Immunfluoreszenzmuster nicht organspezifischer Autoantikörper

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Alfred Huber
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1 Immunfluoreszenzmuster nicht organspezifischer Autoantikörper - Versuch einer Klassifikation - Karsten Conrad Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus

2 Problemstellung Färbemuster an Hep-2- Zellen AAk-Spezifität Diagnose

3 Vorteile des Screenings auf nospaak mittels IIF an HEp-2-Zellen Hochsensitives Screening auf ca. 30 klinisch relevante AAK-Spezifitäten ACA, Aktin, AMA-M2, dsdna, Fibrillarin, gp210, Histon, Jo1, Ku, La, LBR, Mi-2, Nukleosom, PCNA, PMscl, PL7, PL12, Proteasom, Rib-P, RNAP, Ro52, Ro60, Scl- 70, Sm, Sp100, SRP, Th/To, U1-RNP,... Einfacher und kosteneffektiver multiparametrischer Assay

4 Vorteile des Screenings auf nospaak mittels IIF an HEp-2-Zellen Hochsensitives Screening auf ca. 30 klinisch relevante AAK-Spezifitäten Spezifischer Nachweis von an ihrem Bindungsmuster erkennbaren AAK ACA, AMA, PCNA, Sp100, CENP-F Kosteneffektiver Einsatz nachfolgender Untersuchungen je nach Immunfluoreszenzmuster und diagnostischer Fragestellung

5 Vorteile des Screenings auf nospaak mittels IIF an HEp-2-Zellen Möglichkeit des Nachweises seltener, aber diagnostisch relevanter AAK, für welche keine kommerziellen Assays zur Verfügung stehen Th/To seltene Anti-tRNA-Synthetase-Ak PCNA Möglichkeit des Nachweises von seltenen AAK unbekannter Feinspezifität, aber potenzieller klinischer Relevanz

6 Vorteile des Screenings auf nospaak mittels IIF an HEp-2-Zellen Erhöhung der diagnostischen Sicherheit: Hinweis auf potentiell falsch positive Ergebnisse in den spezifischen Assays ANA negativ <> dsdna-ak pos. <> Sm-Ak. pos.

7 Ideale Screeningmöglichkeit auf nospaak PROBLEME: Subjektive Befundung Fehlende Standarisierung Fehlende Automatisierung

8 IIF an Hep-2-Zellen nukleär (ANA) zytoplasmatisch negativ?? Spezifische Immunoassays dsdna Nukleosom U1-RNP/Sm PM/Scl Ku Mi-2 Jo-1 Rib-P AMA?? Auschluss -eines bestimmtem AAK -einer bestimmten Erkrankung

9 Probleme/Fragen Welche AAk (>Erkrankungen) können bei einem neg. IIF-Befund ausgeschlossen werden? Wie zuverlässig sind Assoziationen zwischen IIF-Muster und AAK-Spezifität?

10 ANA-Titer / ENA-Ak Literatur Je höher der Titer, desto mehr ENA/dsDNA-Ak Assoziation homogenes Muster mit dsdna-ak (CLIFT, ELISA) Keine sign. Assoziation zwischen Grundmuster und Mehrzahl der ENA-AK I. KANG et al., Clin Rheumatol. 2004; 23: I. Peene et al.: Ann Rheum Dis 2001; 60:

11 Routinediagnostik Institut für Immunologie der TU Dresden

12 ANA < 1:160 und Metaphasechromatin negativ > Keine weitere Untersuchung erforderlich AUSNAHMEN: gran. zytoplasmatisches Muster > Jo-1 Pat. mit Myositis > Jo-1, Myositis-LIA Pat. mit V. a. SLE oder Sjögren > Ro-Ak

13 Metaphasechromatin positiv > immer dsdna-ak (auch bei niedrigen IIF-Titern) > wenn dsdna-ak negativ > Nukleosom-Ak

14 HEp-2-Zellmonolayer INTERPHASE Nukleoli Zellkern Zytoplasma METAPHASE Mixoplasma Chromatin

15 HEp-2: AAK binden zelluläre Organellen und Strukturen Kernmembran Kernmatrix Kernkörperchen Mitosespindel Ribosomen Golgiapparat

16 nukleär zytoplasmatisch Zellzyklus assoziiert Homogen Granulär Feingranulär Peripher Nukleolär Nukleäre Dots Homogen Granulär Mitochondrien Golgi Dots Zytoskelett Metaphasechromatin Spindelapparat pleomorph

17 AAk-Stufendiagnostik bei Kollagenosen I. Screening auf nichtorganspezifische AAk Fluoreszenz Zytoplasma positiv homogen feingran. pleomorph Nukleoli Zellkerne positiv (= ANA) feingranulär homogen grobgranulär II. Bestimmung der AAk-Spezifitäten u.a. Jo-1 ribosomale Phosphoproteine u.a. Scl70 RNAP-I PM-Scl PCNA dsdna Nukleosom Histon Sm U1-RNP Ro/SS-A La/SS-B

18 Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen Fluoreszenz HEp-2-Zellen Zellkerne positiv (= ANA) Homogen + Metachromatin AAk-Spezifitätsbestimmung dsdna

19 ANA homogen PROMETAPHASE METAPHASE Chromatin positiv TELOPHASE INTERPHASE homogene Kernfärbung

20 Färbung in METAPHASE

21 Färbung in später ANAPHASE und TELOPHASE

22 Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen Fluoreszenz AAk-Spezifitätsbestimmung Zellkerne positiv (= ANA) Nukleosomen Histone (andere chromatinassoz. Proteine) HEp-2-Zellen Homogen/gran. + Metachromatin

23 05_4005 anukleosom

24 05_4005 anukleosom

25 08_3100 anukleosom

26 08_3171 ahiston

27 08_4557 Histon + dsdna-ak

28 Klassifikation von HEp-2-Mustern I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

29 dsdna Histon/Nukleosom > A1-III/B1-III > A1-IV/B1-IV I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

30 Indirekte Immunfluoreszenz an Hep-2-Zellen Fluoreszenz Zellkerne positiv (= ANA) granulär AAk-Spezifitätsbestimmung HEp-2-Zellen Sm U1-RNP (andere spliceosomale Proteine)

31 ANA granulär INTERPHASE Nukleoplasma granulär Nukleoli negativ METAPHASE Chromatin negativ Mixoplasma granulär

32 Sm/U1-RNP-Ak > A1-V/A2-I/B1-I I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

33 NuMA INTERPHASE Nukleoplasma granulär Nukleoli negativ METAPHASE Mitot. Spindel pos

34 NuMA-Ak > A1-V/A2-I/B1-I/B3-II I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

35 ANA dots > 30 METAPHASEN INTERPHASEN

36 ACA > A1-VIII/B1-VIII I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

37 Centromerprotein-F-Antikörper Fluoreszenz der Centromeren nur in METAPHASEN variable Färbungen in den INTERPHASEN

38 CENP-F > A4-II/B1-VIII I II III IV V VI VII VIII ausgespart positiv hom fgr ggr fleckig Dots Dots <30 >30 A A1 NUKLEOPLASMA Zellkern A2 NUKLEOLI A3 A4 KERNMEMBRAN PLEOMORPH B B1 META-CHROMATIN Mitosen B2 TRENNZONE B3 B4 SPINDEL ZENTRIOL C C1 ZYTOPLASMA Zytoplasma C2 ZYTOSKELETT C3 C4 MITOCHONDRIEN GOLGI

39 Antinukleoläre Antikörper: granuläre Fluoreszenz Nukleoli granulär / punktiert Nukleoplasma negativ

40 Antinukleoläre Antikörper: homogene Fluoreszenz Nukleoplasma schwach granulär Metaphasechromatin teilw.pos. Nukleoli homogen

41 Anti-Topoisomerase-Antikörper (Scl-70) Nukleoplasma granulär Nukleoli prominent Metaphasechromatin teilw.pos.

42 SP-100-Antikörper + AMA 8 multiple nukleäre Dots >10 7

43 zytoplasmatische Granula trna-synthetase-antikörper

44 Mitotische Spindel

45 Centrosom/Centriol-Antikörper Centriol METAPHASE INTERPHASEN Centrosom Procentriol

46 Midbody-Antikörper INTERPHASE variable granuläre Färbung Färbung der Zellzeilungsfurche ( Midbody ) TELOPHASE METAPHASE Färbung des Chromatins

47 Das vorgeschlagene Klassifikationsschema ist geeignet, die klinisch relevanten AAK- Spezifitäten an Hand von 1-4 Kriterien zu charakterisieren, wenn die entsprechenden AAk monospezifisch oder dominant vorliegen. = Grundlage für die weitere Entwicklung von Software-Algorithmen zur automatischen Musterdifferenzierung an Hep-2-Zellen

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