RIDASCREEN FAST Vitamin B 12

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1 RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Vitamin B 12 Enzyme immunoassay for the quantitative analysis of vitamin B 12 Art. No.: R2102 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm AG An der neuen Bergstraße 17 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme: ( ) Telefax / Auftragsannahme: ( ) [email protected] Marketing / Vertrieb: ( ) [email protected] RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert. RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm AG Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany R-Biopharm AG is ISO 9001 certified. 2 RIDASCREEN FAST Vitamin B

3 Kurzinformation RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 -Test ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Vitamin B 12 in vitaminisierten Lebensmitteln, Futtermitteln und Vitaminprodukten. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards - sind im Testkit enthalten. Ein Testkit ist ausreichend für 48 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen). Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Milch: zentrifugieren und verdünnen Säfte: verdünnen, filtrieren oder zentrifugieren andere Matrices: homogenisieren, extrahieren, filtrieren oder zentrifugieren und verdünnen Probenvorbereitung (10 Proben)...ca min Testdurchführung (Inkubationszeit) min Rohmilch... ca. 0,5 ppb Past. Frischmilch...ca. 2,5 ppb Milchmixgetränke... ca. 2,5 ppb Milchpulver...ca. 10,0 ppb Getreide, Getreidemehle, Müsli... ca. 25,0 ppb Vitaminpulver, -premixes, -tabletten, -kapseln und -bonbons... ca. 25,0 ppb Vitaminsäfte... ca. 2,5 ppb Spezifität: Die Spezifität des RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 - Tests wurde durch Bestimmung der Kreuzreaktivität zu entsprechenden Vitaminen ermittelt. Vitamin B % Vitamin B 12a (Hydroxycobalamin)...ca. 80 % RIDASCREEN FAST Vitamin B

4 1. Verwendungszweck RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Vitamin B 12 in vitamisierten Lebensmitteln, Futtermitteln und Vitaminprodukten. 2. Allgemeines Vitamin B 12 gehört zu den essentiellen Coenzymen im Vertebraten-Stoffwechsel. Die bedeutendsten Funktionen von Vitamin B 12 liegen in der Blutbildung, dem Fettsäure-Metabolismus sowie der Bereitstellung von Folsäure. Folsäure spielt wiederum eine wichtige Rolle in der Nukleotidbiosynthese und dem Aminosäurestoffwechsel. Vitamin B 12 -Mangel kann deshalb zu schweren Folgeerscheinungen wie perniziöser Anämie und neurologischen Symptomen führen. 3. Testprinzip Die Vertiefungen der Mikrotiter-Streifen sind mit spezifischen Antikörpern gegen Vitamin B 12 beschichtet. Zugegeben werden die Vitamin B 12 -Standardlösungen bzw. die Probelösungen und enzymmarkiertes Vitamin B 12 (Enzymkonjugat). Freies und enzymmarkiertes Vitamin B 12 konkurrieren um die Vitamin B 12 -Antikörperbindungsstellen (kompetitiver Enzymimmunoassay). Nicht gebundenes enzymmarkiertes Vitamin B 12 wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/Chromogenlösung. Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Vitamin B 12 -Konzentration in der Probe. 4. Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung können 48 Bestimmungen durchgeführt werden (einschließlich Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält: 1 x Mikrotiterplatte mit 48 Kavitäten (6 Streifen à 8 Einzelkavitäten) beschichtet mit Antikörpern gegen Vitamin B 12 6 x Standardkonzentrate (je 1,3 ml) 0 ppb (Nullstandard), 5 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb Vitamin B 12 in wässriger Lösung 4 RIDASCREEN FAST Vitamin B

5 1 x Konjugat (0,7 ml)...roter Verschluss Peroxidase-konjugiertes Vitamin B 12 Konzentrat 1 x Substrat-/Chromogenlösung (10 ml)...brauner Verschluss rötlich gefärbt, enthält Harnstoffperoxid 1 x Stopp-Reagenz (14 ml)... gelber Verschluss enthält 1 N Schwefelsäure 1 x Puffersalz (Waschpuffer) zur Herstellung eines 10 mm Phosphatpuffers (ph 7,4) enhält 0,05 % Tween 20 1 x Puffer 1 (50 ml) Standard,- Konjugat- und Probenverdünnungspuffer 1 x Puffer 2 (10 ml) Standardverdünnungspuffer für Milchproben 5. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 5.1. Geräte: Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Schlagmühle Zentrifuge und zentrifugierbare Reagenzgläser Schüttler Wasserbad (100 C) Papierfaltenfilter und Trichter Messpipetten variable 20 µl µl und µl Mikropipetten 5.2. Reagenzien: Ascorbat Oxidase-Spatel, "Ascorbase-Spatel" (Roche Diagnostics, Art. Nr ) für Proben mit hohem Vitamin C-Gehalt (> 10 µg/g) PBS-Puffer, ph 6,0: 0,55 g NaH 2 PO 4 x H 2 O + 2,85 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O + 9 g NaCl ad 1000 ml dest. Wasser, mit 5 N HCl ph 6,0 einstellen (der Puffer hat eine Haltbarkeit von ca. 4-6 Wochen bei 2-8 C) Probenverdünnungspuffer, PBS-Tween-Puffer, ph 7,2: 0,55 g NaH 2 PO 4 x H 2 O + 2,85 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O + 9 g NaCl + 1 ml Tween 20 ad 1000 ml dest. Wasser (der Puffer hat eine Haltbarkeit von ca. 4-6 Wochen bei 2-8 C) Magermilchpulver (Lebensmittelqualität) RIDASCREEN FAST Vitamin B

6 6. Vorsichtsmaßnahmen Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26). 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall einfrieren. Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht zulässig. 8. Anzeichen für Reagenzienverfall bläuliche Färbung der rötlich gefärbten Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten Extinktion kleiner 0,6 (E 450 nm < 0,6) für den Nullstandard 9. Probenvorbereitung Die Proben kühl und lichtgeschützt lagern Milch, Milchpulver und Milchmixgetränke Rohmilch: zur Entfettung zentrifugieren: 3500 g / 10 min / 10 C die obere Fettschicht mittels einer Pasteurpipette über Vakuum absaugen 50 µl der entfetteten Rohmilch pro Kavität im Test einsetzen!!! Standards in Magermilchpulver (siehe 5.2./10.1.) ansetzen!!! 6 RIDASCREEN FAST Vitamin B

7 pasteurisierte Frischmilch: 10 ml Milchprobe zur Entfettung zentrifugieren: 3500 g / 10 min / 10 C die obere Fettschicht mittels einer Pasteurpipette über Vakuum absaugen die entfettete Milch mit Probenverdünnungspuffer 1:5 (1+4) verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen!!! Standards in Standardverdünnungspuffer für Milchproben ansetzen!!! Milchpulver: 10 g Milchpulver in ca. 50 ml dest. Wasser lösen, mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen und 10 min schütteln / rühren 10 ml Probe erhitzen: 3 min / 100 C Probe auf Raumtemperatur (20-25 C) unter Eis abkühlen, dabei mischen zur Entfettung zentrifugieren: 3500 g / 10 min / 10 C die obere Fettschicht mittels einer Pasteurpipette über Vakuum absaugen die entfettete Milch mit Probenverdünnungspuffer mind. 1:2 (1+1) verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen!!! Standards in Standardverdünnungspuffer für Milchproben ansetzen!!! Anmerkung: Zur Qualitätskontrolle wird empfohlen Kontrollproben (z.b. eine nicht vitaminisierte Milchpulverprobe) mitzuführen, um eventuell falsch positive Ergebnisse bei Milchpulver-Proben zu erkennen. Milchmixgetränke (Buttermilch, Milchcocktails): 10 ml Probe zur Entfettung zentrifugieren: 3500 g / 10 min / 10 C die obere Fettschicht mittels einer Pasteurpipette über Vakuum absaugen die entfettete Probe mit Probenverdünnungspuffer 1:5 (1+4) verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen!!! Standards in Standardverdünnungspuffer für Milchproben ansetzen!!! Zur Erhöhung der Sensitivität können entfettete Proben auch unverdünnt eingesetzt werden, die Standards in diesem Fall in Magermilchpulver (siehe 5.2./10.1.) ansetzen!!! RIDASCREEN FAST Vitamin B

8 9.2. Getreide, Getreidemehle und Müsli Eine repräsentative Probe vor dem Extrahieren zerkleinern und mischen. 10 g der gemahlenen Probe in ein verschraubbares Reagenzglas einwiegen, in ca. 50 ml dest. Wasser lösen, mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen bis zum vollständigen Lösen der Probe schütteln (manuell oder mittels Schüttler) Probe erhitzen: 3 min / 100 C Probe auf Raumtemperatur (20-25 C) unter Eis abkühlen, dabei mischen zentrifugieren: 4000 g / 10 min / 15 C Überstand abnehmen, falls der Überstand noch trüb sein sollte, über einen Papierfilter filtrieren den Überstand 1:5 (1+4) mit Probenverdünnungspuffer verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 9.3. Vitaminpulver, -premixes, -tabletten, -kapseln und -bonbons 1 g Vitaminpulver /-premix in 10 ml dest. Wasser lösen Tabletten zermörsern und 1g in 10 ml dest. Wasser lösen Kapseln: 1 Kapsel wenn möglich aufschneiden und 10 ml dest. Wasser hinzugeben Bonbons: 1 Bonbon in 10 ml dest. Wasser lösen Mit allen Proben wie folgt weiterarbeiten: jeweilige Probelösung erhitzen: 3 min / 100 C (dabei löst sich die Probe vollständig) Probe auf Raumtemperatur (20-25 C) unter Eis abkühlen, dabei mischen zentrifugieren: 4000 g / 10 min / 15 C Überstand abnehmen, falls noch Schwebteilchen vorhanden sind, Überstand über einen Papierfilter filtrieren, den Überstand 1:5 (1+4) mit Probenverdünnungspuffer verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen bei hohem Vitamin C-Gehalt (> 10 µg/g oder 10 µg/ml) ist es sinnvoll eine Inkubation mit Ascorbasespatel (siehe 5.2.) vorzunehmen; die Proben müssen statt in dest. Wasser in PBS-Puffer, ph 6,0 (siehe 5.2.) gelöst werden nach dem Erhitzen und Zentrifugieren dem Überstand einen Ascorbasespatel zugeben, 15 min bei Raumtemperatur (20-25 C) unter gelegentlichem Schütteln inkubieren den Ascorbasespatel entfernen und den Überstand 1:5 (1+4) mit Probenverdünnungspuffer verdünnen 50 µl pro Kavität im Test einsetzen 8 RIDASCREEN FAST Vitamin B

9 9.4. Vitaminsäfte 1 ml Saft mit 4 ml Probenverdünnungspuffer verdünnen Probe durch einen Papierfilter filtrieren oder zentrifugieren evtl. Inkubation mit Ascorbasespatel (siehe 9.3.) 50 µl Filtrat oder Überstand pro Kavität im Test einsetzen Anmerkung: Werden Vitamin B 12 -Konzentrationen von über 800 ng/g in Pulver, Kapseln, Tabletten oder in Saft erwartet, so sollte die fertige Probelösung mit Probenverdünnungspuffer entsprechend weiter verdünnt werden. Prinzipiell für die Probenaufarbeitungen (9.2. und 9.3.): Als Alternative zur Wasserextraktion empfehlen wir für den Fall von zu niedrigen Wiederfindungsraten den Einsatz von 50 % Methanol (50 ml Methanol (100 %) mit 50 ml dest. Wasser mischen). Die Methanolextrakte werden filtriert oder zentrifugiert und können in der jeweiligen Verdünnung im Test eingesetzt werden. 10. Testdurchführung Testvorbereitungen Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. Das Vitamin B 12 -Enzymkonjugat (Flasche mit rotem Verschluss) liegt als Konzentrat vor. Da die rekonstituierte Konjugatlösung nur begrenzte Haltbarkeit aufweist, immer nur soviel Konjugat-Konzentrat mit Puffer verdünnen, wie unmittelbar benötigt wird. Das Konjugat-Konzentrat vor Entnahme vorsichtig mischen. Um die gebrauchsfertige Konjugatlösung herzustellen, muss das Konzentrat 1:11 (1+10) mit Puffer 1 verdünnt werden (z. B. 200 µl Konzentrat + 2,0 ml Puffer 1, ausreichend für 4 Mikrotiterstreifen). Die Standards liegen als Konzentrat vor. Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Vitamin B 12 -Standards müssen die Standardkonzentrate 1:10 (1+9) mit Puffer 1 verdünnt werden, d.h. je 50 µl Standardkonzentrat mit 450 µl Puffer 1 verdünnen und gut mischen. Bei Milchuntersuchungen Puffer 2 verwenden. RIDASCREEN FAST Vitamin B

10 Für die Probenvorbereitung (9.1.) Herstellung der Standards in Magermilchpulver: Falls nicht anders auf der Packung angegeben, 1 g Magermilchpulver in 10 ml dest. Wasser lösen und mit dieser Lösung (= Puffer) die Standardkonzentrate, wie nachfolgend aufgeführt, verdünnen. Standard 1: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 0 ppb Standard 2: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 0,5 ppb Standard 3: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 1 ppb Standard 4: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 3 ppb Standard 5: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 10 ppb Standard 6: 50 µl Standardkonzentrat µl Puffer 30 ppb Als Waschpuffer wird ein PBS-Tween-Puffer benötigt, benutzen Sie dazu bitte das beiliegende Puffersalz (siehe 4.). Zur Herstellung des Puffers wird der gesamte Inhalt des Beutels in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Der gelöste Waschpuffer ist ca. 4-6 Wochen bei 2-8 C haltbar. Alternativ: Inhalt des Beutels in 100 ml dest. Wasser lösen (10fach Konzentrat). Die Lösung ist ca Wochen bei Raumtemperatur (20-25 C) haltbar. Um die gebrauchsfertige Lösung herzustellen 1 Teil des 10fach Konzentrats mit 9 Teilen dest. Wasser mischen Testdurchführung 1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren. 2. Je 50 µl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren; für jeden Standard oder Probe neue Pipettenspitzen benutzen. 3. Je 50 µl verdünnte Enzymkonjugat-Lösung (roter Verschluss) in die entsprechenden Kavitäten pipettieren, vorsichtig manuell mischen und 15 min (+/-1) bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 4. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit Hilfe einer Multikanal-Pipette mit Waschpuffer (siehe 10.1.) waschen (250 µl pro Kavität), die Kavitäten leeren und die Restflüssigkeit entfernen. Diesen Waschvorgang noch zweimal wiederholen. 10 RIDASCREEN FAST Vitamin B

11 µl Substrat-/Chromogenlösung (brauner Verschluss) in jede Kavität pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 10 min (+/- 0,5) bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren µl Stopp-Reagenz (gelber Verschluss) in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 10 min nach Zugabe des Stopp-Reagenzes messen. 11. Auswertung Für die Auswertung ist bei R-Biopharm eine speziell für die RIDASCREEN Enzymimmunoassays entwickelte Software, die RIDA SOFT Win (Art. Nr. Z9999), erhältlich. Der Verlauf der Standardkurve kann dem beigefügten Analysenzertifikat entnommen werden. Hinweis für die Berechnung ohne Software: Extinktion Standard (bzw. Probe) Extinktion Nullstandard x 100 = % Extinktion Den Nullstandard somit gleich 100 % setzen und die Extinktionswerte in Prozent angeben. Die errechneten Werte für die Standards in einem Koordinatensystem auf halblogarithmischem Millimeterpapier gegen die Vitamin B 12 -Konzentration [µg/kg] bzw. [µg/l] auftragen. Um die in den Proben enthaltene tatsächliche Vitamin B 12 -Konzentration in µg/l oder µg/kg (ppb) zu erhalten, muss die aus der Eichkurve abgelesene Konzentration noch mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Beim Arbeiten nach den angegebenen Vorschriften gelten die in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Verdünnungsfaktoren. Im Falle von Vitaminkapseln und -bonbons bezieht sich die Berechnung auf den gesamten Kapselinhalt und hängt somit vom individuellen Volumen einer jeden Kapsel bzw. jedes Bonbons ab. RIDASCREEN FAST Vitamin B

12 Tabelle 1: Aufbereitungsmethode Probenart Verdünnungsfaktoren Nachweisgrenzen (ca.) 9.1. Rohmilch Past. Milch Milchmixgetränke Milchpulver ,5 ppb 2,5 ppb 2,5 ppb 10 ppb 9.2. Getreide Getreidemehle Müsli ppb 9.3. Vitaminpulver, -premixes, -tabletten, -kapseln und bonbons ppb 9.4. Vitaminsaft 5 2,5 ppb Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht. 12 RIDASCREEN FAST Vitamin B

13 RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 Brief information RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of vitamin B 12 in fortified food, feed and vitamin products. All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 48 determinations (including standards). A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification. Sample preparation: Time requirement: Detection limit: milk: centrifugation and dilution juices: dilution, filtration or centrifugation other matrices: homogenization, extraction, filtration or centrifugation and dilution sample preparation (10 samples)...approx min test implementation (incubation time)...25 min raw milk...approx. 0.5 ppb pasteurized milk...approx. 2.5 ppb milk mix drinks...approx. 2.5 ppb milk powder...approx ppb grain, flour, cereals...approx ppb vitamin powder, -premixes, -tablets, -capsules and -candies...approx ppb vitamin juice...approx. 2.5 ppb Specificity: The specificity of the RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 test was determined by analysing the cross reactions to corresponding vitamins. Vitamin B % Vitamin B 12a (Hydroxycobalamin)... approx. 80 % RIDASCREEN FAST Vitamin B

14 1. Intended use RIDASCREEN FAST Vitamin B 12 is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of vitamin B 12 in fortified food, feed and vitamin products. 2. General Vitamin B 12 is one of the essential coenzymes in the vertebrate metabolism. The most important functions of vitamin B 12 are blood cell synthesis, fatty acid metabolism and the availability of folic acid. Folic acid itself plays a considerable role in the biosynthesis of nucleotides as well as in the turnover of amino acids. A deficiency of vitamin B 12 may cause serious disorders such as pernicious anemia or neurological symptoms. 3. Test principle The microtiter wells are coated with specific antibodies against vitamin B 12. Vitamin B 12 standards, sample solution and enzyme labeled vitamin B 12 (enzyme conjugate) are added. Free and enzyme labeled vitamin B 12 compete for the antibody binding sites (competitive enzyme immunoassay). Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step. Substrate/chromogen is added to the wells, bound enzyme conjugate converts the chromogen into a blue product. The addition of the stop solution leads to a color change from blue to yellow. The measurement is made photometrically at 450 nm; the resulting absorbance values are inversely proportional to the vitamin B 12 concentration of the sample. 4. Reagents provided Each kit contains sufficient materials for 48 measurements (including standards). Each test kit contains: 1 x Microtiter plate with 48 wells (6 strips with 8 removable wells each) coated with antibodies against vitamin B 12 6 x Standard concentrates (1.3 ml each) 0 ppb (zero standard), 5 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb vitamin B 12 in aqueous solution 1 x Conjugate (0.7 ml)...red cap peroxidase conjugated vitamin B 12 concentrate 1 x Substrate/chromogen solution (10 ml)... brown cap stained red, contains urea peroxide 14 RIDASCREEN FAST Vitamin B

15 1 x Stop solution (14 ml)...yellow cap contains 1 N sulfuric acid 1 x Buffer salt (washing buffer) for preparation of a 10 mm phosphate buffer (ph 7.4) contains 0.05 % Tween 20 1 x Buffer 1 (50 ml) standard, conjugate and sample dilution buffer 1 x Buffer 2 (10 ml) standard dilution buffer for milk samples 5. Materials required but not provided 5.1. Equipment: microtiter plate spectrophotometer (450 nm) laboratory mincer centrifuge and centrifugal tubes shaker waterbath (100 C / 212 F) paper filter and filter funnel graduated pipettes variable µl and µl micropipettes 5.2. Reagents: Ascorbate Oxidase sticks, (Roche Diagnostics, Art. Nr ) for samples with high vitamin C concentration (> 10 µg/g) PBS buffer, ph 6.0: 0.55 g NaH 2 PO 4 x H 2 O g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O + 9 g NaCl fill up to 1000 ml with distilled water and adjust ph with 5 N HCl to ph 6.0 (the buffer is stable at 2-8 C (36-46 F) for approx. 4-6 weeks) Sample dilution buffer, PBS-Tween-buffer, ph 7.2: 0.55 g NaH 2 PO 4 x H 2 O g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O + 9 g NaCl + 1 ml Tween 20, fill up to 1000 ml distilled water (the buffer is stable at 2-8 C (36-46 F) for approx. 4-6 weeks) Skimmed milk powder (food quality) RIDASCREEN FAST Vitamin B

16 6. Warnings and precautions for the users The stop solution contains 1 N sulfuric acid (R36/38, S2-26). 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C (35-46 F). Do not freeze any test kit components. Return any unused microwells to their original foil bag, reseal them together with the desiccant provided and further store at 2-8 C (35-46 F). The substrate/chromogen solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. No quality guarantee is accepted after expiry of the kit (see kit label). Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 8. Indication of instability or deterioration of reagents any bluish coloration of the reddish substrate/chromogen solution prior to test implementation a value of less than 0.6 absorbance units (A 450 nm < 0.6) for the zero standard 9. Preparation of Samples The samples should be stored in a cool place, protected against light milk, milk powder and milk mix drinks raw milk: for degreasing centrifuge the sample: 3500 g / 10 min / 10 C (50 F) remove upper cream layer by aspirating through a pasteur pipette under vacuum stream employ 50 µl of the defatted milk per well in the assay!!! use the standards in skimmed milk powder (see 5.2./10.1.)!!! 16 RIDASCREEN FAST Vitamin B

17 pasteurized milk: for degreasing centrifuge 10 ml of the milk sample: 3500 g / 10 min / 10 C (50 F) remove upper cream layer by aspirating through a pasteur pipette under vacuum stream dilute the defatted milk sample 1:5 (1+4) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the assay!!! use standards in standard dilution buffer for milk samples!!! milk powder: dissolve 10 g of milk powder in approx. 50 ml distilled water, fill up to 100 ml with distilled water and shake for 10 min heat 10 ml of the milk sample: 3 min / 100 C (212 F) chill down the sample with ice to room temperature (20-25 C / F) while shaking for degreasing, centrifuge the sample at 3500 g / 10 min / 10 C (50 F) remove upper cream layer by aspirating through a pasteur pipette under vacuum stream dilute the defatted milk sample at least 1:2 (1+1) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the assay!!! use standards in standard dilution buffer for milk samples!!! remark: For quality control it is recommended to analyze also a control sample (e.g. a non vitaminised milk powder sample) in order to identify false positive results for milk powder samples. milk mix drinks (butter milk, milk cocktails): for degreasing centrifuge 10 ml of the sample: 3500 g / 10 min / 10 C (50 F) remove upper cream layer by aspirating through a pasteur pipette under vacuum stream dilute the defatted milk sample 1:5 (1+4) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the assay!!! use standards in standard dilution buffer for milk samples!!! To increase sensitivity, samples can be employed undiluted after degreasing. For this purpose, please use standards made up in skimmed milk powder (see 5.2./10.1.)!!! RIDASCREEN FAST Vitamin B

18 9.2. grain, flour and cereals A representative sample should be ground and thoroughly mixed before proceeding with the extraction procedure. weigh 10 g of ground sample and add it to a suitable container, dissolve with approx. 50 ml distilled water and fill up to 100 ml with distilled water shake until complete dissolution of the sample (manually or with shaker) heat the sample: 3 min / 100 C (212 F) chill down the sample with ice to room temperature (20-25 C / F) while shaking centrifuge: 4000 g / 10 min / 15 C (59 F) remove supernatant, if supernatant is still turbid, filter through paper filter dilute the supernatant 1:5 (1+4) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the test 9.3. vitamin powder, premixes, tablets, capsules and candies dissolve 1 g of vitamin powder /-premix in 10 ml distilled water crush the tablets and dissolve 1 g in 10 ml distilled water capsules: if possible cut open 1 capsule and add 10 ml of distilled water candies: put 1 candy into 10 ml distilled water Continue with all samples as it is described in the following: heat the sample solution: 3 min / 100 C (212 F) - during this step the sample is dissolving completely chill down the sample with ice to room temperature (20-25 C / F) while shaking centrifuge: 4000 g / 10 min / 15 C (59 F) remove supernatant, if supernatant is still turbid, filter through paper filter dilute supernatant 1:5 (1+4) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the test for high Vitamin C content of the sample (> 10 µg/g or 10 µg/ml) an incubation with ascorbate sticks (see 5.2.) is indicated; the samples should be dissolved in PBS buffer, ph 6.0 (see 5.2.) instead of distilled water after heating and centrifugation, add an ascorbate stick to the supernatant and incubate for 15 min at room temperature (20-25 C / F) while shaking sometimes remove the ascorbate stick and dilute the solution 1:5 (1+4) with sample dilution buffer employ 50 µl per well in the assay 18 RIDASCREEN FAST Vitamin B

19 9.4. vitamin juices dilute 1 ml juice with 4 ml sample dilution buffer filter the sample through a paper filter or centrifuge the sample possibly incubation with ascorbate sticks (see 9.3.) employ 50 µl of the filtrate or the supernatant per well in the assay remark: If vitamin B 12 concentrations of more than 800 ng/g in powder, capsules, tablets or in juice are expected, the sample solution has to be diluted further on with sample dilution buffer. In principle for the sample preparations (9.2. and 9.3): If poor recovery rates are obtained, we recommend the use of 50 % methanol (50 ml methanol (100 %) mixed with 50 ml distilled water) instead of distilled water for sample extraction. The methanolic extracts have to be filtered or centrifuged. These filtered extracts are diluted according to the individual instructions and are then employed in the assay. 10. Test implementation Test preparation Bring all reagents to room temperature (20-25 C / F) before use. The vitamin B 12 enzyme conjugate (bottle with red cap) is provided as a concentrate. Since the diluted enzyme conjugate solution has a limited stability, only the amount which actually is needed should be reconstituted. Before pipetting, the conjugate concentrate should be shaken carefully. For reconstitution, the conjugate concentrate is diluted 1:11 (1+10) in buffer 1 (e. g. 200 µl concentrate ml buffer 1, sufficient for 4 microtiter strips). The standards are provided as concentrates. The ready to use solution of the standards is a 1:10 (1+9) dilution of the concentrates with buffer 1, so dilute 50 µl of the vitamin B 12 standard concentrate with 450 µl buffer 1 and mix briefly. For milk samples use buffer 2. RIDASCREEN FAST Vitamin B

20 For sample preparation (9.1.) Preparation of the standards in skimmed milk powder: If not indicated differently on the pack, use 1 g of milk powder and dissolve it in 10 ml of distilled water. Use this solution (= buffer) for dilution of the standard concentrates. standard 1: 50 µl standard concentrate µl buffer 0 ppb standard 2: 50 µl standard concentrate µl buffer 0.5 ppb standard 3: 50 µl standard concentrate µl buffer 1 ppb standard 4: 50 µl standard concentrate µl buffer 3 ppb standard 5: 50 µl standard concentrate µl buffer 10 ppb standard 6: 50 µl standard concentrate µl buffer 30 ppb As washing buffer a PBS tween buffer is needed. Please use the buffer salt contained in the kit (see 4.). Dissolve the entire buffer salt in one liter of distilled water. The ready to use washing buffer expires after approx. 4-6 weeks at at 2-8 C (36-46 F). Alternative: Dissolve the contents of the envelope in 100 ml of distilled water to obtain a 10fold concentrated washing buffer. This solution expires after approx weeks, store at room temperature (20-25 C / F). Use 1 part of this concentrate and dissolve with 9 parts of distilled water to obtain the ready to use washing buffer Test procedure 1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run. Record standard and sample positions. 2. Add 50 µl of each standard solution or prepared sample to separate wells; use a new pipette tip for each standard or sample. 3. Add 50 µl of diluted enzyme conjugate solution (red cap) to each well. Mix gently by shaking the plate manually and incubate 15 min (+/-1) at room temperature (20-25 C / F). 4. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Using a multichannel pipette, fill the wells with washing buffer (see 10.1.), 250 µl per well. Empty the wells again and remove all remaining liquid. Repeat the washing step two more times. 5. Add 100 µl of the substrate/chromogen solution (brown cap) to each well. Mix gently by shaking the plate manually and incubate for 10 min (+/- 0.5) at room temperature (20-25 C / F) in the dark. 20 RIDASCREEN FAST Vitamin B

21 6. Add 100 µl of stop solution (yellow cap) to each well. Mix gently by shaking the plate manually and measure the absorbance at 450 nm. Read within 10 minutes after addition of stop solution. 11. Results A special software, the RIDA SOFT Win (Art. No. Z9999), is available to evaluate the RIDASCREEN enzyme immunoassays. The course of the standard curve is shown in the Quality Assurance Certificate enclosed in the test kit. Remark for the calculation without software: absorbance standard (or sample) absorbance zero standard x 100 = % absorbance The zero standard is thus made equal to 100 % and the absorbance values are quoted in percentages. The values calculated for the standards are entered in a system of coordinates on semilogarithmic graph paper against the vitamin B 12 concentration [µg/kg] or [µg/l]. In order to obtain the vitamin B 12 concentration in µg/l or µg/kg (ppb) actually contained in a sample, the concentration read from the calibration curve must be further multiplied by the corresponding dilution factor. When working in accordance with the regulation stated, the dilution factors can be read out of the following Table 1. In the case of vitamin capsules and candies the calculation regards the entire contents and thus depends on the individual volume of a capsule or a candy. RIDASCREEN FAST Vitamin B

22 Table 1: preparation method sample dilution factor detection limit (approx.) 9.1. raw milk past. milk milk mix drinks milk powder ppb 2.5 ppb 2.5 ppb 10 ppb 9.2. grain, flour, cereals ppb 9.3. vitamin powder, -premixes, -tablets, -capsules and -candies ppb 9.4. vitamin juice ppb R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. 22 RIDASCREEN FAST Vitamin B