Labor information. Pränatale Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) Microarray-basierte vergleichende genomische Hybridisierung
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- Lilli Pfeiffer
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1 Labor information Pränatale Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) Microarray-basierte vergleichende genomische Hybridisierung
2 Die Array-CGH-Analyse (kurz: Array-CGH) ist eine hoch auflösen de diagnostische Untersuchung und bei Feten mit folgenden Kriterien indiziert: Indikationen bei auffälligem Ultraschall und Ausschluss einer Trisomie 21, 13, 18 und eines Turner- Syndroms durch einen Schnelltest zur Präzisierung der Chromosomenanalyse: Exakte Bruchpunktbestimmung, genaue Charakterisierung bei zytogenetisch erkennbaren Zugewinnen und Verlusten (inkl. Markerchromosomen) zur Abklärung neu entstandener balanciert erscheinender Chromosomenveränderungen beim Feten Prinzip der Methode Bei der Array-CGH wird das gesamte Genom des Feten mit dem von vielen klinisch unauffälligen Personen im Hinblick auf Verluste und Zugewinne genetischen Materials (Imbalancen) verglichen. Die DNA des Feten und die DNA von gesunden Referenz- Personen werden mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert und im Anschluss auf dem Array hybridisiert. Der Microarray ist ein Glasobjektträger, auf dem sich in einem Rastermuster immobilisierte genomische DNA-Fragmente (sog. Oligonukleotide) befinden. Liegt ein genomischer Verlust oder Zugewinn in der fetalen Probe vor, so zeigt sich dies durch eine gegenüber der Referenz-DNA abweichende Hybridisierung. Dies äußert sich in einer Farbveränderung des Fluoreszenzsignals, die von einem Laserscanner detektiert wird. Anschließend werden die Daten extrahiert und mit einer speziellen Software ausgewertet. Im Vergleich zur Chromosomenanalyse können Triploidien und balancierte Chromosomenveränderungen durch die Array-CGH nicht zuverlässig nachgewiesen werden. Da jeder pränatalen Array-CGH ein Aneuploidie-Schnelltest oder eine Chromosomenanalyse vorausgehen sollte, werden Triploidien auf diesem Wege jedoch frühzeitig erkannt. In weniger als 1 % der pränatalen Chromosomenanalysen werden balancierte Chromosomenveränderungen vorgefunden [1, 2], und nur ca. 6 % der de novo entstandenen scheinbar balancierten Veränderungen werden als pathogen eingestuft [2]. Imbalancen im Mosaik können durch die Array- CGH nicht zuverlässig detektiert werden. Bei diesen Veränderungen hat die konventionelle Chromosomenanalyse den Vorteil, besonders gering (<10 %) und hochgradige (>80 %) Mosaike besser als die Array-CGH erkennen zu können [3]. Dagegen können durch eine Array- CGH an unkultiviertem Probenmaterial Mosaike von Imbalancen erkannt werden, welche bei einer Chromosomenanalyse nach Zellkultur durch einen Selektionsnachteil der aberranten Zellen in einigen Fällen nicht mehr nachweisbar sind. Untersuchungsplattform Wir führen pränatale Array-CGH mit einem auf Oligonukleotiden basierenden Microarray- Ansatz, dem SurePrint G3 Human CGH-Microarray (180K) der Firma Agilent Technologies, durch. Diese Array-Plattform wird in unserem Labor seit mehreren Jahren für die postnatale Diagnostik verwendet, so dass wir über eine langjährige Erfahrung und somit auch über eine profunde Datenlage zur Einschätzung von seltenen Kopienzahlveränderungen (copy number variations, CNVs) verfügen.
3 Klinischer Nutzen und Einschränkungen Die Array-CGH erlaubt eine Überprüfung des gesamten fetalen Genoms auf genetische Imbalancen mit einer signifikant höheren Auflösung und somit größeren diagnostischen Ausbeute, als dies durch die konventionelle Chromosomenanalyse bislang möglich war. Mittels einer herkömmlichen Karyotypisierung lassen sich bei ca. 15 % der Feten mit auffälligem Ultraschall Imbalancen ab einer Größe von ca Mb nachweisen [4, 5]. Bei der Array-CGH können zusätzlich auch viel kleinere pathologische Abweichungen (Mikrodeletionen und -duplikationen) im Genom des Feten erkannt werden [6, 7, 8], so dass mittels dieser Methode klinisch relevante Imbalancen bei insgesamt 25 % der Feten mit auffälligem Ultraschall nachgewiesen werden können. Daher wird in vielen Publikationen und internationalen Leitlinien die pränatale Array-CGH bereits als erste genetische Untersuchung empfohlen [8, 9, 10]. Bei der Array-CGH können auch CNVs nachgewiesen werden, deren klinische Relevanz unklar ist. Diese unklaren CNVs können oft durch Elternuntersuchungen besser eingeschätzt werden. Gibt es keine Anhaltspunkte für eine Pathogenität identifizierter CNVs, so werden diese im Befund nicht mitgeteilt [9]. Bei Imbalancen, die mit einer inkompletten Penetranz (Prädispositionsfaktoren) oder einer variablen Expressivität bezüglich einer Erkrankung einhergehen, ist eine klinische Prognose im pränatalen Kontext oft nicht möglich. Imbalancen mit einer unbekannten oder niedrigen Penetranz werden daher nicht mitgeteilt, wenn die mit dem CNV assoziierte Erkrankung nicht mit den vorliegenden Ultraschallauffälligkeiten in kausale Verbindung gebracht werden können. Auch können CNVs, die mit einer Anlageträgerschaft für eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung oder einer spätmanifesten Erkrankung assoziiert sind, erkannt werden. Gemäß dem deutschen Gen-Diagnostikgesetz (GenDG) werden diese Zufallsbefunde im pränatalen Kontext nicht mitgeteilt [11]. Nach Vollendung des 18. Lebensjahres kann jedoch der Patient mögliche Zufallsbefunde dieser Untersuchung abfragen. Aufgrund der Komplexität dieser Diagnostik ist eine humangenetische Beratung der Schwangeren sowohl vor als auch nach der Untersuchung erforderlich [10, 11]. Hierbei sollte sowohl auf die Befundung ausschließlich von klinisch-relevanten CNVs als auch auf die mögliche Notwendigkeit einer nachfolgenden Elternuntersuchung zur besseren Einschätzung von nachgewiesenen CNVs eingegangen werden. Das schriftliche Einverständnis der Schwangeren ist hierbei die Voraussetzung für die Durchführung der pränatalen Array-CGH. Benötigtes Material insgesamt ca. 20 ml Fruchtwasser / 30 mg Chorionzotten für Chromosomen- und Array- CGH-Analyse wichtig: EDTA- / Heparin-Blut* der Mutter bzw. der Eltern für einen mütterlichen Kontaminationsausschluss bzw. für eine zeitnahe weiterführende Untersuchung bei unklaren CNVs (siehe Klinischer Nutzen ) *Monovette- oder Vacutainer-Röhrchen
4 Dauer der Untersuchung ca. 10 Arbeitstage Beispiel Interstitielle Duplikation in 4q34.3-q35.2 und terminale Deletion in 4q35.2 A B Scatterplotansicht des Chromosoms 4, das die Duplikation (horizontale Verschiebung rechts von der Nulllinie) und die Deletion (horizontale Verschiebung links von der Nulllinie) bei 4q34.3-q35.2 und 4q35.2 zeigt. Die Imbalancen sind blau unterlegt. Vergrößerte Ansicht eines ca. 14 Mb großen Fensters, das die Duplikation und die Deletion enthält.
5 Literatur [1] Wapner RJ et al.: Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med 2012; 367: [2] Warburton D: De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker chromosomes identified at prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of breakpoints. Am J Hum Genet 1991; 49: [3] Bi W et al.: Comparison of chromosome analysis and chromosomal microarray analysis: what is the value of chromosome analysis in today s genomic array era? Genet Med 2013; 15: [4] Nicolaides KH et al.: Ultrasonographically detectable markers of fetal chromosomal abnormalities. Lancet 1992; 340: [8] Callaway LA et al.: The clinical utility of microarray technologies applied to prenatal cytogenetics in the presence of a normal conventional karyotype: a review of the literature. Prenat Diagn 2013; 33: [9] Vannakker O. et al.: Implementation of genomic arrays in prenatal diagnosis: the Belgian approach to meet the challenges. Eur J Med Genet 2014, doi: /j.ejmg [10] The American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) Committee Opinion No. 581: The use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis. Obstetrics & Gynecology 2013; 122: [11] Gesetz über genetische Untersuchungen bei Menschen (Deutsches Gendiagnostikgesetz, GenDG), Bundesgesetzblatt Jahrgang 2009; Teil I Nr. 50: [5] Kagan KO et al.: Ultrasound findings before amniocentesis in selecting the method of analysing the sample. Prenat Diagn 2007; 27: 34-9 [6] Hillman SC et al.: Use of prenatal chromosomal microarray: prospective cohort study and systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2013; 41: [7] Brady PD et al.: A prospective study of the clinical utility of prenatal chromosomal microarray analysis in fetuses with ultrasound abnormalities and an exploration of a framework for reporting unclassified variants and risk factors. Genet Med 2013 Oct 31. doi: /gim
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