS Ut. v/v Retinsäure-Rezeptor Retinoid-X-Rezeptor Standardabweichung Natriumdodecylsulfat Tabelle transkriptionsaktivierender Faktor Tris-Puffer Uterusspülung mit NaCl Volumen zu Volumen
8 Abstract Uterus Superfusion A Model for the Assessment of Local Steroidal Effects 115 p., 27 fig., 7 tab., 165 ref. The aim of this study was the development of an ex - vitro model for the investigation of the effects of various estradiol and progesterone concentrations on the isolated uterus of the mouse. 45 uteri of estrous mice were superfused with or without the hormones after the stage of estrous cycle had been determined by vaginal smear. The eluate was collected in 5-minute fractions for 60 minutes and in 10-minute fractions for another 30 minutes, respectively. The protein concentration of the fractions was determined, and the protein pattern was characterised by SDS-PAGE. Two striking protein bands appearing upon superfusion with the hormones could be analysed by MALDI-TOF. The pattern of progesterone- receptor (PR) distribution in the tissue was shown immunohistochemically after treatment of the uteri with physiological, overdosed and underdosed hormone concentrations, respectively. CytochromeP26 (CYP26) was determined by in-situ hybridisation. The following results were obtained: The protein concentration changes dependent on the hormone and its concentration. Estradiol stimulates the release of proteins in all concentrations tested. The physiological concentration has the smallest influence. All other estradiol concentrations significantly increase the amount of protein in the superfusate compared to the control. The augmentation is more distinct from the 70 th minute on. Progesterone leads to enhanced protein concentration only with overdosed concentrations. Physiological and underdosed concentrations, respectively, have no stimulating effect on the protein release by the superfused uteri The first flushing shows the most varied protein pattern. Treatment with estradiol strongly increases the concentrations of mice serum albumin and lactoferrin partly within 90 minutes. Progesterone enhances mouse serum albumin only. Mouse serum albumin seems to be responsible for the biphasic manifestation of the protein concentration. Very likely the amount of mouse serum albumin elevates due to an increased permeability of blood vessels.
9 Lactoferrin is a uterus specific protein and is present in the first flushing. It can be electrophoretically detected only in the 10- minute fraction of the treatment with the highest estradiol concentration. The expression of PRs depends on tissue, hormone and hormone concentration. No PR can be detected with any treatment in epithelium of the endometrium. In glands, PR content increases with rising estradiol concentrations in the medium. Slight progesterone effects can be seen with highest dosed and lowest dosed concentrations. The physiologic concentration leads to the highest PR content in the tissue. In stroma, all estradiol concentrations cause an increase in PR amount, regardless of the concentration. The most striking effect can be observed in the myometrium. Physiological and high dosed estradiol concentrations have the strongest positive influence on PR expression. No CYP26 could be found by in - situ hybridization within 90 minutes of exogenous addition of estradiol and progesterone, respectively Taking all these results into consideration, we can conclude that the superfusion is a good ex - vitro model to investigate the effects of soluble substances on the organ. Because of the direct contact of the active substance with the surface of the tissue, the various effects are reached sooner. Furthermore, the transformation and disassembly of the active substance may be decreased or wholly prevented.
10 Danksagung Herrn Prof. Dr. F. J. Schweigert möchte ich für die Überlassung des Themas danken, das sich nach anfänglichen Schwierigkeiten als sehr interessant erwiesen hat. Des weiteren danke ich ihm für die stets freundliche Unterstützung sowie die wertvollen fachlichen Anregungen und Hinweise bei der Anfertigung meiner Arbeit. Frau Dr. A. Flechner danke ich für die Einarbeitung in das Thema, die jederzeit gewährte Hilfsbereitschaft, die zahlreichen praktischen Anregungen bei der Einführung in die Technik der Superfusion, der Elektrophorese und der Immunhistologie sowie der kritischen Durchsicht dieser Arbeit. Ferner bedanke ich mich bei Frau Dr. S. Haebel vom Interdisziplinären Forschungszentrum für Biopolymere der Universität Potsdam für die Bearbeitung der Proben durch die MALDI-TOF- MS-Analytik. Mein besonderer Dank gilt Frau U. Neumann und Frau. K. Schmiedeberg bei der Durchfü hrung der in situ-hybridisation zur Untersuchung des CytochromP26. Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Ernährungswissenschaft der Universität Potsdam möchte ich mich für die Unterstützung und nette Zusammenarbeit während der Erstellung meiner Arbeit bedanken. Meiner Familie und Guntram danke ich für die stetige Bereitschaft, mich in jeder Hinsicht zu unterstützen, ohne die mir die Anfertigung meiner Dissertation nicht möglich gewesen wäre.
11 Lebenslauf Name Afra Geißler geboren am in Meiningen Schulische Ausbildung Sep Aug Polytechnische Oberschule Theodor Neubauer in Jena Abschluß 10. Klasse Berufliche Ausbildung Sep Feb Biologielaborantin mit IHK-Abschluß an der Friedrich Schiller Universität Jena Abitur Sep Juni 1994 Juli 1994 Kurs zur Vorbereitung auf des Abitur an der Volkshochschule Jena Abitur am Ernst Abbe Gymnasium Jena Studium Okt März 2000 Studium der Veterinärmedizin an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Berufserfahrung seit Juli 2001 praktische Tierärztin
12 Selbständigkeitserklärung Hiermit bestätige ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Zuhilfenahme der angegebenen Literatur, erstellt habe. Berlin, Afra Geißler
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