Gentherapie. Aktuelle Methoden und Forschungsergebnisse

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1 Gentherapie Aktuelle Methoden und Forschungsergebnisse Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Biozentrum Max-von Laue-Str Frankfurt am Main Dingermann@em.uni-frankfurt.de 01/18/11

2 Arzneimittel sind Stoffe oder Stoffgemische unterschiedlicher chemischer Komplexität, die mit Biomolekülen interagieren, um deren Überaktivität zu hemmen = Inhibitoren um deren Aktivität zu steigern = Aktivatoren oder sind Stoffe, die eine fehlende Aktivität ersetzen = Substitutions-Wirkstoffe 2

3 Arzneimittel können chemisch unterschiedlich komplex sein. Sie können relativ klein sein (Inhibitoren oder Aktivatoren) 3

4 Arzneimittel können chemisch unterschiedlich komplex sein. oder sie können sehr groß sein (Substitutions-Wirkstoffe) 4

5 Arzneimittel Warum können Arzneimittel nicht auch Informationseinheiten sein, die die Zelle in Substitutions-Wirkstoffe umwandelt? Gentransfer-Vektoren 5

6 Anno 1981 "Gentherapie" anno 1981 bei Drosophila melanogaster Gerry Rubin 6

7 Inhalt Regulatorische Aspekte 7

8 Somatischer- vs. Keimbahn-Gentransfer Somatischer Gentransfer Eingebrachte Information wird nur in der behandelten Zelle realisiert. Keimbahn Gentransfer Eingebrachte Information kann an Folgegenerationen weitergegeben werden. Nur der somatische Gentransfer gilt bei der Anwendung am Menschen als ethisch. Ein Keimbahn-Gentransfer ist bei Menschen streng verboten (Embryonenschutzgesetz 5) 8

9 Definition Somatischer Gentransfer (Gentherapie) Transfer von DNA in somatische, humane Zellen zu therapeutischen Zwecken. Ziel ist die Beeinflussung pathophysiologischer Prozesse, um Krankheiten vorzubeugen, zu heilen, zu lindern, bzw. die Diagnostik zu verbessern. Somit sind Gentransfer-Vektoren für eine somatische Gentherapie Arzneimittel! 9

10 Arzneimittel 2 Abs.1 AMG Arzneimittel sind Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper 1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen, 2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen, 3. vom menschlichen oder tierischen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen, 4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen. 10

11 Note for Guidance...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99) Art des Gentransfer- Arzneimittels Beispiele a) nackte Nukleinsäuren natürliche oder synthetische Nukleinsäure im Allgemeinen eingebunden in entsprechende Plasmide oder Kassetten (ausschließlich Antisense-Oligonukleotide) mit oder ohne Adjuvans b) komplexierte Nukleinsäuren oder nicht-virale Vektoren (i) siehe oben, aber mit komplexierten (z.b. Transferrin) oder anderen Polymeren (z.b. DEAE-Dextran, Polylysin) (ii) wie (i), aber verkapselt oder assoziiert (z.b. in Liposomen) 11

12 Note for Guidance...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99) Art des Gentransfer- Arzneimittels Beispiele c) virale Vektoren Normalerweise replikationsinkompetente Viren, einschließlich Adenovirus, Retrovirus, Adenoassoziiertes Virus, Herpes-simplex-Virus, in einigen Fällen replikationskompetente Viren (z.b. d) genetisch modifizierte Zellen allogene oder xenogene Zellen oder Bakterienzellen mit einem neuen Nukleinsäureabschnitt 12

13 12. AMG-Novelle (2004) 4 Abs. 9 AMG "Gentransfer-Arzneimittel sind zur Anwendung am Menschen bestimmte Arzneimittel im Sinne des 2 Abs. 1, die zur genetischen Modifizierung von Körperzellen durch Transfer von Genen oder Genabschnitten bestimmte nackte Nukleinsäuren, virale oder nichtvirale Vektoren, genetisch modifizierte menschliche Zellen oder rekombinante Mikroorganismen, letztere ohne mit dem Ziel der Prävention oder Therapie der von diesen hervorgerufenen Infektionskrankheiten eingesetzt zu werden, sind oder enthalten." 13

14 Andere gesetzliche Vorschriften Gentechnik-Gesetz (GenTG) Die Herstellung von Gentherapie-Vektoren bedingt in der Regel die (vorübergehende) Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen, die nur in so genannten gentechnischen Anlagen erfolgen darf. Das bedeutet, dass die Herstellung der Gentransfer-Vektoren und ggf. auch die Ex-vivo-Modifizierung von Patienten-Zellen in einer gentechnischen Anlage unter GMP-Bedingungen erfolgen muss. Allerdings......unterliegt die Anwendung von gentechnisch veränderten Zellen am Menschen ausdrücklich nicht dem GenTG ( 2 Abs. 2). 14

15 Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer (bis 2004) "Richtlinien zum Gentransfer in menschliche Körperzellen" Die Genehmigung einer klinischen Gentherapie-Studie erfordert ein positives Votum der zuständigen Ethikkommission, die bei der fachlichen Beurteilung von Anträgen von der Kommission Somatische Gentherapie (KSG) beraten werden soll. Der verantwortliche Leiter des klinischen Versuches muss ein approbierter Arzt sein. 15

16 Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärztekammer (bis 2004) Gegenstand der Beurteilung medizinische Indikation und Begründung für das Vorhaben wissenschaftliche Qualität des Forschungsvorhabens Nutzen-Risiko-Abwägung wissenschaftliche, technische und ärztliche Qualifikation des Antragstellers Einhaltung der nationalen und internationalen Regeln für die biomedizinische Forschung an Menschen gemäß der revidierten Deklaration von Helsinki ethische Vertretbarkeit des Forschungsvorhabens 16

17 12. AMG-Novelle 40, 77, 42 AMG Klinische Studien müssen prinzipiell von der zuständigen Bundesoberbehörde genehmigt werden ( 40). Für die Anwendung von Gentransfer-Arzneimitteln ist die zuständige Bundesoberbehörde das Paul-Ehrlich-Institut in Langen ( 77). Eine Gentherapie-Studie darf erst begonnen werden, wenn die Bundesoberbehörde schriftlich eine Zustimmung erteilt hat ( 42). 17

18 Inhalt Strategien und Indikationen 18

19 Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Genersatztherapie Intakte Kopie eines defekten Gens 19

20 Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Tumorvakzinierung IL2-, TNFα-, GM-CSF-Gen IL2 TNFα GM-CSF Fibroblast, T-Zelle, Tumorzelle Tumorzellen werden angelockt und eliminiert 20

21 Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Sensibilisierung von Zellen für Sekundärtherapie Multidrug- Resistenz-Gen HSV-Thymidin- Kinase-Gen 21

22 Indikationen für Gentherapiestrategien Monogenische Erkrankungen X-Chromosom gekoppelte SCID ADA Defizienz (ADA-SCID) Mucopolysaccharidose Familiäre Hypercholesterinämie Cystische Fibrose (Mucoviszidose) Hämophilie B Chronische X-Agranulomatose Krebs Gynäkologische Tumore (Brust, Eierstock, Cervix) Zentrales Nervensystem (Glioma, Neuroblastoma) Gastro-Intestinaltrakt (Colon-CA, colorektales CA, Leber-CA) Urogenitaltrakt (Prostata-CA, Nieren-CA) Haut (Melanome) Lungen-CA Hämatologische Krebserkrankungen 22

23 Indikationen für Gentherapiestrategien Virus-Infektion HIV Andere Erkrankungen Rheumatische Arthritis Arterien-Erkrankungen Markierungsexperimente GvHD-Kontrolle Hämatologische Krebserkrankungen Melanome Neuroblastome Non-Small-Cell" Lunge- CA Blasenkrebs 23

24 Somatischer Gentransfer Gentherapie in klinischen Studien Stand Oktober

25 Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln 25

30 Methoden zur genetischen Veränderung von Zellen Chemische Methoden Ca 2+ -Phosphat-Präzipitation Liposomen Nanopartikel Physikalische Methoden Mikroinjektion Elektroporation Bioballistik Transfektion Biologische Methoden Viren Infektion; Transduktion 30

31 Der ideale Gentherapie-Vektor... hat eine hohe Transfektions-/Transduktionseffizienz;... hat einen hohen Titer (>10 8 Viruspartikel/ml);... ist einfach und reproduzierbar herzustellen;... infiziert proliferierende und ruhende Zellen;... erlaubt nachhaltige Expression des therapeutischen Gens;... wird stabil in das Genom der therapierten Zellen integriert;... unterstützt Regulierbarkeit der Expression;... ist spezifisch für bestimmte Zelltypen;... ist nicht immunogen 31

32 Inhalt Transfersysteme 32

33 Transfersysteme Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA 33

34 Gentransfer-Vektoren ex vivo in vivo stabil/transient Virale Vektoren Retrovirus +? S Adenovirus +/- + T Adeno-assoziiertes Virus (AAV) +? S Herpesvirus +/- +? Vaccinia-Virus +/- + T Nichtvirale Vektoren Liganden/DNA-Konjugate - + T Adenovirus/DNA-Konjugate - + T Liposomen +/- + T Ca-Phosphat-Präzipitation +/- - S DNA-Injektion - + T 34

35 Somatischer Gentransfer Gentherapie in klinischen Studien Biologische Gentransfer- Methoden sind deutlich effizienter als physikochemische Transfektionsmethoden Stand Oktober

36 Transfersysteme Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA Retroviren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Aussicht auf langfristige Stabilität Durch Retroviren übertragene Gene integrieren nach dem Zufallsprinzip und können deshalb intakte Gene zerstören 36

37 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Aufbau von Retroviren C-Typ Retrovirus (MLV) LTR 37

38 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Vom Retrovirus zum Gentransfer-Vektor C-Typ Retrovirus (MLV) 38

39 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Problem 1: Ein Gentherapie-Vektor darf nicht selbst replizieren C-Typ Retrovirus (MLV) 39

40 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Problem 2: Ein Gentherapie-Vektor darf nicht mit HERVs rekombinieren C-Typ Retrovirus (MLV) 40

41 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Die Konsequenz aus den Problemen 1 + 2: Man trennt Replikation von Funktion 41

42 Retrovirale Gentransfer-Vektoren Ergebnis: Gentransfer-Vektor Verpackungszelle Gentransfer-Vektor Verpackungszelle

43 Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

49 Herstellung replikationsdefekter Retroviren Zelle des Patienten

50 Eigenschaften retroviraler Gentransfer- Vektoren hohe Transduktionsfrequenz moderate Virustiter ( /ml) infizieren nur proliferierende Zellen nicht zelltypspezifisch nur Ex-vivo-Applikation geringe Insertgrößen (< 7,5 kb) Integration kaum Insertionsspezifität oft langanhaltende Expression kaum immunogen

51 Der erste klinische Gentherapie-Versuch war 1990 Science 270:470 (1995) Science 270:475 (1995)

52 10 Jahre später: erste Erfolge Science 288:669 (2000)

53 aber auch Sicherheitsprobleme Science 302:415 (2003)

54 Retrovirus MLV inseriert in aktive Gene Science 300:1749 (2003)

55 Alternative: Lentivirale Gentransfer- Vektoren Aufbau von Lentiviren Lentiviren sind als Gentransfer-Vektoren interessant, weil sie typischerweise auch nicht-proliferierende Zellen infizieren können. 55

56 Alternative: Lentivirale Gentransfer- Vektoren Aufbau von Lentiviren Lentiviren sind als Gentransfer-Vektoren interessant, weil sie typischerweise auch nicht-proliferierende Zellen infizieren können. 56

57 Humanes Immundefizienzvirus (HIV-1) Funktionen zusätzlicher Elemente in HIV auf der genomischen RNA TAR (trans-activating response element, Nukleotide 1-55), wird von Tat gebunden RRE (Rev-responsive element, Nukleotide ) wird von Rev gebunden kodierte Proteine Tat: steigert die Prozessivität des Transkriptionskomplexes Rev: verhindert Spleißen der "genomischen" HIV-RNA, steigert den Export ungespleißter RNA in das Cytoplasma Vif: wichtig für effiziente DNA-Synthese und Virusstabilität Vpr: vermittelt Penetration in den Zellkern, induziert Arretierung des Zellzyklus in G2, dadurch Apoptose Nef: unterstützt Abbau von CD4-Molekülen durch Endozytose Vpu: unterstützt Abbau von CD4-Molekülen im ER p6: bindet an Vpr, unterstützt Einbau von Vpr in Viruspartikel

58 HIV-basierte Gentherapie-Vektoren Generelle Überlegungen einige Akzessorische Proteine sind zwar für die Pathogenität des Virus in vivo essenziell, sind aber für die Replikation in vitro nicht notwendig (Vif, Vpr, Vpu, Nef). Das Protein Tat ist nur notwendig, wenn die Expression des Virusgenoms vom 5'-LTR des Virus gesteuert wird. Rev ist für eine effiziente Herstellung von Viruspartikel (Gentransfer-Vektor) notwendig.

59 Alternative: Lentivirale Gentransfer- Vektoren

60 Therapie von AIDS... mit HI-Viren? Vektor VRX496 transduziert CD4 + T-Helferzellen mit > 90 % Effizienz transduziert auch andere Zelltypen, u.a. CD34 + -positive Blutstammzellen Transgen: Antisense-Sequenz gegen wt-hiv-env (937 bp) trägt HIV-Verpackungssignalsequenz (Ψ) trägt RRE Expression des Transgens durch den wt-hiv LTR-Promotor Expression abhängig von Tat und Rev

61 Therapie von AIDS... mit HI-Viren? Vektor VRX496 transduziert CD4 + T-Helferzellen mit > 90 % Effizienz transduziert auch andere Zelltypen, u.a. CD34 + -positive Blutstammzellen Transgen: Antisense-Sequenz gegen wt-hiv-env (937 bp) trägt HIV-Verpackungssignalsequenz (Ψ) trägt RRE Expression des Transgens durch den wt-hiv LTR-Promotor Expression abhängig von Tat und Rev

62 Biologisches Risiko Auch lentivirale Vektoren inserieren in aktive Gene Science 300:1749 (2003)

63 Transfersysteme Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA Adenoviren verursachen keine ernsten Krankheiten; sie besitzen eine große Aufnahmefähigkeit für fremde Gene Die übertragenen Gene sind nur temporär aktiv; Die Viren lösen Immunreaktion aus 63

64 Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel lineare, doppelsträngige DNA mit bp. an den beiden 5'-Enden jeweils kovalent ein Molekül "Terminales Protein (TP)", die das Genom quasi zirkularisieren. Invertierte Wiederholungssequenzen von bp E1A-Protein fungiert als Transkriptionsaktivator der frühen Gene E1B, E2A, E2B, E3 und E4. Adenoviren können in normalen Körperzellen nur replizieren, wenn die Proteine E1A und E1B vorhanden sind. E1A und E1B binden an die Tumorsuppressorproteine Rb und p53 und inaktivieren diese.

65 Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel hohe Transduktionsfrequenz sehr hohe Virustiter ( /ml) infizieren auch nicht proliferierende Zellen kaum zelltypspezifisch Ex-vivo- und In-vivo-Applikation möglich große Inserts (8 kb, maximal 30 kb) keine Integration zeitlich begrenzte Expression stark immunogen

66 Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel Erste Generationsvektoren Gentherapie-Vektor Verpackungszelle

67 Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel Zweite Generationsvektoren Gentherapie-Vektor Verpackungszelle

68 Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel Dritte Generationsvektoren (gutless-vektoren) Gentherapie-Vektor Verpackungszelle

69 Erste klinische Studien Nat. Genet. 8:42 (1994)

70 Transfersysteme Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA Adeno-assoziierte Viren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Sie verursachen keine ernsten Krankheiten Adeno-assoziierte Viren besitzen eine relativ geringe Aufnahmekapazität 70

71 Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel Adeno-assoziiertes Virus (AAV) nicht humanpathogene Parvoviren besitzen ein einzelsträngiges DNA-Genom von ca Nukleotiden 125 Basen lange Inverse terminale Wiederholungen (ITRs = inverted terminal repeats) an beiden Enden. AAVs gehören zu den "Dependoviren, d.h. sie benötigen für ihre eigene Replikation andere "Helferviren" wie Adeno- oder Herpesviren.

72 Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel Aufbau von Gentransfer-Vektoren Verpackungszelle

73 Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel hohe Transduktionsfrequenz hohe Virustiter (<10 10 /ml) benötigt Adenovirus für Replikation Gefahr der Kontamination mit Adenoviren infizieren auch "stille" Zellen In-vivo-Applikation kleine Inserts (<4,5 kb) spezifische Integration (Rep-abhängig) z.t. langanhaltende begrenzte Expression nicht immunogen

74 Erste klinische Studien Klinische Studien zur Gentherapie der Hämophilie Nat. Genet. 24:257 (2000)

75 Gentherapie mit replikationsfähigen Viren Adenoviren sind prinzipiell cytolytische Viren, wenn sie zur Replikation in der Lage sind. Diese Fähigkeit erreichen sie, indem sie mit ihren Genprodukten E1A und E1B die Tumorsuppressorgene p53 bzw. Rb inaktivieren. Da Tumorzellen diese Gene häufig durch Mutation verloren haben, können auch Adenoviren mit Deletionen der E1A- und E1B- Funktionen replizieren und die Tumorzellen lysieren.

76 Gentherapie mit replikationsfähigen Viren

79 Transfersysteme Retroviren Adenoviren AAV Liposomen DNA Liposomen enthalten keine viralen Gene und bergen deshalb keine sekundären biologischen Gefahren. Nackte DNA wurde lange eher für Impfungen angewendet. Heute aber durchaus auch für genthetapeutische Ansätze in Erprobung. Liposomen sind als Transfersysteme deutlich weniger effizient als Virale Systeme. Die DNA wird nicht gezielt sondern eher zufällig ins Genom integriert. Der Gentransfer mit nackter DNA ist sehr ineffizient; Meist erweisen sich die DNA und die Transformation als instabil. 79

80 Virusfreie Gentherapie-Vektoren Plasmid-DNA geringe Transfektionsfrequenz billig in großen Mengen herzustellen keine Belastung durch Viren Transfektion von nicht prolifierenden Zellen In-vivo-Applikation auch große Inserts kaum Integration, zeitlich begrenzte Expression transgene Zelllinien für Langzeitexpression (z.b. Stammzellen) kaum immunogen

81 Nichtvirale Systeme für die somatische Integration DNA-Transposasen Sleeping Beauty (SB); Integration in ein TA-Dinukleotid PiggyBac (PB); Integration in eine TTAA-Nukleotidsequenz 81

82 Nichtviraler stabiler Gentransfer somatische Integration 82

83 Nichtvirale Systeme für die somatische Integration DNA-Transposasen Sleeping Beauty (SB); Integration in ein TA-Dinukleotid PiggyBac (PB); Integration in eine TTAA-Nukleotidsequenz Phagenintegrase PhiC31 bindet an die genannte Pseudo-attP-Anheftungsstellen in Säugetier-Genomen, von denen es beim Menschen etwa 100 bis 1000 Vertreter gibt. 83

85 Nichtvirale Systeme für die somatische Integration DNA-Transposasen Sleeping Beauty (SB); Integration in ein TA-Dinukleotid PiggyBac (PB); Integration in eine TTAA-Nukleotidsequenz Phagenintegrase PhiC31 bindet an die genannte Pseudo-attP-Anheftungsstellen in Säugetier-Genomen, von denen es beim Menschen etwa 100 bis 1000 Vertreter gibt. Zinkfinger-Nukleasen: Fusionsproteine, die aus zwei wesentlichen Bestandteilen bestehen: einer DNA-Bindungsdomäne und einer DNA-Nukleasedomäne. 85

87 Episomale persistierende therapeutische Genfähren: DNA-Replikons DNA-Replikons, die von einem Herpesvirus abgeleitet sind Z.B. das EBV-Replikon, das aus dem viralen Protein EBNA1 und einem origin of plasmid replication (orip) besteht. Artifizielle Episomen, die rein auf zellulären Komponenten aufbauen Alle bekannten Replikationsursprünge aus höheren Organismen enthalten eine DNA-Sequenz (Scaffold/Matrix Attached Region, S/MAR), die an eine subnukleare Struktur, die Kernmatrix oder Kern-Scaffold, binden. 87

89 Inhalt Die Frankfurter Studie 89

90 Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie Im Universitätsklinikum Frankfurt wurden im Jahre 2004 zwei Patienten mit X-CGD (25 und 26 Jahre alt) mit genmodifizierten, G- CSF mobilisierten peripheren Blutstammzellen behandelt.

91 Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie Für den Gentransfer wurde ein gamma-retroviraler Vektor (SF71gp91phox) mit gp91phox cdna unter der transkriptionellen Kontrolle viraler Steuerungselemente verwendet.

92 Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie

93 Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie Bei den beiden Patienten in der Frankfurter Studie kam es zur Rückbildung von Leberabszessen und einer Pilzinfektion der Lunge innerhalb von 50 Tagen. Danach waren beide Patienten, unter einer für CGD-Patienten typischen antimikrobiellen Prophylaxe, über 18 Monate klinisch stabil und frei von Infekten. Dabei lag die Anzahl Oxidase positiver Granulozyten im Blut bei /µl. Schließlich entwickelte sich durch Insertionsmutagenese eine klonale Expansion in der Hämatopoese und schließlich ein myelodysplastisches Syndrom mit Monosomie 7 bei beiden Patienten.

94 Gentherapie der septischen Granulomatose: Die Frankfurter Studie

95 Zusammenfassung Viele Erwartungen in die Gentherapie haben sich bisher nicht erfüllt: Grund 1 Gentransfer-Experimente mit Viren zeigen transiente Erfolge in Zielzellen; die Zellen sterben jedoch nach Ablauf ihrer normalen Lebenserwartung ab und werden automatisch durch kranke Zellen ersetzt. Grund 2 Immunologische Reaktionen gegen infizierte Zellen mit Langzeitwirkung

96 Ausblick Reparatur von defekten Genen durch Induktion von Reparaturprozesse und Gabe einer Matrize: 1. Reparatur einzelner Bausteine bei monogenischen Erkrankungen 2. Ersetzen eines defekten Gens durch ein intaktes Gen durch homologe Rekombination.