Die Kontrolle der Transkription in Eukaryontenzellen ist komplex:
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- Bärbel Meissner
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1 Die Kontrolle der Transkription in Eukaryontenzellen ist komplex: Eukaryontische RNA-Polymerasen benötigen "Allgemeine Transkriptionsfaktoren Eine eukaryotische Gen-Kontrollregion besteht aus einer Promotor plus Regulator-DNA-Sequenzen Verstärker-Elemente regulieren Gene in Abstand
2 Verstärker (Enhancer) wirken auf Distanz W. Su et al PNAS (1990)
3 Schleifenbildung erhöht die Wechselwirkung Van Hippel
4 Beispiel: NtrC (nitrogen regulatory Protein C) from enteric bacteria : a transcription factor that activates a variety of genes that are involved in nitrogen utilization by contacting simultaneously a binding site on the DNA and RNA polymerase complexed with the σ54 sigma factor at the promoter.
5
6 Distribution of DNA loops formed of NtrC and Pol W. Su et al PNAS (1990)
7 J. Mol. Biol. (1997) 270,
8 Automated Discovery System The Genome Project was the first inherently digital, 1-dimensional, static small (fits on one CD-ROM) The "gene expression project" clustering analysis yields "correlations" among genes limited scope to infer causality from mrna analysis
9 The genome and the proteome : a comparison Genome static amplification possible (PCR) homogeneous no variability in amount Proteome dynamic - condition dependent no amplification non-homogeneous high variablity in amount (>10 6 )
10 The full yeast genome on a chip Science DeRisi et al. 278 (5338): 680 Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale Yeast genome microarray. The actual size of the microarray is 18 mm by 18 mm.
11 high-density arrays of oligonucleotides Macroarrays : Pin spotted cdnas or PCR products on membranes, readout by radiation Microarrays : Pin spotted cdnas or PCR products on high density non-porous substrates readout by high resolution fluorescence microarrays allow study of gene expression in a massively parallel way
12 How DNA Chips Are Made
13 ink-jet arrayer
14 Wirkstofftest mit DNA-Chips (Expression profiling) Fragestellung: Schädigt ein neuer Wirkstoff die Leber? Vorgehen: Vergleich der Gene, die von dem neuen Wirkstoff in der Leberzelle aktiviert werden mit den von bekannten leberschädigenden Wirkstoffen aktivierten. Technik: Chip, der mit verschiedenen einzelsträngigen DNA- Molekülen Schachbrettartig belegt ist (Mikroarray)
15 Protokoll: 1.) Behandle Leberzellen mit Wirkstoff; sammle m-rna von diesen und unbehandelten Leberzellen; Hinweis: die Zellen erzeugen vornehmlich die m-rna die aufgrund der Wirkstoffzugabeneu benötigt werden. 2.) Baue zu beiden m-rna-typen komplementäre c-dna auf (DNA ist stabiler als RNA) die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
16 3.) Die c-dna wird auf den DNA-Chip gegeben und hybridisiert dort mit den jeweiligen komplementären Strängen des Chips
17 4.) Mit einem Scanner werden die Fluoreszenzsignale der jeweiligen Punkte (Bindungsmuster) auf dem Chip gemessen. Damit erhält man für den neuen Wirkstoff ein Reaktionsmuster.
18 5.) Das Aktivitätsmuster wird mit dem bekannter Wirkstoffe verglichen:
19 Functional genomics
20 Zur Signifikanz der Expressionsdaten Fold-change Analyse: x i : Probe, y i : Referenz Standardabweichung: S x = 1 n "1 ( )n n # i=1 ( x i " x ) 2 S y = 1 m "1 ( )m m # i=1 ( y i " y ) 2 Standardabweichung des Verhältnises x y ± 1 y 2 x 2 S y + y 2 S x
21 Simulation der Wahrscheinlichkeit eines korrekten Nachweises fold change: 1.5 (black) 2 (red) 2.5 (green) 3 (blue) 5 (yellow) 10 (magenta) Anzahl Wiederholungen
22 Clusteranalyse Zur Messung von Ähnlichkeiten in der Expression werden Abstände im Expressionsraum definiert: d q (x n, x m ) = $ & % p # i=1 ' q x ni " x mi ) ( 1 q q=1 (Manhattan), q=2 (Euklidisch)
23
24 Reverse Engineering Genetic Networks Reverse engineering of Boolean networks aims to derive the Boolean interaction rules from time-dependent gene expression data (or from knockout experiments).
25 Das genetische Netzwerk der embryonalen Entwicklung des Seeigels
26 Network Motifs Monod-Jacob (1961): It is obvious from the analysis of these [bacterial genetic regulatory] mechanisms that their known elements could be connected into a variety of circuits endowed with any desired degree of stability. Network motifs are small subnetworks (max 5 nodes?) perform specific information processing tasks (= natural circuits ) repeat (in a statistically significant way) are (probably) evolutionarily conserved are analogous to protein motifs (Wolf-Arkin, June 03)
27 GRN Motif example Feedforward Loop A regulator that controls a second Regulator and together they bind a common target gene Function A switch for rejecting transient input (Milo et al, Science 02)
28 Motif classes (1) [D.Wolf, A. Arkin ]
29 Motif classes (2) [D.Wolf, A. Arkin ]
30 Motif clusters Recent observation [Dobrin et al ]: Specific motif types aggregate to form large motif clusters Example: in E.coli GRN, most motifs overlap, generating homologous motif clusers ( specific motifs are no longer clearly separable) More research on motif interaction needed! (Barabasi-Oltvai Feb 04)
31 What are (functional) modules? Diverse characteristics proposed: chemically isolated operating on different time or spatial scales robust independently controlled significant biological function evolutionarily conserved clustered in the graph theory sense... any combination of the above Biochemistry Biophysics Control Engineering Biology Mathematics
32 Programming Cells plasmid = user program Vision Ron Weiss (Princeton) A new substrate for engineering: living cells interface to the chemical world cell as a factory / robot Logic circuit = process description extend/modify behavior of cells Challenge: engineer complex, predictable behavior
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