3 Materialien. 3.1 Geräte. Folgende spezielle Geräte wurden in dieser Arbeit verwendet. Invert-Mikroskop Axiovert 25. (Sonnenbühl-Genkingen)
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1 3 Materialien 3.1 Geräte Folgende spezielle Geräte wurden in dieser Arbeit verwendet. Geräte Autoklav H+P Varioclav Typ 250 T Brutschrank Memmert INCO 2 Eppendorf Multipipette Plus Eppendorf Pipetten Reference Eppendorf-Tischzentrifuge 5415 D Fluoreszenzmikroskop Diaplan Leitz Invert-Mikroskop Axiovert 25 Luminometer Sirius-2 Mikroplatten-Reader Elx800 Mikroskop Optiphot 2 Neubauer Zählkammer Pipettierhilfe Eppendorf easypet Reinraumwerkbank Transmissionselektronenmikroskop EM 10CR Ultramikrotom Ultracut E Vakuumpumpe Laboport Videokamera C3 CCD DXC (für Mikroskop Optiphot 2 und Fluoreszenzmikroskop Diaplan Leitz) Videokamera Inteq (für Invert-Mikroskop Axiovert 25) Vortex-Mixer Wärmeschrank Memmert Modell 600 Zentrifuge Varifuge RF Schembera (München) Memmert (Schwabach) Leica Microsystems (Wetzlar) Zeiss (Jena) Berthold Detection Systems (Pforzheim) Bio-Tek Instruments (Winooski/USA) Nikon (Düsseldorf) GLW (Würzburg) BDK Luft- und Reinraumtechnik (Sonnenbühl-Genkingen) Zeiss (Jena) Reichert-Jung (Wien/Österreich) KNF Neuberger (Freiburg) Sony (Köln) Inteq (Berlin) Neolab (Heidelberg) Memmert (Schwabach) Heraeus Sepatech (Osterode) 47
2 3.2 Verbrauchsmaterialien Verbrauchsmaterialien Beemkapsel (Elektronenmikroskopie) Combitips plus (für Eppendorf Multipipette Plus) Glasplättchen ( 12 mm) Kanülen Kodak Electron Microscope Film (4489) Kryoröhrchen Kupfergrids (Elektronenmikroskopie) Membranfilter (steril, 0,45 µm) Messröhrchen ( 12 mm, 75 mm Höhe) Mikrotiterplatten (96er) Pasteurpipetten Pipettenspitzen Reaktionsgefäße Serologische Einwegpipetten Spritzen Sterilfilter (0,2 µm) Zellkulturschalen Zellschaber Zentrifugenröhrchen Plano (Marburg) Lehnecke (Schortens) Kodak (Stuttgart) Bibby Sterilin (Staffordshire/UK) Plano (Marburg) Sarstedt (Nümbrecht) Iwaki (Tokyo/Japan) Th. Geyer Berlin (Berlin) Lehnecke (Schortens) Schleicher & Schuell (Dassel) Iwaki (Tokyo/Japan) Zefa Labortechnik (Harthausen) 3.3 Zellkulturmedien und Zusätze Medien/Mediensupplemente BME-Vitamine (Basal Medium Eagle Vitamin Solution) DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) EGM-2 MV BulletKit (Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2) FBS (Fetales Bovines Serum) Heparin L-Glutamin Penicillin/Streptomycin Becton Dickinson (Bedford/USA) 48
3 3.4 Chemikalien/Reagenzien Chemikalien/Reagenzien Agar Azur II Bacto Gelatine Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat DDSA (2-Dodecenylsuccinic-Acid Anhydride) Di-Natriumtetraborat DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl) Phenol) DMSO (Dimethylsulfoxid) Epon-Glycidether Ethanol Giemsa-Lösung Glutaraldehyd HBSS (HEPES Buffered Saline Solution) Kaliumferrocyanid May-Grünwald-Lösung Methylenblau MNA (Methyl Nadic Anhydride) Osmiumtetroxid Paraformaldehyd PBS (Phosphate Buffered Saline, ohne Ca 2+ - und Mg 2+ -Ionen) Propylenoxid TNS (Trypsin-Neutralizing Solution) Trypsin/EDTA-Lösung Trypsin/EDTA-Lösung (0,025%/0,01%) Ultrostain I, Ultrostain II Difco Laboratories (Detroit/USA) ICN Biomedicals (Eschwege) Fluka Chemie (Buchs/Schweiz) Fluka Chemie (Buchs/Schweiz) Biochrom (Berlin) Leica Microsystems (Wetzlar) 49
4 3.5 Reagenzsysteme/Kits Reagenzsysteme/Kits Luciferase-Assay System Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit SuperFect Transfection Reagent Promega (Mannheim) Perbio Science Deutschland (Bonn) Qiagen (Hilden) 3.6 Immunreagenzien Immunreagenzien Antikörper Kaninchen anti-ziege IgG, FITC-konjugiert Fluorostab Protein Block Serum-Free Polyklonaler Antikörper Ziege anti-kollagen IV Ziegenserum (normal) DAKO Diagnostika (Hamburg) Progen Biotechnik (Heidelberg) DAKO Diagnostika (Hamburg) Chemicon (Hofheim) DAKO Diagnostika (Hamburg) 3.7 Plasmidkonstrukte Vektoren pck5 pjwm115 ppo12 ppo14 ppo18 pps12 pps6 Herkunft Zur Übersicht über die genaue Zusammensetzung der verwendeten Plasmidkonstrukte siehe Kapitel
5 3.8 Zellen Zellen HDMEC MHEC5 S180 Herkunft Endothelzellen aus der Vorhaut von Neugeborenen; Cambrex Bio Science Verviers (Verviers/ Endothelzellen aus dem Herzmuskel von Mäusen; Prof. Dr. J. Plendl, Institut für Veterinär-Anatomie, FU Berlin (Berlin) Murine Fibrosarkomzellen; Prof. R. Auerbach, University of Wisconsin (Madison/USA) 3.9 Software Software Axiovision (Bildverarbeitungssoftware in Verbindung mit Videokamera Inteq ) FB-12 Sirius (Luminometersoftware) KCjunior (Photometersoftware) Lucia M (Bildanalysesystem in Verbindung mit Videokamera C3 CCD DXC) WinFreeze (Anwendungssoftware zur effizienten Verwaltung von kryokonserviertem Untersuchungsmaterial) Zeiss (Jena) Berthold Detection Systems (Pforzheim) Bio-Tek Instruments (Winooski/USA) Nikon (Düsseldorf) Marco Manago, Jasmin Lienau (Rechteinhaber) 3.10 Lösungen, Medien Gebrauchslösung Epon für die Transmissionselektronenmikroskopie: DMP-30 1,48% MNA 24,78% DDSA 28,13% Epon-Glycidether 45,61% Färbelösung nach Richardson für die Transmissionselektronenmikroskopie: Lösung A: 1% Azur II in Aqua dest. Lösung B: 1% Methylenblau in 1% Di-Natriumtetraborat (in Aqua dest.) Gebrauchslösung: 1 Teil Lösung A und 1 Teil Lösung B 51
6 Erhaltungsmedium DMEM + zur Kultivierung muriner Endothel- und Fibrosarkomzellen: L-Glutamin (200 mm) 1% Penicillin/Streptomycin ( U/ml, 10 mg/ml) 1% FBS 10% DMEM (mit 4500 mg Glukose/l, HCl, NaHCO 3, ohne L- 88% Glutamin) Selektivmedium P0 zur Kultivierung muriner Endothelzellen: BME-Vitamine (100x) 1% Heparin (0,25%) 1% ECGS (2,5 mg/ml DMEM) 2% FBS 10% S180-konditioniertes Medium 20% DMEM + 66% Wachstumsmedium EGM-2 MV zur Kultivierung humaner Endothelzellen (nach Herstellerprotokoll): Hydrocortison 0,04% Vitamin C 0,10% Gentamicin/Amphotericin 0,10% VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 0,10% hegf (Human recombinant Epidermal Growth Factor) 0,10% Long R3-IGF-1 (Human recombinant Insulin-like Growth 0,10% Factor) hfgf-b (Human Fibroblast Growth Factor Basic with Heparin) 0,40% FBS 5,00% EBM-2 (Endothelial Cell Basal Medium-2) 94,06% Medium zur Kryokonservierung der Endothelzellen: DMSO 10% Kulturmedium 90% 52
Nach dem Auftauen erfolgte die Kultivierung der Zellen zunächst in mit Gelatine-Lösung (Bacto Gelatine, 1,5% in PBS) beschichteten 6-Lochplatten.
4 Methoden 4.1 Zellkultur 4.1.1 Kultivierung der Endothelzellen Nach dem Auftauen erfolgte die Kultivierung der Zellen zunächst in mit Gelatine-Lösung (Bacto Gelatine, 1,5% in PBS) beschichteten 6-Lochplatten.
12-well Platte 15ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen. Cryo Freezing Container. Elektrophorese- Mikrocomputer Elektrophorese-Kammer
11 2 MATERIAL 2.1. Geräte und Arbeitsutensilien Produkt 12-well Platte 15ml und 50 ml Zentrifugenröhrchen Combitips Cryo Freezing Container Cryoröhrchen Deckgläser 18mm Elektrophorese- Mikrocomputer Elektrophorese-Kammer
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9 Anhang 9.1 Rezepturen der Puffer und Lösungen 9.1.1 Vorbereitung der Proben zur Extraktion Coon s-puffer (0,1 M, ph 7,2-7,6) Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O KH 2 PO 4 Aqua dest. 3,58 g 0,136 g 8,77 g 9.1.2 Aufbereitung
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6.2 Tabellen Kapitel 2
-55- SiO 2 Na 2 O CaO P 2 O 5 Tab. 2.1.1: Zusaensetzung der einzelnen Glaskompositionen in Gewichtsprozent 45s5 45 24.5 24.5 52s 52 21 21 55s 55 19.5 19.5 Iersionsfixation in Formaldehyd nach Lillie, ph
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