RIDASCREEN FAST Peanut

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1 RIDASCREEN FAST Peanut Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Erdnuss Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of peanut Art. No.: R6202 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm AG Landwehrstr. 54 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme ( ) Sekretariat Marketing ( ) Telefax / Auftragsannahme ( ) [email protected] Marketing ( ) [email protected] RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany 2 RIDASCREEN FAST Peanut

3 Inhaltsverzeichnis Seite Kurzinformation Verwendungszweck Allgemeines Testprinzip Packungsinhalt Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör Vorsichtsmaßnahmen Reagenzien und ihre Lagerung Anzeichen für Reagenzienverfall Probenvorbereitung Testdurchführung Auswertung Sensitivität Spezifität Contents Page Brief information Intended use General Test principle Reagents provided Materials required but not provided Warnings and precautions for the users Storage instructions Indication of instability or deterioration of reagents Preparation of samples Test implementation Results Sensitivity Specificity Appendix Literature RIDASCREEN FAST Peanut

4 Kurzinformation RIDASCREEN FAST Peanut (Art. Nr.: R6202) Sandwich-Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Erdnuss bzw. Erdnussanteilen in Lebensmitteln. Zerealien, Gebäck, Eiscreme und Milchschokolade wurden nach dem Performance Tested Method Program vom AOAC Research Institute mit der Lizenz-Nr validiert. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards - sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 48 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Bestimmungsgrenze: Spezifität: homogenisieren, extrahieren und zentrifugieren Probenvorbereitung (für 10 Proben)... ca. 20 min Testdurchführung... ca. 30 min (unabhängig von der Probenzahl) 1,5 ppm Erdnuss entsprechend 0,00015 % Erdnuss 2,5 ppm Erdnuss entsprechend 0,00025 % Erdnuss Der eingesetzte polyklonale Antikörper erkennt spezifische Erdnuss-Antigene, unter anderen das wichtige Allergen Ara h1. 4 RIDASCREEN FAST Peanut

5 1. Verwendungszweck Der RIDASCREEN FAST Peanut-Test ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Erdnuss bzw. Erdnussanteilen in Lebensmitteln. 2. Allgemeines Die Erdnuss (Arachis hypogeae) ist eine sehr nahrhafte Frucht und wird deshalb als Lebens- und auch als Futtermittel verwendet. Erdnüsse zählen aber auch zu den stärksten allergenen Lebensmitteln. Der hohe Proteinanteil von ca. 25 % steht nicht nur für die Nahrhaftigkeit, sondern auch für das allergische Potential dieser Frucht. Etwa 7-10 % vom Gesamtproteingehalt besteht aus allergenen Proteinen (z.b. Arachine und Conarachine). Selbst Spuren von Erdnuss im mg-bereich führen bei hoch sensibilisierten Allergikern zu Symptomen. Die Symptome reichen von leichten allergischen Hautreaktionen bis zum tödlich verlaufenden anaphylaktischen Schock. Erdnussallergiker müssen daher den Verzehr von Erdnüssen oder erdnusskontaminierten Lebensmitteln strikt vermeiden. Bei entsprechend gekennzeichneten Produkten stellt das auch kein Problem dar. Schwierig wird es, wenn Erdnüsse als versteckte Lebensmittelzutaten oder Kontaminationen in fertigen Lebensmitteln vorhanden sind, und der Verbraucher dies nicht erkennt oder vermutet. Im Sinne des vorbeugenden Verbraucherschutzes wurde in der Vergangenheit die Analytik von Erdnussproteinen weiter vorangetrieben. Die Rocket-Immunelektrophorese (RIE), die FPLC und der Enzymimmunoassy (ELISA) stellen derzeit einen wesentlichen Beitrag zur Erhöhung der Produktsicherheit für Erdnussallergiker dar. Mit dem RIDASCREEN FAST Peanut-Test ist es möglich, Erdnuss in Lebensmitteln sicher nachzuweisen. Erdnuss kann entweder als Ingredienz oder als Kontamination in rohen oder gekochten Lebensmitteln vorhanden sein. 3. Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit spezifischen Antikörpern gegen Erdnussprotein beschichtet. Durch Zugabe von Standard oder Probe kommt ein Antikörper-Antigen-Komplex zustande. In der Probe vorhandenes Erdnussprotein wird gebunden. Nach abgeschlossener Inkubation werden in einem Waschschritt die nicht gebundenen Anteile entfernt. Danach erfolgt die Zugabe eines Peroxidase-gekoppelten zweiten Antikörpers (Enzymkonjugat). Dieses Konjugat bindet an die an der Platte fixierten Antikörper-Antigen-Komplexe. Nach erneuter Inkubation und anschließender Auswaschung überschüssiger Reagenzien erfolgt der Nachweis durch RIDASCREEN FAST Peanut

6 Zugabe von Substrat/Chromogen. Das an den Antikörper gebundene Enzym wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp- Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm. 4. Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung können 48 Bestimmungen durchgeführt werden (einschließlich Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält: 1 x Mikrotiterplatte mit 48 Kavitäten (6 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit anti-erdnuss-antikörpern 5 x Standards *), je 1,3 ml 0 ppm (Nullstandard), 2,5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm Erdnussextrakt in wässriger Lösung, gebrauchsfertig 1 x Konjugat (6 ml)...roter Verschluss Peroxidase-konjugierter Antikörper, gebrauchsfertig 1 x Substrat-/Chromogenlösung (10 ml)... blauer Verschluss rötlich gefärbt 1 x Stopp-Reagenz (14 ml)... gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure 1 x Extraktionspuffer (125 ml)... weißer Verschluss als 20fach Konzentrat 1 x Waschpuffer (100 ml)...brauner Verschluss als 10fach Konzentrat *) Die Konzentrationsangaben berücksichtigen bereits den Verdünnungsfaktor 20, der sich aus der Probenvorbereitung ergibt. So können die Erdnuss- Konzentrationen der Proben direkt aus der Standardkurve abgelesen werden. 6 RIDASCREEN FAST Peanut

7 5. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Zentrifuge + zentrifugierbare Reagenzgläser Schüttler Wasserbad Schlagmühle, Mörser, Ultra-Turrax oder Homogenisator Messpipetten 100 µl-mikropipetten 5.2. Reagenzien: destilliertes oder deionisiertes Wasser 6. Vorsichtsmaßnahmen Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure. Hautkontakt mit dem Reagenz vermeiden. Der Puffer enthält Thimerosal, Hautkontakt vermeiden. Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht möglich. 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Den Testkit auf keinen Fall einfrieren. Das Konjugat darf auf keinen Fall eingefroren werden, da das Einfrieren zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Lagertemperatur von 2-8 C immer einhalten und den Hersteller informieren, sollte ein Präzipitat beobachtet werden. Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. RIDASCREEN FAST Peanut

8 8. Anzeichen für Reagenzienverfall Eine bläuliche Verfärbung der rötlich gefärbten Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten weist auf einen Reagenzienverfall hin. Eine Extinktion kleiner 0,8 (E 450 nm < 0,8) für Standard 5 weist ebenfalls auf einen Reagenzienverfall hin. 9. Probenvorbereitung 1. Erdnussspuren aus früheren Analysen müssen unbedingt entfernt werden! Die Aufarbeitung der Proben sollte daher in gut gespülten oder neuen Glasgefäßen vorgenommen werden. 2. Arbeitsgeräte, wie z. B. Schlagmühle, müssen ebenfalls nach jeder Probe gründlich gereinigt werden, um Erdnussreste zu entfernen. 3. Das Extraktionspufferkonzentrat auf ca. 37 C erwärmen, gut mischen und dann 1:20 (1+19) verdünnen (z.b. 100 ml Konzentrat zu 1900 ml dest. Wasser hinzugeben) und gut mischen oder den gesamten Flascheninhalt auf 2500 ml mit dest. Wasser verdünnen (siehe 10.4.). 5 g Probe sorgfältig zerstoßen, fein zermahlen und gut mischen 1 g Probe abnehmen und mit 20 ml Extraktionspuffer (der Extraktionspuffer sollte eine Temperatur von ca. 60 C haben) versetzen, intensiv mischen und für 10 min bei 60 C unter gelegentlichem Schütteln extrahieren (alternativ ist eine Extraktion für 60 min bei Raumtemperatur (20-25 C) unter Schütteln möglich) zentrifugieren: 10 min / 2500 g / möglichst bei 4 C oder filtrieren (alternativ 2 ml des Extraktes in ein Reaktionsgefäß überführen und in einer Eppendorfzentrifuge für 10 min hochtourig zentrifugieren). 100 µl Überstand oder Filtrat pro Kavität im Test einsetzen Die Probenextrakte sind bei 2-8 C etwa 5 Tage haltbar. Nicht verwendete Extrakte können bei -20 C einige Monate aufbewahrt werden. 8 RIDASCREEN FAST Peanut

9 10. Testdurchführung Testvorbereitungen 1. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. 2. Nicht verwendete Reagenzien sofort wieder bei 2-8 C lagern. 3. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 4. Die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der Kavitäten ab. Die beschriebenen Waschsequenzen deshalb immer einhalten. 5. Bei allen Inkubationen direkte Sonneneinstrahlung vermeiden und deshalb die Mikrotiterplatten abdecken Antikörper-beschichtete Mikrotiterstreifen Den Folienbeutel an der Querseite entlang der Verschlussleiste aufschneiden. Die benötigten Kavitäten zusammen mit dem Halterahmen entnehmen. Die nicht benötigten Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Pro Testansatz sollten nicht mehr als 3 Mikrotiterstreifen (24 Kavitäten) verwendet werden Standardlösungen Die Erdnuss-Standards liegen gebrauchsfertig vor. Der Verdünnungsfaktor 20 für die Proben wurde beim Etikettieren der Standardfläschchen bereits berücksichtigt. Deshalb kann die Erdnuss-Konzentration der Proben direkt aus der Standardkurve abgelesen werden Extraktionspuffer Der Extraktionspuffer liegt als 20fach Konzentrat vor (siehe 4.) und muss vor Gebrauch auf ca. 37 C erwärmt, gut gemischt und 1:20 (1+19) verdünnt werden (z. B. 100 ml Pufferkonzentrat ml dest. Wasser, oder alternativ den gesamten Flascheninhalt mit dest. Wasser auf 2500 ml auffüllen). Der 1:20 verdünnte Puffer hat eine Haltbarkeit von zwölf Wochen bei 2-8 C. Vor dem Verdünnen darauf achten, dass evtl. gebildete Kristalle vollständig durch Erwärmen im Wasserbad bei 37 C gelöst werden. RIDASCREEN FAST Peanut

10 10.5. Waschpuffer Der Waschpuffer liegt als 10fach Konzentrat vor (siehe 4.) und muss vor Gebrauch 1:10 (1+9) verdünnt werden (z. B. 100 ml Pufferkonzentrat ml dest. Wasser). Der 1:10 verdünnte Puffer hat eine Haltbarkeit von vier Wochen bei 2-8 C. Vor dem Verdünnen darauf achten, dass evtl. gebildete Kristalle vollständig durch Erwärmen im Wasserbad bei 37 C gelöst werden Testdurchführung 1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren. 2. Je 100 µl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 10 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 3. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.5.) waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen. 4. Je 100 µl Enzymkonjugat-Lösung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren, vorsichtig manuell mischen und weitere 10 min bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 5. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.5.) waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen. 6. Je 100 µl der rötlich gefärbten Substrat-/Chromogenlösung in die Kavitäten pipettieren, vorsichtig manuell mischen und 10 min bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren 7. Je 100 µl Stopp-Reagenz in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 60 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. Der Abgleich des Nullwertes erfolgt gegen Luft. 10 RIDASCREEN FAST Peanut

11 11. Auswertung Die photometrisch erzielten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Erdnuss-Konzentration in mg/kg (ppm) auftragen. Die der Extinktion der jeweiligen Proben entsprechende Erdnuss-Konzentration in mg/kg (ppm) aus der Eichkurve ablesen. Der Null-Standard sollte nicht > 0,15 E 450 nm sein (eine höhere E 450 nm des Null- Standards weist auf ein ungenügendes Waschen hin). Proben mit einer Extinktion > 1,2 sollten nochmals bestimmt werden. Die Proben sollten so weit verdünnt werden, dass sie im linearen Teil der Kurve abgelesen werden können. Bitte beachten: Beim Arbeiten nach der angegebenen Vorschrift gilt der Verdünnungsfaktor 20. Die Erdnuss-Konzentration in der Probe kann direkt aus der Standardkurve abgelesen werden. Anmerkung: Für die Auswertung des ELISA-Tests ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN Tests entwickelte Software, die RIDA SOFT Win, erhältlich. RIDASCREEN FAST Peanut

12 12. Sensitivität Die untere Nachweisgrenze des RIDASCREEN FAST Peanut-Tests liegt bei 1,5 mg/kg (ppm) oder 0,00015 % Erdnussanteil in der Probe. Das ist die Erdnuss- Konzentration, die sich signifikant vom Nullstandard unterscheidet. Die Nachweisgrenze wurde berechnet auf der Grundlage einer Mehrfachmessung von Nullproben der validierten Probenmaterialien (Nachweisgrenze = Mittelwert von Nullproben + 3 x Standardabweichung). Die Bestimmungsgrenze liegt bei 2,5 ppm Erdnuss absorbance Peanut (ppm) [mg/kg] Abb. 1: Eichkurve eines RIDASCREEN FAST Peanut Testkits 12 RIDASCREEN FAST Peanut

13 13. Spezifität Der RIDASCREEN FAST Peanut-Test erfasst alle Erdnussproteine, u.a. das in allen Erdnüssen vorkommende Erdnuss-Allergen Ara h1 und weist damit Erdnuss in Lebensmitteln nach. Extrakte aus Hafer, Mais, Weizen, Gerste, Sesam oder Soja stören den Test nicht. Verschiedene Nüsse wie Haselnuss, Mandel, Walnuss, Cashew, Pistazie, Pecanuss wurden getestet. Aufgrund der extrem niedrigen Reaktivität stören diese Sorten den Test nicht (E 450 nm <0,1). Erdnuss kann in Schokoladenmatrizes prinzipiell nachgewiesen werden, die Bestimmung erweist sich jedoch meist als schwierig (die Wiederfindung kann durch Maskierung der Erdnussantigene herabgesetzt sein). Zur Demaskierung der Antigene empfehlen wir, während der Extraktion dem Ansatz 7 g Magermilchpulver (z.b. Fa. Oxoid, oder sprühgetrocknetes Magermilchpulver) zuzusetzen. Bei hohem Kakaoanteil (> 20 %) sogar 10 g. Dies gilt auch für Eiscreme. RIDASCREEN FAST Peanut wurde in einer unabhängigen Studie unter der Leitung des AOAC Research Instituts mit den Probenmaterialien: Zerealien, Gebäck, Eiscreme und Milchschokolade in drei US-Laboratorien validiert. Jedes Labor untersuchte dazu von jeder Matrix 20 Nullproben und 20 Proben, die mit 5 ppm Erdnuss dotiert waren. Zwei von 240 Nullproben wurden positiv (> 2.5 ppm) gemessen. Dies ergab eine Spezifität von 99,2 % (238/240). Alle dotierten Proben (240/240) wurden positiv gefunden (Sensitivität = 100 %). Der für diesen Test verwendete Erdnussextrakt enthält ca. 10 % Protein. Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, dass eine Erdnusskontamination unterhalb der Nachweisgrenze dieses Testes vorliegt oder dass andere Komponenten aus Erdnuss, wie z.b. Lipide, in einer Probe enthalten sein können. Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht. RIDASCREEN FAST Peanut

14 RIDASCREEN FAST Peanut Enzyme immunoassay for the quantitative analysis peanut Brief information RIDASCREEN FAST Peanut (Art. No.: R6202) Sandwich enzyme immunoassay for the quantitative analysis of peanut and parts of peanut in food. Breakfast cereals, cookies, ice cream and milk chocolate are approved by AOAC Research institute according to the Performance Tested Method Program with the license no All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 48 determinations (including standards). A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification. Sample preparation: Time requirement: homogenization, extraction and centrifugation sample preparation (for 10 samples)...approx. 20 min test implementation...approx. 30 min (regardless of the number of samples) Limit of detection: 1.5 ppm peanut corresponding to % peanut Limit of quantification: 2.5 ppm peanut corresponding to % peanut Specificity: The polyclonal antibody specifically detects antigens from peanuts, including the major allergen Ara h1. 14 RIDASCREEN FAST Peanut

15 1. Intended use The RIDASCREEN FAST Peanut test is a sandwich enzyme immunoassay for the quantitative analysis of peanut or contamination of peanut in food. 2. General Peanut (Arachis hypogeae) is a very nutritious fruit among the legume family. Unfortunately peanuts belong to the most allergenic foods. Nearly 7-10 % of the total protein content (about 25 %) consists of allergic proteins (i.e. Arachine, Conarachine). Even consumption of few milligrams of peanut can induce allergic reactions in highly allergic persons. Symptoms range from allergic skin reactions up to death due to anaphylactic shock. Since peanut allergy is persistent during life and treatment of this allergy is not possible, avoiding peanuts is extremely important for these patients. Traces of peanut contamination in food, cosmetics, or drinks are difficult to detect. For the protection of consumers against peanut contaminations, methods like rocket immuno electrophoresis, FPLC and enzyme immunoassay (ELISA) have been established. This may contribute to increased safety of products for peanut allergic patients. With the RIDASCREEN FAST Peanut test it is possible to detect peanuts or parts of peanuts in food, whether ingredient component or contamination in raw and cooked food. 3. Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The wells of the microtiter strips are coated with specific antibodies against peanut proteins. By adding the standard or sample solution to the wells, present peanut protein will bind to the specific capture antibodies. The result is an antibody-antigen-complex. Sample components not bound by the antibodies are then removed in a washing step. The bound peanut protein is detected by an antibody conjugated to peroxidase (enzyme conjugate). Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step. Substrate/ chromogen is added to the wells and incubated. Bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm. RIDASCREEN FAST Peanut

16 4. Reagents provided Each kit contains sufficient materials for 48 measurements (including standard analyses). Each test kit contains: 1 x Microtiter plate with 48 wells (6 strips with 8 removable wells each) coated with anti-peanut antibodies 5 x Standards *), 1.3 ml each 0 ppm (zero standard), 2.5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm peanut extract in aqueous solution; ready to use 1 x Conjugate (6 ml)...red cap peroxidase conjugated antibody, ready to use 1 x Substrate/Chromogen (10 ml)... blue cap stained red 1 x Stop solution (14 ml)...yellow cap contains 1 N sulfuric acid 1 x Extraction buffer (125 ml)... white cap as a 20fold concentrate 1 x Washing buffer (100 ml)... brown cap as a 10fold concentrate *) The dilution factor 20 for the sample has already been considered when labeling. Therefore, the peanut concentrations of samples can directly be read from the standard curve. 5. Reagents required but not provided 5.1. Equipment: microtiter plate spectrophotometer (450 nm) centrifuge + centrifugal glass vials shaker water bath laboratory mincer / grinder, pestle and mortar, Ultra-Turrax or homogenisator graduated pipettes 100 µl-micropipettes 5.2. Reagents: distilled or deionized water 16 RIDASCREEN FAST Peanut

17 6. Warnings and precautions for the users The stop solution contains 1 N sulfuric acid. Avoid contact of the reagent with the skin. The buffer contains thimerosal. Avoid contact of the reagent with the skin. Do not use RIDASCREEN FAST Peanut kit past the expiration date on the kit label. Dilution or adulteration of these reagents may result in loss of sensitivity. Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C (35-46 F). DO NOT FREEZE. The conjugate included in the kit is susceptible to freezing. This can potentially causes false results. Please ever follow the storage conditions (2-8 C) and notify your distributor if excessive precipitate is observed. Return any unused microwells to their original foil bag and reseal them together with the desiccant provided. The substrate-/chromogen solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. 8. Indication of instability or deterioration of reagents Any bluish coloration of the red stained substrate-/chromogen solution is indicative of deterioration and the reagent should be discarded. A value of less than 0.8 absorbance units (A 450 nm < 0.8) for standard 5 may indicate deterioration of reagents. 9. Preparation of Samples 1. Peanut residues of previous analyses have to be removed completely! Therefore, samples should be prepared in new or very well cleaned glass vials. 2. Tools such as mincers have to be cleaned thoroughly after use, in order to avoid spreading traces of peanut. RIDASCREEN FAST Peanut

18 3. The extraction buffer is provided as a 20fold concentrate, before use the buffer concentrate should be heated up to approx. 37 C (99 F). After shaking the buffer concentrate has to be diluted 1:20 (1+19), i.e. 100 ml concentrate add to 1900 ml dist. water (or dilute the complete content of the flask with dist. water up to 2500 ml) and shake well (see 10.4.). 5 g of the sample should be ground well and thoroughly mixed weigh 1 g of sample, add 20 ml extraction buffer (the extraction buffer should have already been heated to approx. 60 C (140 F)) mix intensively and extract for 10 min at 60 C (140 F) by shaking (alternatively an extraction by shaking for 60 min at room temperature (20-25 C / F) is also possible) centrifuge: 10 min / 2500 g / if possible at 4 C (39 F) or filter the sample extract (Alternativly 2 ml of the extract can be centrifuged in reaction caps by using a microcentrifuge) use 100 µl of the supernatant or filtrate per well in the assay Remark: The sample extracts can be stored at 2-8 C (35-46 F) for 5 days. The extracts can be stored at -20 C (-4 F) for several months. 10. Test implementation Preliminary comments 1. Bring all reagents to room temperature (20-25 C / F) before use. 2. Return all reagents to 2-8 C (35-46 F) immediately after use. 3. Do not allow microwells to dry between working steps. 4. Reproducibility in any EIA is largely dependent upon the consistency with which the microwells are washed. Carefully follow the recommended washing sequence as outlined in the EIA test procedure. 5. Avoid direct sunlight during all incubations. Covering the microtiter plates is recommended. 18 RIDASCREEN FAST Peanut

19 10.2. Antibody-coated microtiter strips The foil bag is cut open along the transverse side beyond the zip. The required wells are extracted together with the frame. Those wells not required are kept together with the drying agent, well sealed in the foil bag, and should continuously be stored at 2-8 C (35-46 F). Don t use more than 3 strips (24 wells) per run Standard solutions The peanut standards are provided ready to use. The dilution factor 20 for the sample has been considered when labeling. Therefore the peanut concentrations of the samples can be read directly from the standard curve Extraction buffer The extraction buffer is provided as a 20fold concentrate. Before use the buffer concentrate has to be heated up to approx. 37 C (99 F) and well mixed. Then the buffer concentrate has to be diluted 1:20 (1+19) with dist. water (i.e. 100 ml buffer concentrate ml dist. water) or dilute the complete content of the flask up to 2500 ml with dist. water. The diluted buffer is stable at 2-8 C (35-46 F) for twelve weeks. Before dilution dissolve eventually formed crystals in a water bath at 37 C (99 F) completely Washing buffer The washing buffer is provided as a 10fold concentrate. Before use the buffer has to be diluted 1:10 (1+9) with water (i.e. 100 ml buffer concentrate ml dist. water). The diluted buffer is stable at 2-8 C (35-46 F) for four weeks. Before dilution dissolve eventually formed crystals in a water bath at 37 C (99 F) completely. RIDASCREEN FAST Peanut

20 10.6. Test procedure 1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run. Record standard and sample positions. 2. Add 100 µl of each standard solution or prepared sample to separate wells and incubate for 10 min at room temperature (20-25 C / F ). 3. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 µl washing buffer (see 10.5.) and pour out the liquid again. Repeat two more times. 4. Add 100 µl of the enzyme conjugate to each well. Mix gently by rocking the plate manually and incubate for 10 min at room temperature (20-25 C / F). 5. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 µl washing buffer (see 10.5.) and pour out the liquid again. Repeat two more times. 6. Add 100 µl of the reddish substrate-/chromogen solution to each well. Mix gently by rocking the plate manually and incubate for 10 min at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 7. Add 100 µl of the stop solution to each well. Mix gently by rocking the plate manually and measure the absorbance at 450 nm against an air blank. Read within 60 minutes after addition of stop solution. 11. Results The mean values of the absorbance values obtained for the standards are entered in a system of coordinates on semi logarithmic graph paper against the peanut concentration in mg/kg (ppm). The peanut concentration corresponding to the absorbance of each sample can be read from the calibration curve. The zero standard shouldn t be > 0.15 A 450 nm (higher values show insufficient washing). Samples with absorbance values of > 1.2 should be analyzed once more. A further dilution is recommended, so that the results can be read in the linear part of the calibration curve. Please note: When working in accordance with the regulation stated, the dilution factor is 20. The peanut concentration can be read directly from the standard curve. 20 RIDASCREEN FAST Peanut

21 Remark: For evaluation of the ELISA kits special software for the RIDASCREEN tests has been developed by R-Biopharm. The RIDA SOFT Win can be ordered from your local distributor. 12. Sensitivity The detection limit of the RIDASCREEN FAST Peanut test is 1.5 mg/kg (ppm) peanut or % contamination of peanut in a sample. This is the peanut concentration which is significantly different from the zero standard calculated by repeated measurement of blank samples of the validated matrices (mean value + 3 x standard deviation of that measurement). The limit of quantification is 2.5 ppm peanut absorbance Peanut (ppm) [mg/kg] Fig. 1: Calibration curve of a RIDASCREEN FAST Peanut kit RIDASCREEN FAST Peanut

22 13. Specificity The RIDASCREEN FAST Peanut test detects peanut proteins, including the peanut allergen Ara h1 which is found in all peanuts, and therefore is suitable to detect peanut in food. Extracts from oat, corn, wheat, barley, sesame or soy do not interfere with the test. Different kinds of nuts like hazelnut, almond, walnut, cashew, pistachio and peca were investigated and show only an extremely low reactivity. Therefore an interference with these kinds of nuts is not evident (A 450 nm < 0.1). In general the detection of peanut in chocolate is possible, but very often the chocolate matrix covers the peanut proteins in a way, that the recovery rate is decreased. Therefore, addition of 7 g skim milk powder (Oxoid, or lyophilized skim milk powder) to the extract is recommended. Sample extracts with high cocoa concentration (> 20 %) should be supplemented with 10 g skim milk powder each. This is also true for ice cream. RIDASCREEN FAST Peanut was validated with breakfast cereals, cookies, ice cream and milk chocolate in an independent study by three independent US laboratories under the supervision of AOAC Research Institute. Each laboratory analysed 20 blank samples and 20 samples spiked at 5 ppm peanut of each matrix. Two of 240 blank samples were measured positive (< 2.5 ppm peanut) corresponding to a specificity of 99.2% (238/240). All of the spiked samples (240/240) were found positive (sensitivity = 100%). The peanut extract used for this kit has a protein content of approx. 10 %. Samples tested negative still could contain a peanut contamination below the limit of detection of the assay, or they might contain other peanut components like lipids for example. R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. 22 RIDASCREEN FAST Peanut

23 Literature Appendix 1. Skin, D.S. et al.: J. Biol. Chem. Vol 273 (22) (1998): Biochemical and Structural Analysis of the IgE Binding Sites on Ara h1, an Abundant and Highly Allergenic Peanut Protein 2. Jong, E.C. dc et al.: Clin. Exp. Allergy Vol 28, 743 (1998): Identification and partial characterization of multiple major allergens in peanut proteins 3. Sampson, H.A. et al.: Ann. Rev. Nutr. 16, 161 (1996): Mechanisms of food allergy 4. Koppelmann, S. et al. : World of ingredients, 19, (1996) : Detecting Peanut Allergens 5. Assem, E.S.K. et al.: Brit. Med. J (1990): Anaphylaxis induced by peanuts 6. Bock, S.A. et al.: J. Allergy Clin. Immunol. 83, 900 (1989) : The natural history of peanut allergy RIDASCREEN FAST Peanut