Arbeiten mit Membranproteinen. Rupert Abele

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Berndt Goldschmidt
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1 Arbeiten mit Membranproteinen Rupert Abele

2 Überblick Solubilisierung Reinigung Liposomenpräparation Rekonstitution

3 Selbstorganisation von Detergenzien und Lipiden Detergenz Bildung von Mizellen (a) Phospholipiden Bildung von Lipiddoppelschichten (b) und Liposomen (c)

4 Einteilung von Detergenzien Ionische Detergenzien hohe Solubilisationseffizienz stark denaturierend Nichtionische Detergenzien milde Detergenzien kurze Kettenlängen (C 7 -C 10 ) führen oft zur Inaktivierung des Membranproteins

Nichtionische Detergenzien milde Detergenzien kurze

5 Einteilung von Detergenzien Gallensäuresalze ionische Detergenzien mit starrem steroidem Rückgrat bildet nierenförmige Aggregat weniger inaktivierend als ionische Detergenzien Zwitterionische Detergenzien Eigenschaften zwischen ionischen und nicht ionischen Detergenzien CHAPSO

inaktivierend als ionische Detergenzien Zwitterionische Detergenzien

6 Eigenschaften von Detergenzien CMC (critical micellar concentration) verringert sich mit Länge der Alkylkette erhöht sich mit Anzahl der Doppelbindungen oder Verzweigungen erhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien

erhöht sich mit Anzahl der Doppelbindungen oder Verzweigungen

7 Eigenschaften von Detergenzien N (aggregation number) Anzahl der monomeren Detergenzmoleküle in einer Mizelle erhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien CMT (critical micellar temperature) Temperatur, bei der monomeres, kristallines und mizellenhaltiges Detergenz im Gleichgewicht sind Detergenzlösungen werden klar Cloud point (Trübungspunkt) Temperatur über der CMT, bei der nichtionische Detergenzien trübe werden Phasentrennung in Detergenz reiche und verarmte Phase (eg. Triton X-114, 22 C)

kristallines und mizellenhaltiges Detergenz im Gleichgewicht sind Detergenzlösungen werden klar Cloud point (Trübungspunkt)

8 Faustregel

9 Eigenschaften von Detergenzien

10 Phasen der Solubilisierung

11 Phasen der Solubilisierung

12 Kinetik der Solubilisierung

13 Arten der Solubilisierung

14 Kryo-Elektronenmikroskopie Triton X-100 Decylmaltoside 5 mm; 0 h 5 mm; 144 h

15 Vesikel-Mizellen Übergang R sat R sat DM [DM] < R sat TX-100 [DM] = R sat 4 days

16 Arten der Solubilisierung Transbilayer Solubilisation Schnell Micellar Solubulisation Langsam schneller Flip-Flop kooperative Bindung langsamer Flip-Flop, da große, sehr hydrophile Kopfgruppe Transfer von Phospholipiden und Detergenzien aus der äußeren Schicht in Mizellen

Bindung langsamer Flip-Flop, da große, sehr hydrophile Kopfgruppe

17 Der Packungsparameter bestimmt den Solubilisierungsmechanismus P = V a l Detergenz transbilayer solubilisation V = hydrophobes Volumen a = Querschnittsfläche des hydrophilen Kopfs l = Länge der hydrophoben Kette micellar solubilisation Phospholipid Phosphatidylethanolamin

a = Querschnittsfläche des hydrophilen Kopfs l = Länge der

18 Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus Änderung der Querschnittsfläche (Detergenz oder Lipid) Octyl β D glucopyranosid a OG = 41,3 A 2 Octyl β D thioglucopyranosid a OTG = 47,2 A 2 P OG > P OTG P DOPC > P DMPC

Lipid) Octyl β D glucopyranosid a OG = 41,3 A 2 Octyl

19 Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus Änderung der Querschnittsfläche (Ionenstärke) P 300 mm NaCl > P 100 mm NaCl

20 Detergenz-Protein Interaktion

21 Was ist solubilisiert? Alles im Überstand nach Zentrifugation für 1 h bei 100,000 x g

22 Praktische Aspekte der Solubilisierung Detergenz (Detergenz-screen) Einfache Screening Prozedur (Western blot; Achtung spezielles Laufverhalten etc.) Lipidkonzentration Detergenz Lipid Verhältnis (so gering wie möglich) ρ = [detergent] - cmc [lipid] Solublisieringsdauer (so kurz wie möglich) Temperatur Ionenstärke Puffer, ph Chemische Chaperone (Glycerin,Sucrose) Stabilität und Funktionalität des Proteins

23 Größenbestimmung von Membranproteinen OmpF mit einem Detergenzring

24 Größenbestimmung von Membranproteinen Problem: Stokes-Radius setzt sich aus Protein und Detergenz zusammen Detergenzanteil ist von der Art des Detergenz und Protein abhängig Methoden der Molekulargewichtbestimmung: Analytische Ultrazentrifugation Statische Lichtstreuung STEM (scanning transmission electron microscopy) Kleinwinkel Neutronen- oder Röntgenstrahlenbeugung

25 Der Umgang mit Lipiden Lagerung von organischen Lösungen von Phospholipiden in Glasflaschen überschichtet mit Argon bei -80 C Niemals Plastikpipetten benutzen, um organische Lösungsmittel zu pipettieren Ungesättigte Phospholipide sind hygroskopisch (in getrockneten organischen Lösungsmitteln lagern) Phospholipide nicht länger in wässrigen Lösungen aufbewahren Oxidation von Phospholipiden verhindern (benutze qualitativ hochwertige Lipidextrakte, destilliertes und entgastes Wasser, vermeiden von Lichteinstrahlung und hohen Temperaturen, verwende Antioxidantien wie Vitamin C, DTT, EDTA) Arbeite über der Phasenübergangstemperatur liquid crystaline crystaline

26 Liposomen Amphiphil polarer Kopf unpolaren Schwanz water MLV µm water SUV LUV 50 nm nm

27 Liposomen Herstellung Amphiphile Lipide Auflösen in organischer Phase Auflösen in Detergenzien Trocknen des Lipidfilms Zugabe von wässriger Phase Kolloidale Lösung Hydratisieren (MLV) Ultraschallbehandlung Entfernung des Detergenz Ultraschall SUV Entfernung des organischen Lsgmittels Einfrieren/ Auftauen LUV Extrudieren Extrudieren SUV LUV (homogene Größe) LUV

28 Liposomen Herstellung von getrockneten Lipiden Auflösen der Lipide (5 20 mg/ml) in organischem Lösungsmittel (Chloroform oder Chloroform:Methanol 2:1) Trocknen der Lipide in einem Rotationsverdampfer (Multilammelare Schichten) Hydratisierung in einem Puffer oberhalb der Phasenübergangstemperatur zwischen Gel und flüssig-kristalliner Phase (MLVs entstehen) Ultraschallbehandlung (SUVs entstehen) Einfrieren und auftauen 3x (LUVs mit inhomogener Größe entstehen) Extrudieren (ungerade Anzahl, mindestens 11x) durch einen nm Polycarbonatfilter (homogene LUVs werden gebildet)

29 Hydratisierung Flüssig-kristalline Phase Kristalline Phase

30 Extrudieren oberhalb der Phasenübergangstemperatur immer ungerade Anzahl von Durchläufen

31 Charakterisierung der Liposomen Phospholipidkonzentration (Barlett assay): Hydrolyse des Phosphats mittels Perchlorsäure; Bestimmung von anorganischem Pi in Komplex mit Ammoniummolybdat Bestimmung der Lipidzusammensetzung und Oxidation von Lipiden Dichtigkeit der Liposomen: Selbstquenchen von Fluorescein, enzymatische Assays, radioaktive Substanzen Bestimmung des eingeschlossenen Volumens Bestimmung der Anzahl der Schichten Derivatisierng der äußeren Lipide; Elektronenmikroskopie Größenbestimmung der Liposomen: Elektronenmikroskopie, dynamische und statische Lichtstreuung Trennung verschiedener Liposomen: Zentrifugation, Gelfiltration, Field flow fractionation

32 Field Flow Fractionation

33 Proteininkooperation

34 Proteininkooperation Natriumcholate Triton X-100 Octylglucoside

35 Entfernung von Detergenzien

36 Kritische Punkte der Rekonstitution Proteinaktivität Proteinausbeute in jedem Schritt Phospholipidzusammensetzung Lipid-zu-Protein Verhältnis Detergenz für Destabilisierung von Liposomen muß kompatibel mit Proteinaktivität sein Orientierung des Proteins in der Membran Dichtigkeit der Proteoliposomen Inkoorporationseffizienz Trennung von Liposomen von Proteoliposomen

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