Identifizierung und Quantifizierung von ätherischen Ölen mittels Gaschromatographie
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- Clara Maurer
- vor 7 Jahren
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Transkript
1 Identifizierung und Quantifizierung von ätherischen Ölen mittels Gaschromatographie Vor der Durchführung der Messung auch allgemeine Hinweise (Punkt 5) durchlesen! 1. Destillation Ca. 20 g der Analysenlösung (auf 1 mg genau gewogen!) werden mit Hilfe einer Glas-Pasteurpipette in einen 100 ml Rundkolben eingewogen. Zu dieser Lösung werden 20,0 ml (Vollpipette!) der Stammlösung des internen Standards pipettiert und mit ca. 20 ml destilliertem Wasser (aus den zwei großen Vorratsbehältnissen im Labor) versetzt. Außerdem werden ca. fünf Siedeperlen hinzugefügt. Es werden ca. 50 ml in einen im Eisbad stehenden 100 ml Messkolben überdestilliert (s. Abb. 1). Es wird bis zur Marke mit 40 %igem Ethanol aufgefüllt (Während der Destillation können bereits die Standardlösungen hergestellt und eingespritzt werden, s. Punkt 2,3 und 4.): Vor der Destillation werden zunächst die Schliffe der Glasgeräte mit Schlifffett leicht gefettet. Der Rundkolben mit der Analysenlösung wird links an die Destillationsapparatur gehängt, mit einer Schliffklammer gesichert und im Sandbad platziert. Rechts wird ein 100 ml Messkolben in ein Eisbad (in einer Plastikschüssel) gestellt (der Weg zur Eismaschine: den Gang vor zur Eingangshalle, in der Eingangshalle links, geradeaus durch die blaue Tür, auf der rechten Seite neben dem Kaffeeautomat steht dann die Eismaschine). Die Kühlung wird vorsichtig aufgedreht (ein mäßiger Wasserfluss ist ausreichend!), wobei nach ein paar Minuten die Kühlung überprüft werden muss, da aufgrund von Druckschwankungen der Wasserfluss evtl. nachgelassen hat. Durch Einschalten des Sandbades auf höchster Stufe wird die Destillation gestartet. Nach Abschluss der Destillation wird das Sandbad wieder ausgeschaltet und die Probe im Messkolben auf Raumtemperatur gebracht. Anschließend wird mit 40 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. Dieses Destillat wird direkt zum Einspritzen in den GC verwendet. Abb. 1 Aufbau der Destillationsapparatur 1
2 Herstellung der Standardlösungen Als Standards dienen 1,8-Cineol, Campher, Linalool, Menthol, Carvon und Thymol. (Flüssige Substanzen bitte mit Hilfe einer Glas-Pasteurpipette einwiegen!) 2. Herstellung der Lösungen zum Identifizieren 2.1 Stammlösung der Standardsubstanzen Von jeder der oben genannten Standardsubstanzen werden je 50 mg in einen 100 ml Messkolben eingewogen und mit 40 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. 2.2 Standardlösungen Die Lösung aus 2.1 wird 1:5 verdünnt und anschließend in den GC gespritzt. Die Standardsubstanzen eluieren in oben genannter Reihenfolge. Damit kann die Retentionszeit für jede einzelne Substanz bestimmt werden. 3. Herstellung der Lösungen zum Quantifizieren Der interne Standard wird für die jeweilige Analyse vom Assistenten angesagt. 3.1 Stammlösung des internen Standards Ca. 50 mg (auf 0,1 mg genau) des internen Standards werden in einen 100 ml Messkolben eingewogen und mit 40 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. 3.2 Stammlösung Standard Ca. 50 mg (auf 0,1 mg genau) des Standards werden in einen 100 ml Messkolben eingewogen und mit 40 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. (Falls Tropfenbildung durch nicht gelöste ätherische Öle auftritt, muss 50%iger Ethanol zum Auffüllen verwendet werden.) 3.3 Standards mit internem Standard 20,0 ml (Vollpipette!) der Stammlösung des internen Standards und 20,0 ml (Vollpipette!) der Stammlösung des Standards werden in einen 100 ml Messkolben pipettiert und mit 40 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt. 2
3 4. Durchführung 4.1 Inbetriebnahme des Gaschromatographen Die Inbetriebnahme erfolgt zusammen mit dem betreuenden Assistenten. Als Gase werden Helium (Trägergas) sowie Wasserstoff und synthetische Luft benötigt (die Gaszufuhr befindet sich an der rechten Wand, s. Abb. 2). Nachdem das Trägergas fließt kann der Gaschromatograph eingeschalten werden. Erst dann werden die Brenngase geöffnet. Diese werden jeweils an dem silbernen Drehknopf, der mit der Gasleitung verbunden ist, aufgedreht (Helium: oberer Drehknopf an der linken Seite; Wasserstoff und synthetische Luft: jeweils unterster Drehknopf). Es wird soweit aufgedreht, bis bei den entsprechenden Manometern (am GC oben) die Markierung erreicht ist. Abb. 2 Der Gaschromatograph wird hinten am Gerät mit dem Kippschalter rechts unten eingeschaltet und Methode 1 eingestellt. Abb. 3 3
4 Der Detektor (FID) wird gezündet, indem der Knopf flame ignition kurz gedrückt wird; ein Floppen nach wenigen Sekunden zeigt das erfolgreiche Zünden an. Dieses kann auch überprüft werden, indem ein Spatel an den Detektor gehalten wird, der dann anlaufen muss. Wenn das Display ready anzeigt, ist der GC zum Einspritzen bereit (Dies gilt für jedes Einspritzen! Der GC muss nach jedem durchlaufenen Temperaturprogramm erst wieder auf die Ausgangstemperatur abkühlen!). Geräteparameter: GC: Säule: Injektor: Trägergas: Detektor: Brenngase: Injektionsvolumen: Danieducational FS-Supreme-5ms (Polysiloxan); ø 0,32 mm, Länge 30 m Split/Splitless Helium, Druck ca. 1 bar FID Wasserstoff, synthetische Luft 1 μl Temperaturprogramm (Methode 1) Equil. Time 01 Min Oven Temp 1 80 C Time 1 06:00 Min Rate 8.0 C/Min Oven Temp C Time 2 01:00 Min Rate C/Min 4.2 Inbetriebnahme des Integrators Der Integrator HP 3390 wird hinten links eingeschaltet. Nachdem er ca. zwei Zeilen ausgedruckt hat, können nach wenigen Sekunden die Einstellungen eingegeben werden. Die Eingabe erfolgt durch Drücken der Taste des jeweiligen Parameters, der eingestellt worden soll, Eingabe der entsprechenden Zahl (s. u.) und jeweils anschließendem Drücken der Enter-Taste: Att 2 3 Enter CHT SP 0.5 Enter TRSH 2 Enter PK WD 0.04 Enter AR REJ Enter Die angegebenen Werte für die Integratorparameter müssen i. d. R. nicht verändert werden. Gegebenfalls kann bei der Standardmischung ATT 2 auf 4 verstellt werden, um die Peaks kleiner darzustellen bzw. CHT SP auf 1.0, um die Peaks optisch deutlicher zu trennen. 4
5 Bedeutung der Integratorparameter: - CHT SP: bestimmt den Papiervorschub - ATT 2 : bestimmt die Darstellung der Größe der Peaks; je kleiner der Wert, desto höher der Peak - PK WD: steuert den Peakerkennungsprozess - TRSH: steuert die Rauschunterdrückung beim Integrieren und somit die Empfindlichkeit - AR REJ: regelt die Unterdrückung von Peaks beim Integrieren 4.3 Identifizierung der ätherischen Öle in der Probe Zunächst wird die Standardlösung aus 2.2 eingespritzt, um die Retentionszeiten der einzelnen Substanzen zu erhalten (zum Einspritzen siehe Punkt 5). Anschließend wird die Probe aus 1 eingespritzt. Anhand der gefundenen Retentionszeiten können die in der Analyse enthaltenen ätherischen Öle identifiziert werden. Aufsatzversuch: Zur Absicherung wird eine 1:1 Mischung aus der Probe und den vermuteten Standards eingespritzt. Sowohl die Standardlösungen als auch das Destillat werden jeweils mindestens dreimal eingespritzt. 4.4 Quantifizierung der ätherischen Öle in der Probe Die Lösungen aus 1 und 3.3, welche einen internen Standard enthalten, werden je dreimal eingespritzt. Die Berechnung erfolgt anhand der Formeln: Gehalt (Analyt) = Gehalt (interner Standard) * Peakfläche (Analyt) * f Peakfläche (interner Standard) f = Einwaage (Standard) * Peakfläche (interner Standard) Einwaage (interner Standard) * Peakfläche (Standard) Die Angabe erfolgt in %. 5
6 5. Allgemeine Hinweise zum GC - vor dem Einspritzen die Spritze mit der Probe bzw. dem jeweiligen Standard einige Male durchspülen - die Spritze zwischen dem Einspritzen verschiedener Substanzen (Standard oder Probe) mit 40 %igem Ethanol spülen - zum Einspritzen 1 μl ohne Luftblasen (Kontrolle!) aufziehen, dann Luft aufziehen als Polster, um vorzeitiges Verdampfen der Probe beim Einführen in den Injektor zu vermeiden - Spritze vorsichtig in das Septum des Injektors einführen, um Verbiegen zu vermeiden! - nach dem Einspritzen auf Start am GC und am Integrator drücken, dann die Spritze wieder aus dem Injektor ziehen - wenn das Temperaturprogramm durchgelaufen ist, auch den Integratorlauf mit Stop beenden - die nächste Probe kann erst wieder eingespritzt werden, wenn das Display wieder ready anzeigt 6. Angaben im Protokoll - Probe - Literatur - Prinzip - Durchführung (mit Angabe der GC-Parameter) - Berechnung (mit allen relevanten Einwaagen) - Ergebnis - alle relevanten Chromatogramme (Standards, Probe, Aufsatzversuch) 6
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