Entwicklung von in vivo-biotests mit submersen und emersen Makrophyten

Transkript

1 László Dören Entwicklung von in vivo-biotests mit submersen und emersen Makrophyten Der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. als Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde im Oktober 2010 vorgelegt in Kooperation mit:

2 Dekan der Fakultät für Biologie: Betreuer der Arbeit: Koreferent: Externer Betreuer: Prof. Dr. G. Neuhaus Prof. Dr. E. Wagner PD. Dr. E. M. Gross Dr. K. P. Ebke (Institut für Gewässerschutz Mesocosm GmbH) Tag der mündlichen Prüfung:

3 Danksagung Mein herzlichster Dank gilt an dieser Stelle Klaus Peter Ebke. Er hat mir die Möglichkeit zu dieser Dissertation gegeben und war die Jahre über mein Mentor, der mich auf sehr angenehme Weise zu den Forschungsinhalten hingeführt hat, mir dabei aber immer großen Freiraum ließ. Ebenso möchte ich mich herzlich bei Edgar Wagner bedanken, der mich aus der Ferne betreute. Neben den Anregungen zu meiner Dissertation waren es vor allem die inspirierenden Gespräche über Chronobiologie und Elektrophysiologie, die ich sehr zu schätzen weiß und die mein Verständnis für Pflanzen um eine wichtige Komponente erweiterten. Bei Frau Dr. Gross bedanke ich mich für die Übernahme der Koreferenz. Bei meinem Forschungspartner Raphael Ritzenthaler möchte ich mich für die harmonische Kooperation, die fachlichen Diskussionen und die konstruktiven Anregungen bedanken. Ein großer Dank gilt auch Volkmar Gerhardt. Zum einen hat er die Technik des Delta ph-messsystems bereit gestellt und entwickelt, zum anderen waren es auch hier wieder v.a. die elektrisierenden Gespräche und Diskussionen, die für mich immer höchst inspirierend waren. Es hat mir großen Spass bereitet in der Runde mit Volkmar, Edgar, Raphael und Peter gemeinsam Ideen auszutauschen, zu planen und zu entwickeln. An dieser Stelle möchte ich mich auch ausdrücklich beim Mesocosm Team, bei Peter und Marlene Ebke, Petra Stegger, Sigrid Geiss, Ayla Delibas, Thomas Bing und Philipp Weitzel bedanken. Ich empfand die Arbeitsatmosphäre immer als sehr angenehm und freue mich darauf auch weiterhin Teil dieses netten Teams zu sein. Während meiner Dissertation habe ich von einer Reihe Studenten Unterstützung erfahren, die ihre wissenschaftliche Abschlussarbeit zu dem Thema meiner Dissertation gemacht haben: Alexandra Botzat, Björn Hidding, Jennie Ann Loidold, Jan Heinrich, Daniel Zeyher, Dennis Fennel, Nina Maria Brück und Daniela Feige. Jede Arbeit war für mich sehr lehrreich und hat mich ein Stück auf meinem Weg weiter gebracht. Vielen Dank.

4 Die HPLC-Analytik wurde extern in der Arbeitsgruppe von Rolf-Alexander Düring, Institut für Bodenkunde der Uni Gießen von Christoph Hartwig durchgeführt. Auch hier ein großes Dankeschön. Schließlich möchte ich mich herzlich bei meinen Eltern bedanken, die mich auf meinem Lebensweg immer unterstützt haben und auch in den letzten Jahren immer hinter mir standen. Zum Schluss möchte ich mich bei meiner Familie, bei meiner Frau Betty und meinen Söhnen János und Ilián bedanken. Trotz aller Unsicherheiten zu Beginn des Projektes sind sie mir ins ländliche Hessen gefolgt und waren immer für mich da. Aus diesem Rückhalt konnte ich große Kraft schöpfen, die mich die Arbeit bis zum Schluss mit einer gewissen Leichtigkeit verrichten ließ.

5 Die vorliegende Arbeit wurde durch das Forschungsförderungsprogramm LOEWE - Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz des Hessischen Ministeriums für Wissenschaft und Kunst finanziell unterstützt. Projektnummer: 155/08-17

6 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... I Abbildungsverzeichnis... VI Tabellenverzeichnis... XI Formelverzeichnis... XV Abkürzungsverzeichnis... XVI Abstract Einleitung Hintergrund Zielsetzung Herangehensweise Umweltchemische Grundlagen Umweltchemikalien Herbizide Ökotoxikologische Grundlagen Definition Ökotoxikologie Risikobewertung von Stoffen Expositionsabschätzung Effektabschätzung Gefahren- & Risikobewertung Gesetzliche Grundlagen für die Zulassung von Chemikalien Gesetzliche Grundlagen für die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln Makrophyten in der Risikobewertung Ökologische Grundlagen Definition Makrophyten Anpassungen von Wasserpflanzen Aquatische Photosynthese Ökologische Funktion von Makrophyten Einfluss des Menschen auf Makrophyten Allgemeiner Methodenteil In der Arbeit verwendete Testsubstanzen I

7 Inhaltsverzeichnis Atrazin ,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) In der Arbeit verwendete Testorganismen Ceratophyllum demersum Elodea nuttallii Lemna gibba Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum Riccia fluitans Salvinia natans Vallisneria spiralis In der Arbeit verwendete Fluoreszenz-Messtechniken Entstehung der Chlorophyllfluoreszenz Chlorophyll-Fluoreszenz-Messungen mit der PAM-Technik Entstehung der verzögerten Fluoreszenz Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometrie Biotestentwicklung I: Vergleich von natürlichem Teichwasser und mit Nährstoffen angereichertem Teichwasser als Testmedium für Biotests mit Ceratophyllum demersum, Elodea nuttallii und Riccia fluitans unter verschiedenen Lichtbedingungen Zielsetzung Material & Methoden Testorganismen Versuchsaufbau Licht & Temperatur Medium Versuchsdauer Nährstoff-Analytik Monitoring der chemisch-physikalischen Parameter Erfassung der Wachstumsparameter Erfassung des Phytoplanktons im Medium Daten-Analyse Ergebnisse Wasserchemie Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Phytoplankton II

8 Inhaltsverzeichnis 3.4 Diskussion Wasserchemie Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Phytoplankton Gesamtbewertung Biotestentwicklung II: Vergleich der 3 Standard-Medien Chu-, Steinberg- und AAP-Medium für Biotests mit Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum Zielsetzung Material & Methoden Testorganismen Versuchsaufbau Licht & Temperatur Medium Sediment Versuchsdauer Monitoring der chemisch-physikalischen Parameter Erfassung der Wachstumsparameter Erfassung des Phytoplanktons im Medium Daten-Analyse Ergebnisse Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Phytoplankton Diskussion Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Phytoplankton Gesamtbewertung Biotestentwicklung III: Untersuchung der Auswirkungen einer selektierenden Wurzelvorbildungsphase auf die Testorganismen Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum vor Versuchsbeginn Zielsetzung Material & Methoden Testorganismen III

9 Inhaltsverzeichnis Versuchsaufbau Licht & Temperatur Medium Sediment Versuchsdauer Monitoring der chemisch-physikalischen Parameter Erfassung der Wachstumsparameter Daten-Analyse Ergebnisse Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Diskussion Chemisch-physikalische Parameter Wachstumsparameter Gesamtbewertung Biotestentwicklung IV: Die effektive Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung von Makrophyten als Biomarker Zielsetzung Material & Methoden Testorganismen Versuchsaufbau Licht & Temperatur Medium Sediment Versuchsdauer Analytik Monitoring der chemisch-physikalischen Parameter Erfassung der Wachstumsparameter Erfassung der Quantenausbeute des PSII Erfassung des Phytoplanktons im Medium Daten-Analyse Ergebnisse Analytik Leitfähigkeit des Mediums ph-wert des Mediums O 2 -Gehalt des Mediums IV

10 Inhaltsverzeichnis Wachstumsparameter Quantenausbeute des PSII Phytoplankton Diskussion Analytik Leitfähigkeit des Mediums ph-wert des Mediums O 2 -Gehalt des Mediums Wachstumsparameter Quantenausbeute des PSII Phytoplankton Gesamtbewertung Methodenkritik Fazit Biotestentwicklung V: Delta ph Bioassay für submerse Makrophyten Zielsetzung Material & Methoden Delta ph-mess-system Testorganismen Versuchsaufbau Biomasse der Testorganismen Versuchsdauer Daten-Analyse Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Literatur Anhang V

11 Abbildungsverzeichnis ABBILDUNGSVERZEICHNIS Kapitel 1 Abbildung 1: Umweltrisikobewertung von Pestiziden... 9 Abbildung 2: Testvoraussetzungen für aktive Substanzen Abbildung 3: Zulassungsverfahren für Pflanzenschutzmittel in Deutschland Abbildung 4: Entscheidungsschema zur Notwendigkeit zusätzlicher Makrophytentests bei der Risikobewertung von Herbiziden Abbildung 5: Beispiel Heterophylie anhand von Proserpinaca palustris Abbildung 6: Querschnitt durch einen Egeria densa-stängel mit Aerenchym Abbildung 7: Schema des Gasaustauschs im Basalbereich leicht überstauter Helophyten Abbildung 8: Fragmente von Myriophyllum spicatum mit Wurzelneubildungen Abbildung 9: Verteilung der 3 anorganischen Kohlenstoffspeziierungen in wässriger Lösung in Abhängigkeit vom ph-wert Abbildung 10: Aufnahme anorganischen Kohlenstoffs bei Wasserpflanzen mit polaren Blättern Kapitel 2 Abbildung 11: Ceratophyllum demersum Abbildung 12: Bestimmungsmerkmale für E. canadensis, E. nuttallii und E. callitrichoides Abbildung 13: Elodea nuttallii Abbildung 14: Lemna gibba und Lemna minor unter ~20facher Vergrößerung Abbildung 15: Mentha aquatica Abbildung 16: Myriophyllum aquaticum Abbildung 17: Lufthülle um untergetauchte emers gewachsene Blätter von Myriophyllum aquaticum Abbildung 18: Riccia fluitans Abbildung 19: Salvinia natans unter ~4facher Vergrößerung Abbildung 20: Vallisneria spiralis Abbildung 21: Zeichnung eines Aquariums aus dem 19. Jahrhundert Abbildung 22: Zusammenhang Lichtabsorption und Chlorophyllfluoreszenz Abbildung 23: Schicksal des vom Chlorophyll absorbiertem Licht Abbildung 24: Entstehung der verzögerten Fluoreszenz Abbildung 25: Aufbau des Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometers VI

12 Abbildungsverzeichnis Abbildung 26: Kallibrations-Spektren der verschiedenen Algengruppen ermittelt nach Messungen eines Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometers Kapitel 3 Abbildung 27: Schematischer Aufbau der Wachstumskammer Abbildung 28: Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge von Ceratophyllum demersum Abbildung 29: Wachstumsverlauf von Ceratophyllum demersum Abbildung 30: Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge von Elodea nuttallii.75 Abbildung 31: Wachstumsverlauf von Elodea nuttallii Abbildung 32: Wachstumsraten (Frischgewicht) von Riccia fluitans Abbildung 33: Wachstumsverlauf von Riccia fluitans Abbildung 34: Phytoplanktonentwicklung in den Testsystemen von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii Abbildung 35: Zusammensetzung des Phytoplanktons in den Testsystemen von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii Kapitel 4 Abbildung 36: Versuchsanordnung in einem 2 L-Becherglas Abbildung 37: Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica Abbildung 38: Chlorophyll-Gehalts der Medien von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica am Ende des jeweiligen Versuches Kapitel 5 Abbildung 39: Versuchsanordnung in einem 2 L-Becherglas Abbildung 40: (A) Sprossspitze von Myriophyllum aquaticum im 40 ml-sedimentgläschen. (B) Testpflanzen mit 40 ml-sedimentgläschen im 2 L- Becherglas mit 500 ml Medium Abbildung 41: Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica Abbildung 42: Wachstumsraten Wurzellänge von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica Kapitel 6 Abbildung 43: Vorkultur von Ceratophyllum demersum VII

13 Abbildungsverzeichnis Abbildung 44: Versuchsansatz der Gruppe 1-Makrophyten. A: Lemna gibba. B: Riccia fluitans. C: Salvinia natans Abbildung 45: Versuchsansatz der Gruppe 2-Makrophyten. A: Mentha aquatica. B: Myriophyllum aquaticum Abbildung 46: (A) PAM-Messung an einem Gruppe 1-Makrophyten (Lemna gibba). (B) PAM-Messung an einem Gruppe 2-Makrophyten (Mentha aquatica) Abbildung 47: %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 48: %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 49: %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 50: %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 51: %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 52: ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 53: ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 54: ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 55: ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 56: ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 2- und 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 57: %-Erhöhung des O 2 -Gehaltes des Mediums der Makrophyten Riccia fluitans, Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 58: %-Erhöhung des O 2 -Gehaltes des Mediums der Makrophyten Riccia fluitans, Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 59: Wachstumsraten Anzahl Fronds (Lemna) bzw. Frischgewicht (Riccia & Salvinia) der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 60: Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) VIII

14 Abbildungsverzeichnis Abbildung 61: Ceratophyllum am Ende des Tests (Tag 14). A: Lösungsmittelkontrolle. B: Internodienstreckung bei 562,2 µg/l Atrazin. C: vermehrte Seitensprossbildung bei 562,2 µg/l Atrazin Abbildung 62: Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge (nur Vallisneria) der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 63: Wachstumsraten Anzahl Fronds (Lemna), Frischgewicht (Riccia & Salvinia) der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 64: Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 65: Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge (nur Vallisneria) der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 66: Ceratophyllum demersum am Ende des 2,4-D-Versuches Abbildung 67: Quantenausbeute der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 68: Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 69: Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin) Abbildung 70: Quantenausbeute der Gruppe 1-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 71: Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 72: Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D) Abbildung 73: Chlorophyll a-gehaltes im Medium der Gruppe 2- und Gruppe 3- Makrophyten am Tag 14 der Atrazin Versuche Abbildung 74: Chlorophyll a-gehaltes im Medium der Gruppe 2- und Gruppe 3- Makrophyten am Tag 14 der 2,4-D Versuche Kapitel 7 Abbildung 75: Delta ph Mess-System Abbildung 76: Bildschirmkopie der Software für das Delta ph-mess-system Abbildung 77: Versuchsaufbau mit dem Delta ph-mess-system Abbildung 78: Verlauf des ph-wertes der Medien bei dem Versuch mit 100 µg/l Atrazin IX

15 Abbildungsverzeichnis Abbildung 79: Verlauf des ph-wertes der Medien bei dem Versuch mit 200 µg/l Atrazin Abbildung 80: Verlauf des ph-wertes der Medien bei dem Versuch mit 300 µg/l Atrazin X

16 Tabellenverzeichnis TABELLENVERZEICHNIS Kapitel 1 Tabelle 1: Die Menge angewendeter Herbizide im Vergleich zur landwirtschaftlich genutzten Fläche von 14 Europäischen Ländern im Jahre Tabelle 2: Toxizitätsendpunkte Tabelle 3: Verlust von Feuchtgebieten in ausgewählten Europäischen Staaten Kapitel 2 Tabelle 4: Unterscheidungsmerkmale für Vallisneria spiralis und Vallisneria americana Kapitel 3 Tabelle 5: Zusammensetzung der Nährstoff-Stammlösungen für das Steinberg-Medium nach ISO/DIS (2003) und deren Konzentration in den Testmedien.. 67 Tabelle 6: Ergebnisse der Nährstoffanalytik des Teichwassers vor Versuchsbeginn der jeweiligen Testreihen Tabelle 7: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Ceratophyllum demersum Tabelle 8: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Elodea nuttallii Tabelle 9: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Riccia fluitans Tabelle 10: Wachstumsraten von Ceratophyllum demersum Tabelle 11: Wachstumsraten von Elodea nuttallii Tabelle 12: Wachstumsraten von Riccia fluitans Tabelle 13: Chlorophyll-Gehalt der Medien von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii am Ende des jeweiligen Versuches (Tag 28) Tabelle 14: Übersicht über die Bewertung des Testdesigns nach den Parametern physikalisch-chemische Parameter des Mediums, Wachstum des Testorganismus und Algenentwicklung im Medium Kapitel 4 Tabelle 15: Zusammensetzung des Chu-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten Chu-Mediums XI

17 Tabellenverzeichnis Tabelle 16: Zusammensetzung des Steinberg-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten Steinberg-Mediums Tabelle 17: Zusammensetzung des 20X AAP-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten 20X AAP-Mediums Tabelle 18: Zusammensetzung des Sedimentpulvers nach FEILER (2008) Tabelle 19: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien an Tag 2 und zum Ende (Tag 14) der Testreihen von Myriophyllum aquaticum Tabelle 20: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien an Tag 2 und zum Ende (Tag 14) der Testreihen von Mentha aquatica Tabelle 21: Wachstumsraten von Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum Tabelle 22: Chlorophyll-Gehalt der Medien von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica am Ende des jeweiligen Versuches (Tag 14) Kapitel 5 Tabelle 23: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien zu Beginn (Tag 0) und am Ende (Tag 7) der Testreihen von Myriophyllum aquaticum Tabelle 24: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien zu Beginn (Tag 0) und am Ende (Tag 14) der Testreihen von Mentha aquatica Tabelle 25: Wachstumsraten ohne Wurzelvorbildungsphase und mit Wurzelvorbildungsphase Kapitel 6 Tabelle 26: Übersicht über die verwendeten Makrophyten und ihre Gruppenzugehörigkeit mit Informationen zu Lebensform, Wurzeln und Taxonomie Tabelle 27: Nominalkonzentrationen der Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D Tabelle 28: Übersicht über die Versuchsansätze der verschiedenen Makrophyten- Gruppen Tabelle 29: Charakteristika der HPLC-Messungen Tabelle 30: Übersicht über die angewendeten Wachstumsparameter bei den verschiedenen Testorganismen Tabelle 31: Tatsächliche Atrazin-Konzentrationen im Medium der verschiedenen Testreihen, berechnet nach der HPLC-Analyse der jeweiligen Stammlösungen Tabelle 32: Tatsächliche 2,4-D-Konzentrationen im Medium der verschiedenen Testreihen, berechnet nach der HPLC-Analyse der jeweiligen Stammlösungen XII

18 Tabellenverzeichnis Tabelle 33: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums Tabelle 34: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums Tabelle 35: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums Tabelle 36: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums Tabelle 37: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Erhöhung des O2-Gehaltes des Mediums Tabelle 38: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Erhöhung des O2-Gehaltes des Mediums Tabelle 39: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung Wachstum Tabelle 40: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung Wachstum Tabelle 41: Atrazin EC50- und EC10-Werte bezüglich Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 1-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten Tabelle 42: Atrazin EC50- und EC10-Werte bezüglich Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten Tabelle 43: Atrazin EC50- und EC10-Werte bezüglich Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten Tabelle 44: Übersicht über die Atrazin EC50-Werte der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten Tabelle 45: Übersicht über die Atrazin LOEC-Werte der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten Tabelle 46: Übersicht über die 2,4-D EC50-Werte der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten Tabelle 47: Übersicht über die 2,4-D LOEC-Werte der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten Tabelle 48: Vergleich der EC10- und LOEC/NOEC-Werte der Atrazin-Versuche bezüglich der Endpunkte Wachstum und Quantenausbeute Tabelle 49: Vergleich der EC10- und LOEC/NOEC-Werte der 2,4-D-Versuche bezüglich der Endpunkte Wachstum und Quantenausbeute Kapitel 7 Tabelle 50: Biomasse der eingesetzten Ceratophyllum-Testpflanzen zu Versuchsbeginn XIII

19 Tabellenverzeichnis Tabelle 51: Start- und Maxima-pH-Werte der L-Phasen 1-4 und die sich daraus ergebenden Parameter Delta ph, Photosyntheseleistung, (Photosynthese-) Hemmung und Delta Hemmung (A x -C x ) Tabelle 52: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Photosyntheseleistung Anhang Tabelle 53: Übersicht über die tatsächlichen Konzentrationen der Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D in den Belastungsstufen der verschiedenen Testreihen aus Kapitel Tabelle 54: Leitfähigkeitswerte der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 55: ph-werte der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 56: O 2 -Werte der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 57: Leitfähigkeitswerte der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 58: ph-werte der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 59: O 2 -Werte der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 60: Wachstumsparameter Anzahl Fronds und die entsprechende Wachstumsrate der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 61: Wachstumsparameter Frischgewicht und die entsprechende Wachstumsrate der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 62: Wachstumsparameter Sprosslänge und die entsprechende Wachstumsrate der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 63: Wachstumsparameter Wurzellänge und die entsprechende Wachstumsrate der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 64: Chlorophyll-Gehalt in den Medien der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 65: Wachstumsparameter Anzahl Fronds und die entsprechende Wachstumsrate der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 66: Wachstumsparameter Frischgewicht und die entsprechende Wachstumsrate der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 67: Wachstumsparameter Sprosslänge und die entsprechende Wachstumsrate der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 68: Wachstumsparameters Wurzellänge und die entsprechende Wachstumsrate der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 69: Chlorophyll-Gehalt in den Medien der 2,4-D-Versuche aus Kapitel Tabelle 70: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Quantenausbeute-Messungen der Atrazin-Versuche aus Kapitel Tabelle 71: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Quantenausbeute-Messungen der Atrazin-Versuche aus Kapitel XIV

20 Formelverzeichnis FORMELVERZEICHNIS Kapitel 3 Formel 1: Arithmetisches Mittel Formel 2: Variationskoeffizient Formel 3: Wachstumsrate (logarithmisch) Kapitel 5 Formel 4: Wachstumsrate (linear) Kapitel 6 Formel 5: Quantenausbeute Formel 6: Hemmung Kapitel 7 Formel 7: Photosyntheseleistung [%] Delta ph Formel 8: Photosynthesehemmung [%] Delta ph XV

21 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS C: Kontrolle (control) CAS-Nr.: Chemical Abstracts Service-Nummer d -1 : pro Tag DF: Verzögerte Fluoreszenz (Delayed Fluoreszenz) D-Phase: Dunkel-Phase EC: Effektkonzentration (Effect Concentration) ention.: entionisiert FG: filt.: HL: KOC: Leitf.: LOEC: Log P OW : L-Phase: ML: mod.: nc: NOEC: OECD: orig.: p.a.: PBSM: PEC: PGR: PNEC: PSII: REACH: SC: SL: WL: Frischgewicht filtriert Hohe Lichtintensität Verteilungskoeffizient zwischen dem organischen Kohlenstoff im Boden und Wasser Leitfähigkeit Lowest Observed Effect Concentration Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient Licht-Phase Mittlere Lichtintensität modifiziert nicht berechenbar (non calculable) No Observed Effect Concentration Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (Organisation for Economic Cooperation and Development) original pro analyse Pflanzenbehandlungs- und Schädlingsbekämpfungsmittel Erwartete Umweltkonzentration (Predicted Environmental Concentration) Plant Growth Regulator Predicted No Effect Concentration Photosystem II Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals Lösungsmittelkontrolle (solvent control) Sprosslänge Wurzellänge XVI

22 Abstract ABSTRACT The aim of this PhD thesis was the development of in vivo-biotests with submergent and emergent macrophytes for herbicide risk assessment. In the first chapter an overview is given with respect to macrophytes in an ecotoxicological context. In the second chapter the herbicides atrazine and 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D), the test organisms and the fluorescence techniques used in the following studies are described. In the chapters three to eight five studies are presented to make recommendations about test design, choice of the testorganisms and the application of the physiological endpoint photoinhibition. In the first study tests were conducted with the macrophytes Ceratophyllum demersum, Elodea nuttallii and Riccia fluitans to evaluate ideal nutrient and light conditions. Regarding the results of this study there is a general recommendation for biotests with macrophytes to use medium containing the for plant growth essential nutrients but only in low concentrations and medium light intensity about 5000 Lux. In the second study the growth of the macrophytes Mentha aquatica and Myriophyllum aquaticum were compared using different standard media: Chu-, Steinberg- and AAPmedium diluted with deionized water. There were no significant differences between the media regarding growth of the macrophytes. As delayed fluorescence measurements showed, in the Steinberg medium the least algae abundances were observed. Therefore diluted Steinberg medium (1:2) is recommended for biotests with macrophytes to decrease the probability of troublesome algae development in the medium. Third the impact of the selection of the test-organisms Mentha aquatica and Myriophyllum aquaticum after a pre-adaption phase was studied. For this test procedure the potential test-organisms were pulled out of the sediment after 3 days (Myriophyllum) or 5 days (Mentha) adaption time to the test conditions (sediment, medium, light, temperature). Only individuals with a first sign of roots were used as test-organisms. In each case a growth test was conducted with and without the described procedure. The results show that this procedure leads to reduced growth at higher variance of the macrophytes in comparison to the test organisms without a selection by root growth after a preadaption phase. In the fourth study 14 single-species tests were conducted with the 7 macrophytes Lemna gibba, Riccia fluitans, Salvinia natans, Mentha aquatica, Myriophyllum aquaticum, Ceratophyllum demersum and Vallisneria spiralis to study the environmental risk of atrazine and 2,4-D. On the one hand the sensitivity of the different macrophytes regarding growth inhibition was compared, on the other hand the application of quantum yield measurements by the Mini-PAM (Walz) and conductivity, ph and oxygen measurements of the media to determine effect concentrations (EC) were studied. The growth inhibition results show that the most sensitive macrophyte regarding atrazine was the 1

23 Abstract floating fern Salvinia natans with an EC50 of 16,6 µg/l, 13 time more sensitive than Lemna gibba with an EC50 of 221,8 µg/l. Regarding 2,4-D the water mint Mentha aquatica was the most sensitive macrophyte with a growth inhibition EC50 of 668,2 µg/l, 42 time more sensitive than Lemna gibba with an EC50 of µg/l. The quantum yield based effect concentrations of atrazine were in the same range as the growth based effect concentrations, actually in most cases slightly lower. The recording of the quantum yield by PAM-measurements leads in the case of atrazine to data with less variability than the growth parameters. In some cases (e.g. Ceratophyllum demersum) no effect concentrations could be calculated by growth parameters, while the quantum yield data lead in the case of atrazine for every macrophyte to EC50 and LOEC values (e.g. LOEC of Ceratophyllum demersum: 8,8 µg/l). Quantum yield measurements by the Mini-Pam had been proven to be a rapid and sensitive method to identify and to quantify photoinhibition caused by test-items. The study shows also, that the physical-chemical parameters conductivity, ph and oxygen content of the medium seem to be sensitive endpoints for metabolic processes in particular aquatic photosynthesis. Therefore a ph-measurement system was developed to record the ph of the medium of several beakers continuously over a larger time scale. The change of the ph in the medium during the light phase correlates with the photosynthetic activity of the aquatic macrophytes in the medium. The advantage of this ph-measurment system compared to the PAM technique is the photosynthesis measurement of submergent macrophytes without contact. In the fifth study the application of this ph-measurement system for herbicide risk assessment was demonstrated with Ceratophyllum demersum and atrazine. This method leads for Ceratophyllum demersum to an EC50 of 130,2 µg/l. 2

24 Einleitung 1 EINLEITUNG 1.1 HINTERGRUND In der heutigen Welt sind Chemikalien allgegenwärtig. Den Einfluss der Chemikalien auf die Umwelt zu untersuchen ist Ziel der Ökotoxikologie, einer relativ jungen, interdisziplinären Wissenschaft, die eine Schnittstelle aus Umweltchemie, Toxikologie und Ökologie bildet (FENT 2003). Das Risikopotential einer Substanz für die Umwelt wird u.a. anhand einer Reihe von Biotests nach dem Stellvertreterprinzip untersucht. Der Wasserfloh Daphnia magna repräsentiert z.b. aquatische Invertebraten. Höhere Wasserpflanzen werden bislang nur durch die einkeimblättrige, frei auf der Wasseroberfläche schwimmende Wasserlinse (Lemna spec.) vertreten. Da Zweifel bestehen, dass der Test mit Lemna (OECD 2002) in allen Fällen das Risikopotential einer Substanz bezüglich höheren Pflanzen ausreichend erfasst (DAVIES ET AL. 2003; KNAUER ET AL. 2006), sind zumindest bei bestimmten Substanzgruppen Tests mit zusätzlichen höheren Wasserpflanzen für eine seriöse Risikobewertung notwendig (VERVLIET-SCHEEBAUM ET AL. 2006). 1.2 ZIELSETZUNG Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neben Lemna Tests mit zusätzlichen Makrophyten für die Risikobewertung von Chemikalien, insbesondere Herbizide, zu entwickeln. Dabei sollte sowohl der taxonomischen Diversität von Wasserpflanzen als auch ihren Unterschieden bezüglich Lebensform Rechnung getragen werden. Neben dem Anspruch ein möglichst breites Spektrum an verschiedenen Makrophyten für eine Risikobewertung zur Verfügung zu stellen, war das zweite Ziel der Arbeit alternative Endpunkte bzw. Methoden zu den üblicherweise verwendeten Wachstumsparametern auf ihre Eignung für Biotests zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag dazu leisten, das Thema Makrophyten in der Ökotoxikologie einer breiten Öffentlichkeit zugänglich zu machen, indem sie die Grundlagen zu der Thematik vermittelt und im speziellen Teil zu alternativen Makrophyten-Bioassays hinführt, deren Etablierung die Risikobewertung insbesondere von Herbiziden sinnvoll ergänzen würde. 1.3 HERANGEHENSWEISE Die erste Phase der Dissertation konzentrierte sich auf Optimierungen des Testdesigns für verschiedene Wasserpflanzen, um eine möglichst reproduzierbare Testdurchführung im Labor zu gewährleisten. Stellvertretend für die Optimierungsversuche werden 3 Stu- 3

25 Einleitung dien vorgestellt, die zur Wahl des Testdesigns in Kapitel 6 maßgeblich beigetragen haben. In der ersten Studie (Kapitel 3) wurde das Wachstum der 3 Makrophyten Ceratophyllum demersum, Elodea nuttallii und Riccia fluitans quantifiziert. Die Phytoplanktonentwicklung in den Medien wurde per verzögerter Fluoreszenz bei verschiedenen Lichtintensitäten und unterschiedlich nährstoffreichem Teichwasser untersucht. In der zweiten Studie (Kapitel 4) wurde das Wachstum der beiden Amphiphyten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum und die Phytoplanktonentwicklung im Medium in den 3 Standardmedien Chu-, Steinberg- und AAP-Medium untersucht. In der dritten Studie (Kapitel 5) wurden für diese beiden Makrophyten untersucht, inwiefern sich eine Vorwurzelungsphase zur Selektion der Testorganismen, wie sie von MALTBY ET AL. (2010) für einen Myriophyllum-Test vorgeschlagen wird, auf die Ergebnisse des Tests auswirkt. In den Kapiteln 6 und 7 werden 2 Bioassays vorgestellt die auf verschiedene Weise Effekte auf den Photosyntheseapparat von höheren Wasserpflanzen detektieren und quantifizieren. Der Bioassay aus Kapitel 6 beruht auf der effektiven Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung, welcher über Puls Amplituden Modulierte (PAM)-Fluoreszenzmessungen erfasst werden kann. In dieser Studie wurde anhand von 2 Modellsubstanzen die Eignung der PAM-Technik mit den 7 verschiedenen Makrophyten Lemna gibba, Riccia fluitans, Salvinia natans, Mentha aquatica, Myriophyllum aquaticum, Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis überprüft. In 14 Einzelspeziestests wurde der Einfluss des Photosynthesehemmers Atrazin und des Auxinherbizids 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) auf die submersen und emersen Makrophyten sowohl bezüglich des Wachstums als auch bezüglich der Photosyntheseleistung untersucht. Neben dem Vergleich dieser beiden Endpunkte wurden auch die physikalisch-chemischen Parameter des Mediums Leitfähigkeit, ph-wert und Sauerstoffgehalt bestimmt, um über deren Entwicklung Aussagen zu metabolischen Prozessen treffen zu können. In Kapitel 7 wird ein Bioassay vorgestellt, welcher das Prinzip verfolgt, über Änderungen des ph-wertes des Mediums die Photosyntheseaktivität eines Testorganismus zu quantifizieren. Hierzu wurde ein eigens entwickeltes Delta-pH-Messsystem genutzt, welches über 3 Sonden kontinuierliche Messungen des ph-wertes mit hoher Genauigkeit über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Anhand der Modellsubstanz Atrazin und dem Modellorganismus Ceratophyllum demersum soll demonstriert werden, wie mit dieser Methode Photoinhibition erfasst und quantifiziert werden kann, ohne den Testorganismus zu berühren. Um dem Leser einen schnellen Einstieg in die Thematik zu ermöglichen, werden zunächst umweltchemische, ökotoxikologische und ökologische Grundlagen vorangestellt. Während zunächst Umweltchemikalien mit einem Fokus auf Herbizide aus ökotoxikologischer Sicht beleuchtet werden, folgt ein Überblick über die Risikobewertung von 4

26 Einleitung Stoffen als zentrale Aufgabe der Ökotoxikologie inklusive regulatorischer Aspekte. Im ökologischen Teil werden sowohl Anpassungen und Besonderheiten von Wasserpflanzen vorgestellt, u.a. die aquatische Photosynthese, als auch die Bedeutung von höheren Wasserpflanzen für die biotische und abiotische Umwelt aquatischer Ökosysteme. Auf den einleitenden Teil folgt ein allgemeiner Methodenteil (Kapitel 2), in dem die in dieser Arbeit verwendeten Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D, sowie die verwendeten Makrophyten vorgestellt werden und in dem die Theorie der in der Arbeit verwendeten Fluoreszenz-Messtechniken erklärt wird. 1.4 UMWELTCHEMISCHE GRUNDLAGEN UMWELTCHEMIKALIEN Chemikalien sind aus unserem heutigen Leben nicht mehr wegzudenken. Sie finden sich in Alltagsgeräten, Kleidung, Kosmetik und Nahrung wieder. Jährlich werden 400 Millionen Tonnen Chemikalien produziert. In der EU sind etwa verschiedene Stoffe registriert (KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN 2001). Die Belastungen auf Umwelt und Mensch, die mit dem massiven Einsatz von Chemikalien einhergehen, sind hinlänglich bekannt. Aber welche Chemikalie wie, wann und wo zu Schädigungen im Naturhaushalt führen wird, kann bislang nur in Einzelfällen zufrieden stellend beantwortet werden (siehe RÜHL 2003). Spätestens seit den Erfahrungen mit Asbest, DDT, Atrazin oder TBTs ist bekannt, dass eine anfänglich als unproblematisch für die Umwelt eingestufte Chemikalie sich später als schädlich herausstellen kann. Umweltchemikalien sind Stoffe, die durch menschliche Tätigkeit in die Umwelt gelangen oder als Folge menschlicher Tätigkeit in der Umwelt entstehen (SCHAEFER 1992). Der häufig synchron verwendete Begriff Xenobiotika beschränkt sich auf chemische Stoffe, die naturfremd sind (FENT 2003). Eine besondere Rolle bei den Umweltchemikalien spielen Pflanzenbehandlungs- und Schädlingsbekämpfungsmittel (PBSM). Allein in Deutschland werden jährlich ca Tonnen Wirkstoffe in den Verkehr gebracht (AKKAN ET AL. 2003) HERBIZIDE Einsatz Herbizide bilden mit einem Anteil von etwa 60% (DEUTSCHE FORSCHUNGS- GEMEINSCHAFT 1994) die bedeutsamste Klasse an Pflanzenschutzmitteln. Ihr Hauptzweck ist die Ertragssteigerung in der landwirtschaftlichen Produktion im Getreide-, 5

27 Einleitung Obst- und Gemüseanbau. Herbizide werden aber auch zur Unkrautbekämpfung in Städten und zur Freihaltung von Straßen, Eisenbahnschienen und Kanalufern eingesetzt. Die anzuwendenden Mengen an Herbiziden unterscheiden sich je nach Anbaupflanze, wobei die Wirksamkeit des Herbizideinsatzes auch vom Zeitpunkt der Applikation, den Feldbedingungen und der Ausbringungstechnik abhängig ist (FOBBE ET AL. 2006). Tabelle 1 zeigt den jährlichen Herbizideinsatz 14 (west-) europäischer Länder im Jahre 1999 auf, sowie die landwirtschaftliche Fläche bzw. den Flächenanteil des jeweiligen Landes, auf die Herbizide ausgetragen wurden. Im Jahre 1999 wurden alleine in Deutschland t aktive herbizide Wirksubstanz auf einer Gesamtfläche, die etwa 1/3 des Landes entspricht, ausgebracht (siehe Tabelle 1). Vor dem Hintergrund dieser Dimensionen und in Anbetracht der Tatsache, dass Herbizide, entsprechend ihrer Funktion, mindestens auf bestimmte Pflanzengruppen toxisch wirken, wird deutlich, wie wichtig eine aussagekräftige Risikobewertung über das Umweltgefährdungspotential von Herbiziden auch in Hinblick auf aquatische Makrophyten ist. Tabelle 1: Die Menge angewendeter Herbizide im Vergleich zur landwirtschaftlich genutzten Fläche von 14 Europäischen Ländern im Jahre Aus: FOBBE ET AL. (2006) nach EDS European Data Service, Federal Statistical Office, Germany (2004). Land Herbizide Landwirtschaftlich kultivierte Fläche [t/jahr] absolut [km 2 ] Anteil an der Gesamtfläche des Landes [%] Belgien 1.846, ,0 Dänemark 864, ,9 Deutschland , ,5 Griechenland 661, ,6 Spanien 5.439, ,2 Frankreich , ,4 Irland 280, ,5 Italien 4.594, ,3 Niederlande 1.595, ,6 Österreich 1.057, ,9 Portugal 1.273, ,3 Finnland 518, ,0 Schweden 611, ,8 Groß Britannien 5.763, ,6 6

28 Einleitung Wirkorte und Wirkmechanismen von Herbiziden Herbizide lassen sich nach Stoffklassen, nach Anwendungsgebiet, nach Art der Aufnahme in die Zielpflanze und nach Wirkmechanismen einteilen. Aus biologischer Sicht sind v.a. die beiden zuletzt genannten Punkte von Interesse. Je nach Art der Aufnahme kann sich die Bioverfügbarkeit eines Stoffes für einen bestimmten Organismus ändern. Grundsätzlich werden Bodenherbizide von Blattherbiziden unterschieden. Bei Bodenherbiziden findet die Aufnahme über die Wurzel statt. Damit das Mittel die gewünschte Wirkung erzielt, benötigt es eine gewisse Verweildauer im oberen Boden (AKKAN ET AL. 2003). Blattherbizide werden über oberirdische Teile der Pflanze aufgenommen. In der Pflanze zielen Herbizide auf vier Stoffwechselbereiche der Pflanzen: auf den Photosyntheseapparat; auf Biosyntheseprozesse; auf das Phytohormonsystem; auf Mechanismen der Zellteilung (SANDMANN & BÖGER 1995). Als Wirkort sind oft Chloroplasten das Ziel von Herbiziden. Sie sind der wichtigste Bestandteil des Blattparenchyms. Chloroplasten sind Ort der Photosynthese und gleichzeitig auch anaboler Stoffwechselprozesse, wie die Synthese von Aminosäuren, Fettsäuren, Pigmenten, Nukleinsäuren und Proteinen (HOCK ET AL. 1995). Entsprechend betreffen die Herbizid-Wirkungen in Chloroplasten verschiedene Funktionen: Das Elektronen-Transportsystem der Photosynthese durch Hemmung im Photosystem II oder durch Elektronenableitung am Photosystem I; die Synthese der Photosynthese-Pigmente; die Fettsäure-Synthese; Enzyme für Aminosäure-Synthesen. Mitosehemmer-Herbizide stören die Mikrotubuli-gesteuerten Prozesse (HOCK ET AL. 1995), die für die Mitose von zentraler Bedeutung sind. Zellteilungshemmer hemmen dagegen die DNA-Synthese. Beide Wirkmechanismen führen zu einer Wachstumshemmung der Pflanze. Mitose-Hemmer können ebenso wie Auxin-Herbizide zu morphologischen Veränderungen führen. Die Wirkungsweise von Auxin-Herbiziden wird in Kapitel näher erläutert. Ein anderer Wirkmechanismus von Herbiziden ist die direkte oder indirekte Schädigung der Membranen. Schließlich gibt es noch Herbizide, die die Ausbildung der Wachsschicht auf der Kutikula von Pflanzen hemmen und somit indirekt zu höheren Transpirationsraten führen. 7

29 Einleitung Eintragspfade in Gewässer Bei der gegenwärtigen landwirtschaftlichen Bewirtschaftungsweise gelangen von den eingesetzten Stoffen und ihren Abbauprodukten deutlich mehr Stoffe mit dem abfließenden Wasser oder über den Luftpfad in die Gewässer, als ökologisch und wasserwirtschaftlich vertretbar ist. (LAWA 1996) Herbizide gelangen auf unterschiedlichen Wegen in die Gewässer, wo sie (u.a.) auf Makrophyten einwirken können. Die wichtigsten Prozesse sind Abdrift bei der Ausbringung, Deposition nach Verflüchtigung, Abschwemmung (Run-off und Erosion) und Dränage. Dabei beeinflussen verschiedene Faktoren die unterschiedlichen Transportprozesse: Zum einen spielen die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz und die Witterungsbedingungen bei der Applikation eine wesentliche Rolle. Des Weiteren bestimmen die Bodeneigenschaften, die Pflanzenarten, sowie die gegebenen Standortverhältnisse das Ausmaß des Transportes der ausgebrachten Herbizide in Grund- und Oberflächenwasser. Der Verlust von Herbiziden auf dem Feld durch Run-off wird mit 1 bis 2%, in worst case-situationen bis zu 20%, angegeben (DEUTSCHE FORSCHUNGSGEMEIN- SCHAFT 1994). 1.5 ÖKOTOXIKOLOGISCHE GRUNDLAGEN DEFINITION ÖKOTOXIKOLOGIE Die Ökotoxikologie untersucht die Auswirkungen von Chemikalien auf die belebte Umwelt (FENT 2003). Als interdisziplinäre Wissenschaft umfasst sie Bereiche der Ökologie, Toxikologie und Umweltchemie. Ziel der Ökotoxikologie ist es, die ökotoxikologischen Wirkungen von Chemikalien zu verstehen, um ein Risikopotential für die Umwelt ableiten zu können RISIKOBEWERTUNG VON STOFFEN 15 Zulassung (1) Das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit läßt ein Pflanzenschutzmittel zu, wenn [ ] die Prüfung des Pflanzenschutzmittels ergibt, dass das Pflanzenschutzmittel nach dem Stande der wissenschaftlichen Erkenntnisse und der Technik [ ] keine sonstigen nicht vertretbaren Auswirkungen, insbesondere auf den 8

30 Einleitung Naturhaushalt sowie auf den Hormonhaushalt von Mensch und Tier, hat, [ ]. (Auszug aus dem PflSchG) Die Risikobewertung eines Pflanzenschutzmittels bezüglich möglicher Auswirkungen auf die Umwelt ist ein Prozess bestehend aus mehreren Schritten. In Abbildung 1 ist dieser Prozess schematisch dargestellt. Dabei werden Nutzen und Risiken der Substanz gegenüber gestellt. Das Risiko leitet sich von dem ökologischen Gefahrenpotential der Substanz ab, welches durch die ökotoxische Wirkung und voraussichtliche Exposition bestimmt wird. Die ökotoxische Wirkung eines Stoffes hängt von seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften, seiner biologischen Verfügbarkeit und Aktivität sowie seiner Dosis ab (FENT 2003). Die Dosis wird über die Exposition bestimmt, die sowohl die Konzentration der Substanz, als auch die Einwirkungsdauer auf den Organismus beinhaltet. Sie ergibt sich aus dem Vorkommen, der Verteilung und der Umwandlung der Substanz in der Umwelt und ihrer Bioverfügbarkeit. Um eine ökotoxikologische Risikobewertung einer Substanz durchführen zu können, werden daher Informationen sowohl zur voraussichtlichen Exposition und Bioverfügbarkeit einer Substanz (Expositionsabschätzung), als auch über ihre ökotoxikologischen Wirkungen auf die verschiedenen biologischen Ebenen (Effektabschätzung) benötigt. Expositions- und Effektabschätzung führen zur Abbildung 1: Umweltrisikobewertung als Teil der Pestizidentwicklung und des Registrierungsprozesses (aus: FAO 1989). 9

31 Einleitung Bestimmung der potentiellen Gefahr. Meist wird hier der worst case -Ansatz angewendet, der die höchsten Expositions-Werte mit den höchsten Toxizitätswerten kombiniert. Im nächsten Schritt wird die ökologische Signifikanz festgestellt, wobei folgende Aspekte bei der Beurteilung beachtet werden müssen: natürliche abiotische Schwankungen (Wettereinflüsse); natürliche biotische Schwankungen und Interaktionen; Erholungspotential von Populationen; die Seltenheit von Spezies; Interaktion mit anderen anthropogenen Einflüssen; Definition der Schutz-Ziele. Der nächste Schritt beinhaltet die abschließende Beurteilung des Risikos, welche zu Risiko-Management-Maßnahmen führen kann, um die Exposition zu verringern (z.b. Abstandsauflagen). Während die Gefahrenabschätzung (hazard assessment) nur das Potential an Umweltschädigung durch eine Substanz ermittelt, wird in der Risiko- Beurteilung die Wahrscheinlichkeit des schädigenden Ereignisses berücksichtigt. Das Umweltrisiko wird am Ende des Prozesses dem Nutzen unter ökologischen, ökonomischen und sozialen Aspekten, gegenübergestellt, um zu einer abschließenden Bewertung zu gelangen EXPOSITIONSABSCHÄTZUNG Für die Expositionsabschätzung (exposure assessment) werden Szenarien mit Hilfe von Computermodellen durchgerechnet, die sowohl die verschiedenen Aspekte der Ausbringung (Menge, Zeitpunkt, Häufigkeit, räumliche Verteilung, etc.) der Substanz berücksichtigen, als auch die Eigenschaften, die das Umweltverhalten der Substanz bestimmen. So wird eine voraussichtliche Umweltkonzentration abgeleitet, die sich in dem PEC-Wert (predicted environmental concentration) niederschlägt EFFEKTABSCHÄTZUNG Die Abschätzung der Ökotoxizität (effect assessment) eines Pflanzenschutzmittels erfolgt über ein mehrstufiges Prüfverfahren. Nach dem Stellvertreterprinzip werden Tests mit Organismen durchgeführt, die jeweils eine bestimmte biologische Gruppe oder trophische Ebene repräsentieren sollen. Der Wasserfloh Daphnia magna vertritt z.b. die aquatischen Invertebraten, die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) die aquatischen Vertebraten oder die Grünalge Scenedesmus subspicatus die aquatischen Primärproduzenten. 10

32 Einleitung Ökotoxikologische Tests sollten dabei folgende Kriterien erfüllen (DFG 1994): allgemein akzeptierte Prüfmethode; Standardisierbarkeit; generelle Anwendbarkeit auf verschiedene Klassen von Chemikalien; ausreichende Empfindlichkeit; Repräsentativität für eine Organismengruppe; Interpretierbarkeit; Eignung der Testergebnisse zur Vorhersage ökosystemarer Effekte; ökologische Relevanz der beobachteten Effekte; Kosteneffektivität. Die Ergebnisse dieser Tests sollen zu Dosis-Wirkungs-Beziehungen führen. Anhand dieser Daten lassen sich Effektkonzentrationen ableiten, die in der Gefahrenabschätzung (hazard assessment) Anwendung finden. Die wichtigsten Toxizitätsendpunkte sind in der Tabelle 2 aufgelistet. Bei den Tests wird unterschieden zwischen akuten und chronischen Tests sowie komplexen, höher stufigen Tests (higher tier studies) (siehe Abbildung 2). Akute und chronische Tests untersuchen die kurzfristige (akute) Toxizität bzw. Langzeitschäden (chronisch) von Substanzen auf einzelne Organismen, während die höher stufigen Tests mehrere Organismengruppen verschiedener trophischer Ebenen beinhalten. So können auch Sekundäreffekte durch Veränderungen im Nahrungsnetz eines Ökosystems aufgespürt werden. Tabelle 2: Toxizitätsendpunkte. Toxizitätsendpunkt Bedeutung LC50 Lethal concentration Konzentration bei der 50% der Testorganismen tot sind EC50 Effect concentration 50 Konzentration bei der 50% der Testorganismen tot sind LOEC NOEC Lowest observed effect concentration No observed effect concentration Niedrigste Konzentration, bei der noch ein signifikanter Effekt festgestellt werden konnte Höchste Konzentration, bei der kein signifikanter Effekt mehr festgestellt werden konnte GEFAHREN- & RISIKOBEWERTUNG Die Gefahrenabschätzung integriert die Expositionsabschätzung und die Effektabschätzung. Bezüglich der Empfindlichkeit von Organismen gegenüber Stressoren bestehen große Unterschiede sowohl innerhalb der Art (Entwicklungsstadium, Geschlecht, ökomorphologische und/oder genetische Adaption etc.) als auch zwischen den Arten. 11

33 Einleitung Abbildung 2: Testvoraussetzungen für aktive Substanzen (aus: EC 2002). 12

34 Einleitung Zudem beinhaltet die Extrapolation von zumeist Einzelspeziestests im Labor auf Populations- oder sogar Ökosystemebene im Freiland eine Reihe an Unsicherheiten (vergleiche FORBES ET AL. 2008). Die begrenzte Anzahl verschiedener ökotoxikologischer Tests kann nicht alle Wirkungsmöglichkeiten aufzeigen, wie z.b. Wirkungen auf das endokrine System, sodass das Wissen über die Ökotoxizität einer Substanz immer unvollständig bleibt (AHLERS ET AL. 2001). Um diesem Umstand Rechnung zu tragen, werden Sicherheitsfaktoren bei der Risikobewertung hinzugezogen. Für Umweltchemikalien wird der PNEC (Predicted No Effect Concentration) berechnet, also die Konzentration, die keine ökotoxikologischen Effekte hervor ruft, indem die niedrigste Wirkkonzentration durch einen Sicherheitsfaktor geteilt wird. Das Ergebnis darf für eine Zulassung den PEC-Wert, also die zu erwartende Umweltkonzentration, nicht überschreiten. Die Höhe des Sicherheitsfaktors ist abhängig von der Datengrundlage ökotoxikologischer Tests. Analog muss bei der Zulassung eines Pflanzenschutzmittels das Verhältnis von Ökotoxizität zu Exposition einen Trigger-Wert, der sogenannte TER-Wert (Toxicity- Exposure-Ratio), überschreiten, der dem Sicherheitsfaktor entspricht. Akute Tests erhalten einen TER-Wert von 100, chronische Tests einen TER-Wert von 10 und höher stufige Studien (z.b. Mesokosmos-Studien) einen TER-Wert, der je nach Qualität und Aussagekraft der Studie bis auf 1 herabgesenkt werden kann (vergleiche Abbildung 2) GESETZLICHE GRUNDLAGEN FÜR DIE ZULASSUNG VON CHEMIKALIEN Mit REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals) ist am 1. Juni 2007 ein neues, europaweit geltendes Chemikalienrecht in Kraft getreten. Zuvor bildete in der EU die EG-Richtlinie 79/831/EWG die Grundlage zur ökotoxikologischen Bewertung von Chemikalien, die den Rahmen des 1982 in Kraft getretenen deutschen Chemikaliengesetzes darstellte. Während vor REACH die chemische Industrie nur für so genannte Neustoffe, also Stoffe, die nach 1981 auf den Markt gekommen sind, toxikologische und ökotoxikologische Daten erheben musste, ist sie jetzt verpflichtet auch für die etwa Altstoffe Daten zu den Stoffeigenschaften (physikalische Eigenschaften, Giftigkeit, Verhalten in der Umwelt etc.) zu liefern (BUNDESANSTALT ARBEITSSCHUTZ UND ARBEITSMEDIZIN 2008). FÜR GESETZLICHE GRUNDLAGEN FÜR DIE ZULASSUNG VON PFLANZENSCHUTZMITTELN Die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln wird in der EU über die Richtlinie 91/414/EEC (EU 1991) und 97/57/EC (EC 1997) geregelt. Die deutsche Umsetzung findet sich im Pflanzenschutzgesetz (PflSchG) wieder. Beim Zulassungsprozess sind mehrere Behörden involviert (siehe Abbildung 3), wobei in Deutschland das Bundesamt 13

35 Einleitung für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) die Zulassungsbehörde für Pflanzenschutzmittel ist. Einvernehmensbehörde ( Vetorecht ) Benehmensbehörden (kein Vetorecht ) Umweltbundesamt (UBA) Auswirkungen auf den Naturhaushalt Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) Wirksamkeit Bundesamt für Risikobewertung (BfR) Auswirkungen auf die Gesundheit Fachliche Bewertung Anhörung Sachverständigenausschuss (SVA) Empfehlung Zulassungsbehörde Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) Phys.-chem. Eigenschaften Koordination & Risikomanagment Bescheid (Zulassung für 10 Jahre oder Keine Zulassung) Abbildung 3: Zulassungsverfahren für Pflanzenschutzmittel in Deutschland (nach WOGRAM 2005) MAKROPHYTEN IN DER RISIKOBEWERTUNG Obwohl Pflanzengemeinschaften bezüglich der Biomasse die Fauna eines Biotops in der Regel um das Ein- bis Dreitausendfache übertreffen (FRÄNZLE 1999), spielt der Einsatz von Biotests mit höheren Pflanzen in den meisten ökotoxikologischen Untersuchungen im aquatischen Bereich bisher nur eine untergeordnete Rolle (PICKL ET AL. 1999). Lange Zeit wurden die Primärproduzenten nur durch Algentests vertreten, obwohl ein Vergleich von Herbiziden bei Algen und Gefäßpflanzen ergab, dass ca. 50% der Chemikalien, die bei Gefäßpflanzen eine Wirkung hervorriefen, bei Algen keinerlei Wirkungen zeigten (FOMIN ET AL. 2003). Mittlerweile ist in dem für die Regulatorik herangezogenen Guidance Document on Aquatic Ecotoxicology (EC 2002) der Makrophytentest mit Lemna spec., festgeschrieben. Aktuell werden 2 verschiedene Biotests mit Myriophyllum mit (MALTBY ET AL. 2010) und ohne Sediment (MALETZKI & BEULSHAUSEN 2009) für die Risikobewertung von Herbiziden diskutiert. Außerdem wurde von einer Expertengruppe aktuell ein Entscheidungsschema vorgestellt (siehe Abbildung 4), in welchen Fällen zusätzliche Makrophytentests für die Risikobewertung von Herbiziden herangezogen werden sollten (ARTS ET AL. 2010). Da Unterschiede in den Sensitivitäten unterschiedlicher Makrophyten und unterschiedlicher Endpunkte ge- 14

36 Einleitung genüber Pestiziden in einem Bereich liegen (ARTS ET AL. 2008), ist ein breites Spektrum an Makrophyten-Testorganismen nötig, um eine sichere Risikobewertung eines Stoffes vornehmen zu können. Auch wenn einige Veröffentlichungen anführen, Tests mit Algen und Lemna seien i.d.r. ausreichend protektiv, um das phytotoxische Potential auf Nichtziel-Organismen zu erfassen, sollte zumindest bei bestimmten Wirkmechanismen, wie von Auxin-Herbiziden, auf zusätzliche Makrophyten als Testorganismen zurück gegriffen werden (VERVLIET-SCHEEBAUM ET AL. 2006). Abbildung 4: Vorschlag für ein Entscheidungsschema, ob zusätzliche Makrophytentests bei der Risikobewertung von Herbiziden durchgeführt werden müssen (modifiziert nach MALTBY ET AL Quelle: ARTS ET AL. 2010). 15

37 Einleitung 1.6 ÖKOLOGISCHE GRUNDLAGEN DEFINITION MAKROPHYTEN Pflanzliche Lebensgemeinschaften (Phytozönosen) der Gewässer setzen sich aus Mikrophyten und Makrophyten zusammen. Während Mikrophyten mikroskopisch kleine Algen, Pilze und Wasserflechten umfassen (POTT & REMY 2000), gehören zu den Makrophyten sowohl speziell an das Wasser angepasste Gefäßpflanzen (Phanerogamen) und Moose (Bryophyta) als auch große sessile Algen (Rhodophyta, Charophyta, Chlorophyta, Lichenes), die zumindest teilweise Submersformen ausbilden (VAN DE WEYER 1999). Im weiteren Sinne umfasst der Begriff Makrophyten Hydrophyten (aquatische Wasserpflanzen), Amphiphyten (amphibische Wasserpflanzen) und Helophyten (Sumpfpflanzen bzw. Röhrichtpflanzen) (POTT & REMY 2000). Morphologisch lassen sich folgende Wuchsformen unterscheiden (nach LUA 2006): Rhizophyten (im Sediment wurzelnde Pflanzen); o Helophyten (Sumpfpflanzen); o Hydrophyten (Wasserpflanzen); Pleustophyten (Wasserschweber); Haptophyten (Haftpflanzen: Moose, Rot- und Grünalgen, Flechten) ANPASSUNGEN VON WASSERPFLANZEN Im Gegensatz zu Algen haben alle anderen Pflanzen die Gewässer im Laufe der Evolution erst wieder sekundär erschlossen (POTT & REMY 2000). Hierzu haben sie einige anatomische, ökomorphologische und ökophysiologische Anpassungen an den Lebensraum Wasser erworben. Morphologische Anpassungen an den Lebensraum Wasser Während Landpflanzen gegen die Schwerkraft wachsen und entsprechend feste Stängel benötigen, können Hydrophyten auf ein Festigungsgewebe weitgehend verzichten, da sie etwa die gleiche Dichte wie Wasser aufweisen (LUDWIG 2003). Dadurch gewinnen sie an Elastizität und zerbrechen nicht so leicht durch Wasserbewegung (siehe BREWER & PARKER 1990). Um diese Elastizität zu verstärken, weisen aquatische Makrophyten häufig eine spezielle zentrale Anordnung der Leitbündel auf. Das Xylem ist oft reduziert oder kann, wie bei dem Zarten Hornblatt (Ceratophyllum submersum), sogar ganz fehlen (POTT & REMY 2000). In Fließgewässern können die peripheren Faserbündel, wie bei dem Schwimmenden Laichkraut (Potamogeton natans), verstärkt werden (POTT & REMY 2000) oder es bildet sich, wie beim Quellmoos (Fontinalis antipryretica), eine 16

38 Einleitung besonders reißfeste Epidermis aus (BIEHLE ET AL. 1998). Die Unterwasserblätter sind oft fein zerteilt (z.b. Myriophyllum spicatum) oder linealisch schmal (z.b. Potamogeton pectinatus), um einerseits der Strömung weniger Angriffsfläche zu liefern, andererseits bei gleicher Biomasse eine größere Oberfläche für die Nährstoffaufnahme und den Gasaustausch zu gewinnen. Eine Differenzierung in Schwamm- und Palisadenparenchym fehlt häufig in submersen Blättern (POTT & REMY 2000), sodass die dünnwandige Epidermis das Haupt- Photosynthese-Gewebe darstellt (RONZHINA & P`YANKO 2001). Im Vergleich zu terrestrischen Pflanzen ist bei submersen Blättern die Chloroplastendichte geringer und die Mesophyllzellen sind größer. Diese Eigenschaften rücken submerse Wasserpflanzen bezüglich ihres Photosyntheseapparates zu den Schattenpflanzen (RONZHINA & P`YANKO 2001). So sind aquatische Systeme auch eine schattige Umwelt für ihre Bewohner: Licht, das auf die Wasseroberfläche fällt, wird reflektiert, gestreut und sowohl vom Wasser als auch von den darin enthaltenden Partikeln und Pigmenten absorbiert (SAND-JENSEN 1989). Dabei ist zu beachten, dass das Licht in Abhängigkeit von der Wellenlänge unterschiedlich stark im Wasser absorbiert und reflektiert wird, sodass der rote Spektralbereich (605 bis 710 nm) in den obersten 10 bis 20 cm weitgehend absorbiert wird (POTT & REMY 2000). Während bei terrestrischen Pflanzen der Gasaustausch über Spaltöffnungen (Stomata) reguliert wird, weisen Schwimmblätter Spaltöffnungen nur auf der Blattoberseite auf. Bei submersen Blättern fehlen diese ganz oder sind in ihrer Ausbildung stark reduziert (STEUBING & SCHWANTES 1992). Um den Diffusionsweg von CO 2 möglichst gering zu halten, sind die Chloroplasten der meist dünnwandigen Epidermiszellen entsprechend peripher angeordnet (POTT & REMY 2000). Die Anforderungen an die Blätter sind grundlegend verschieden, je nachdem ob das Blatt sich unter oder über Wasser befindet oder ob es auf der Wasseroberfläche schwimmt. Daher ist bei Wasserpflanzen das Phänomen der Heterophyllie weit verbreitet (MINORSKY 2003, WELLS & PIGLIUCCI 2000). Diese kann genetisch sein, wie beim Schwimmfarn (Salvinia natans). Hier entwickeln sich unabhängig von äußeren Einflüssen verschiedene Blattausprägungen, die unterschiedliche Funktionen aufweisen (Schwimmblätter; wurzelähnliche Blattmorphosen zur Nährstoffaufnahme). Eine modifikatorische Heterophyllie liegt vor, wenn die verschiedenen Blattausprägungen durch exogene Umwelteinflüsse induziert werden: In der Regel unterscheiden sich submerse Blätter von den emersen Blättern oder sogar Schwimmblättern bei der gleichen Pflanze. Die Übergänge können dabei fließend oder klar voneinander getrennt sein. Die Abbildung 5 zeigt beispielhaft drei Blätter eines Individuums der Wasserpflanze Proserpinaca palustris vom Übergang submers zu emers. Eine modifikatorische Heterophyllie tritt z.b. bei der Papageienfeder (Myriophyllum aquaticum) und dem Gewöhnlichen Wasserhahnenfuß (Ranunculus aquatilis) auf. 17

39 Einleitung Abbildung 5: Drei Blätter von einem Individuum von Proserpinaca palustris. Von links nach rechts repräsentieren die Blätter den Übergang submerser zu emersen Blättern. Aus: WELLS & PIGLIUCCI Internodienstreckung bei Überflutung Semiaquatische Pflanzen zeigen bei Überflutung oft ein verstärktes Sprosslängenwachstum. Untergetauchter Reis (Oryza sativa) z.b. weist Wachstumsraten von 20 bis 25 cm/tag auf (KENDE ET AL. 1998). Das durch Internodienstreckung verursachte Sprosswachstum beruht auf gesteigerter Zellteilung und gesteigerter Zellstreckung und wird induziert durch ein Zusammenspiel der Phytohormone Ethylen, Auxin, Gibberellin und Abscisinsäure, wobei Ethylen hier eine Schlüsselrolle spielt (VOESENEK ET AL. 2004). Während von Landpflanzen produziertes Ethylen, ein einfaches Kohlenwasserstoffgas, schnell in die Atmosphäre diffundiert, reichert es sich in untergetauchten Pflanzen aufgrund der stark eingeschränkten Diffusion an. Ab einer bestimmten endogenen Ethylenkonzentration wird ein super-growth -Ereignis induziert und die Pflanze schießt in die Höhe, um die Wasseroberfläche zu durchbrechen (OSBORNE 1984). Eine verringerte O 2 - und eine erhöhte CO 2 -Konzentration in der Pflanze verstärken diesen Effekt (KENDE ET AL. 1998; RASKIN & KENDE 1984). Nährstoffaufnahme Die Nährstoffaufnahme bei Wasserpflanzen erfolgt je nach Art und Standort zu unterschiedlichen Anteilen über Blätter, Spross und/oder die Wurzel. Eine reduzierte Cuticula begünstigt dabei die Aufnahme von Nährstoffen über Blätter und Spross, begünstigt aber auch entsprechend die Aufnahme von Xenobiotika und macht die Pflanze empfindlich gegenüber Austrocknung. Die Cuticula von Potamogeton lucens z.b. ist um etwa 18

40 Einleitung drei Zehnerpotenzen permeabler als die von terrestrischen Blütenpflanzen (MADSEN 1984 nach SCHÖNHERR 1976). Viele Wasserpflanzen besitzen dazu drüsenartige Differenzierungen der Epidermis, sogenannte Hydropoten. Hier weist die Cuticula siebartige Verdünnungen auf, die das Passieren von Stoffen erleichtern (GESSNER & VOLZ 1951). Hydropoten sollen der aktiven Aufnahme von Nährstoffen sowie der aktiven Sekretion von Stoffwechselprodukten und dem Wasseraustausch dienen (POTT & REMY 2000 nach GUTTENBERG 1952; NATHO ET AL. 1990). Studien haben gezeigt, dass submerse, im Sediment wurzelnde Makrophyten ihre Nährstoffversorgung aus dem Sediment ausreichend beziehen können (BARKO & SMART 1981). So können submerse Makrophyten trotz eines geringen Nährstoffgehalts des Wassers hohe Wachstumsraten aufweisen. Während Stickstoff oft auch in der Wasserphase verfügbar ist und über diese aufgenommen wird (PEDERSEN & SAND-JENSEN 1993), stellt für Phosphor und Spurenelemente i.d.r. Sediment die Hauptquelle dar (HOWARD-WILLIAMS & ALLANSON 1981; PEDERSEN & SAND-JENSEN 1993). Die Wurzeln von Wasserpflanzen haben neben der Nährstoffaufnahme auch eine wichtige Verankerungs- und Speicherfunktion. Da aber auch die Nährstoffaufnahme über die Wurzel durch die oberirdischen Kompartimente der Pflanze kompensiert werden kann, haben einige Pflanzen im Laufe der Evolution ihre Wurzeln zurück entwickelt. Dies ist sowohl bei frei schwimmenden Arten wie Lemna als auch bei submersen Arten wie Ceratophyllum demersum anzutreffen. Eine weitere häufig bei Wasserpflanzen auftretende Anpassung der Wurzeln sind Rhizome. Neben der Funktion der vegetativen Vermehrung und als Speicherorgan besitzen Rhizome von Makrophyten auch eine höhere Toleranz gegenüber Sauerstoffarmut als ihre Wurzeln (POTT & REMY 2000 nach BRAENDLE & CRAWFORD 1987). Gasaustauschsystem Da submerse Blätter keine (funktionsfähigen) Spaltöffnungen besitzen und die Diffusion in Wasser im Gegensatz zu der Diffusion in Luft sehr langsam abläuft, dienen Durchlüftungsgewebe, sogenannte Aerenchyme (siehe Abbildung 6), Wasser- und Sumpfpflanzen als Transport- und Speicherraum für Produkte des Gasstoffwechsels. Wurzeln können so mit Sauerstoff versorgt werden, während CO 2 aus dem Wurzelraum zu den Blättern geleitet werden kann. Da der Sauerstoff teilweise bis über 4 m von den Schwimmblättern durch die Stängel bis zu den Rhizomen zurücklegen muss, haben Wasserpflanzen ein Druck- Ventilations-System entwickelt, welches effektiver als reine Diffusion ist (GROßE 1996). Dieses basiert auf einem Temperaturgradienten entlang des Aerenchyms, welcher die Luft in den vom Sonnenlicht erwärmten Blättern von der kühleren Umgebungsluft trennt und auf Unterschiede in der Luftfeuchtigkeit. Die daraus resultierende hygrometrische Diffusion (nach DUFOUR 1875) und die thermale Transpiration (nach FEDDERSEN 1873) führen zu einem Druckaufbau, der in den 19

41 Einleitung Abbildung 6: Querschnitt durch einen Egeria densa- Stängel mit Aerenchym. Wasserpflanzen zu einem Konvektions-Gasdurchfluss führt (GROßE 1996; GROßE ET AL. 1996). Durch dieses thermo-osmotische Ventilationssystem wurde eine Erhöhung des Gastransportes bei der Indischen Lotusblume (Nelumbo nucifera) von 935% bei einer Temperaturdifferenz von 2,9 ± 1 C gemessen (MEVI-SCHUTZ & GROßE 2006). Außerdem werden über das Aerenchymsystem toxische Produkte wie Ethanol ausgeschieden, die unter Sauerstoffmangel gebildet werden (POTT & REMY 2000; siehe Abbildung 7). Abbildung 7: Schema des Gasaustauschs im Basalbereich leicht überstauter Helophyten unter besonderer Berücksichtigung der Abgabe gasförmiger, toxischer Stoffwechselprodukte (nach LARCHER 1994). Aus: POTT & REMY

42 Einleitung Toxine, die im Boden von anaeroben Bakterien gebildet werden, werden durch Sauerstoffdiffusion aus Wurzeln mit Aerenchymen oxidiert und unschädlich gemacht (JACKSON 1985). Über die Aerenchyme diffundiert auch Methan aus dem Sediment in die Pflanze, welches über die Blätter wieder abgegeben wird (GARNET ET AL. 2005). Dabei zeigen die Methanemissionen einen starken tageszeitlichen Verlauf (WHITING & CHANTON 1996). Zusätzlich verleihen Aerenchyme Wasserpflanzen und insbesondere ihren Schwimmblättern den nötigen Auftrieb. Fortpflanzung Die Fortpflanzung von Wasserpflanzen erfolgt oft vegetativ. Obwohl von wenigen Ausnahmen abgesehen auch alle Makrophyten zur generativen Fortpflanzung fähig sind, ist v.a. bei submersen Pflanzen die Verbreitung über Samen von untergeordneter Bedeutung (POTT & REMY 2000 nach SCULTHORPE 1967). Viele Makrophyten zeichnen sich durch eine immense Regenerationsfähigkeit aus. Einige Arten wie Myriophyllum spicatum vermögen aus einzelnen Bruchstücken (siehe Abbildung 8) wieder eigenständige Individuen zu entwickeln. Diese Fähigkeit resultiert einerseits als Anpassung auf Störungen (z.b. Überflutung), die die Pflanzen beschädigen, andererseits ist sie auch eine Strategie zur vegetativen Vermehrung und Kolonisierung (BARRAT- SEGRETAIN ET AL. 1998). Abbildung 8: Fragmente von Myriophyllum spicatum mit Wurzelneubildungen. Anpassungen an Herbivorie Obwohl viele aquatische Herbivoren sich auf Periphyton beschränken (CARPENTER & LODGE 1986), werden auch Wasserpflanzen von Herbivoren aufgesucht. Dabei werden 21

43 Einleitung die Wasserpflanzen in ihrem Bestand nicht nur durch den Konsum, sondern auch einfach durch Beschädigung durch Herbivoren reduziert (LODGE 1991). Wie terrestrische Pflanzen verfügen auch Wasserpflanzen über verschiedene Strategien um Herbivorie einzuschränken bzw. auf sie zu reagieren. Je nach Spezies können chemische oder morphologische Änderungen bei Makrophyten durch Herbivorie induziert werden (LEMOINE ET AL. 2009). So wurde z.b. bei dem Ährigen Tausendblatt (Myriophyllum spicatum) eine Erhöhung der Konzentration phenolischer Verbindungen bei durch Herbivorie beschädigten Pflanzen festgestellt (LEMOINE ET AL. 2009). Einige Arten, wie die Orchidee Habenaria repens oder Brunnenkresse (Nasturtium spec.), verfügen über spezielle pflanzliche Sekundärstoffe, die Herbivorie unterdrücken (BOLSER ET AL. 1998). Die beiden algiziden Verbindungen 4-Methylthio-1,2-dithiolane und 5-Hydroxy-1,2,3-trithiane, die in der Armleuchteralge Chara globularis nachgewiesen wurden, werden so auch mit herbizider und insektizider Wirkung in Verbindung gebracht (BERGER & SCHAGERL 2004). Das weit verbreitete Rohrglanzgras (Phalaris arundinacea) z.b. verfügt über mindestens 8 Alkaloide und ist verantwortlich für eine Reihe von Vergiftungen von Weidevieh (CHEEKE 1995). Die Wurzeln von Helophyten, die im wassergesättigten, anaeroben Boden eine aerobe Nische für Mikroorganismen und kleine Tiere bilden, würden von diesen schnell konsumiert werden (was sie nach dem Absterben der Pflanze auch werden) (NEORI ET AL nach VERHOEVEN 1986). Daher enthalten die Wurzeln oft biochemisch aktive Substanzen, die den Fraß durch Schädlinge verhindern bzw. herabsetzen oder die Wurzeln geben Exsudate in die Rhizosphäre ab, die auf andere Organismen in vielfältiger Weise wirken (NEORI ET AL. 2000). So produzieren die typischen Röhrichtarten Simse (Scirpus spec.), Rohrkolben (Typha spec.) und Schilf (Phragmites spec.) bislang noch unidentifizierte Fungizide, Bakterizide und Larvizide (NEORI ET AL nach LAKSMAN 1987). Die Wurzeln einiger Sumpfpflanzen werden daher auch aufgrund ihres Wirkstoffkomplexes traditionell medizinisch angewendet, wie z.b. die Wurzeln von Kalmus (Acorus calamus), dessen Extrakt stark als Fungizid und Bakterizid wirkt (DEVI & GANJEWALA 2009) und das Wachstum von juvenilen Insekten unterdrückt (SAXENA ET AL. 1977; KOUL ET AL. 1990). Ein Beispiel für morphologische Anpassungen an Herbivorie ist die zunehmende Fragmentierung bei der Kanadischen Wasserpest (Elodea canadensis), die durch Herbivorie induziert wird, die (wie oben beschrieben) mit einer verstärkten vegetativen Vermehrung einhergeht (LEMOINE ET AL. 2009). Allelopathie Es ist bekannt, dass auch Wasserpflanzen im Wettstreit um die Ressourcen auf allelopathische Verbindungen zurückgreifen, um biochemisch potentielle Konkurrenten in ihrem Wachstum zu unterdrücken (ERVIN & WETZEL 2003). So sind z.b. allelopathische 22

44 Einleitung Wirkmechanismen bei Armleuchteralgen (Chara spec.) (VAN DONK & VAN DE BUND 2002; BERGER & SCHAGERL 2004), Raues Hornblatt (Ceratophyllum demersum) (WIUM-ANDERSEN 1987) und Ähriges Tausendblatt (Myriophyllum spicatum) (GROSS ET AL. 1996; GROSS & SÜTFELD 1994) bekannt, die sich gegen Algen richten. Obwohl epiphytische Algen das primäre Ziel allelopathischer Verbindungen von Makrophyten sein sollten, scheinen sie generell weniger sensitiv zu sein als Phytoplankton (HILT & GROSS 2008; HILT 2006). Allelopathische Effekte können sich aber auch gegen höhere Pflanzen richten. So wird z.b. das hohe Invasionspotential des Neophyten Typha angustifolia in nordamerikanischen Feuchtgebieten auf seine starken allelopathischen Effekte auf Konkurrenten (in der zitierten Studie Bolboschoenus fluviatilis) zurückgeführt (JARCHOW & COOK 2009). Dabei wird die Konzentration der allelopathischen Verbindungen, die die Pflanze produziert, auch durch externe Faktoren wie z.b. Nährstoffverfügbarkeit oder Licht beeinflusst (ERVIN & WETZEL 2003). Das Wissen zum Thema Allelopathie bei Wasserpflanzen ist zurzeit allerdings noch sehr fragmentarisch und vieles bezüglich ökologischer Bedeutung, Identität der Wirkstoffe und Faktoren, die ihre Produktion beeinflussen, liegt noch im Unklaren (ERVIN & WETZEL 2003; GOPAL & GOEL 1993; HILT & GROSS 2008) AQUATISCHE PHOTOSYNTHESE Bedeutung aquatischer Photosynthese Die Photosynthese ist die biochemische Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie in Form von organischen Kohlenstoffverbindungen. Sie bildet die Grundlage für das Leben auf der Erde, denn ohne die ständige Zufuhr von Sonnenenergie, die von den Chloroplasten [ ] eukaryotischer Zellen aufgenommen und umgewandelt wird, würden alle Lebensprozesse auf der Erde allmählich immer langsamer werden und schließlich gemäß dem zweiten Hauptsatz der Thermodynamik ganz zum Stillstand kommen. (RAVEN ET AL. 2006). Weniger physikalisch ausgedrückt: Durch Photosynthese wird von den Primärproduzenten Energie für Organismen verfügbar gemacht und in die Nahrungskette eingebracht und bildet somit den Motor für alle biologischen und biochemischen Prozesse. Vor über zwei Milliarden Jahren wurde durch die Photosynthese aquatischer Organismen die Zusammensetzung der Atmosphäre und damit die Lebensbedingungen auf der Erde grundlegend verändert, indem Sauerstoff freigesetzt und angereichert wurde. Etwa 45% der Photosynthese auf der Erde findet heute in aquatischen Systemen statt, obwohl dort weniger als 1% der photosynthetischen Biomasse zu verorten ist (FALKOWSKI & RAVEN 2007). 23

45 Einleitung Anorganischer Kohlenstoff im Wasser Zentraler Bestandteil der Photosynthese ist die Fixierung und Reduzierung von anorganischem Kohlenstoff die Grundlage zum Aufbau von organischen Kohlenstoffverbindungen. Etwa 95% des NADPH und mehr als 60% des ATP, das photosynthetisch gebildet wird, wird hierfür genutzt (FALKOWSKI & RAVEN 2007). Das für die Kohlenstofffixierung verantwortliche Enzym RuBisCO (Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/- Oxygenase) kann nur CO 2 als Substrat nutzen, welches von Landpflanzen über Stomata aus der Atmosphäre aufgenommen wird. In Wasser gelöstes CO 2 reagiert allerdings zu einem bestimmten Prozentsatz in Abhängigkeit vom ph-wert mit H 2 O zu H 2 CO 3. Als zweiprotonige Säure gibt sie ihre Protonen in zwei Dissoziationsstufen ab, unter Bildung von Hydrogencarbonat (HCO - 3 ) und dem Carbonat-Ion (CO 2-3 ) als Anionen. Folgende Formel gibt diesen Zusammenhang wieder: H 2 O + CO 2 H 2 CO 3 H + + HCO 3-2H + + CO 3 2- Die Gleichgewichte verschieben sich in dieser Formel nach links bei niedrigem ph- Wert und nach rechts bei hohem ph-wert (siehe Abbildung 9). Demnach liegen Hydrogencarbonatkonzentrationen in limnischen Gewässern zwischen der Hälfte und dem 100fachen der Konzentration an freiem CO 2 und etwa dem 50fachen in marinen Gewässern (BOSTON ET AL. 1989). Entscheidend für die Konfiguration von CO 2 in der wässrigen Phase ist neben dem ph- Wert auch die Konzentration von Calciumcarbonat im Wasser. In carbonatreichen Gewässern wird überschüssiges CO 2 unter der Bildung von Calciumbicarbonat Abbildung 9: Verteilung der 3 anorganischen Kohlenstoffspeziierungen in wässriger Lösung in Abhängigkeit vom ph-wert (Quelle: FALKOWSKI & RAVEN 2007). 24

46 Einleitung (Ca(HCO 3 ) 2 ) gebunden, während in sauren calciumcarbonatarmen Gewässern fast nur freie Kohlensäure zur Verfügung steht (POTT & REMY 2000). Die im Calciumbicarbonat gebundene Kohlensäure stellt eine wichtige CO 2 -Reserve für die Photosynthese aquatischer Organismen dar, weil Ca(HCO 3 ) 2 nur solange in Lösung bleibt, wie auch überschüssiges CO 2 im Wasser vorhanden ist (SCHWOERBEL 1999). Da CO 2 nur relativ langsam im Wasser nachdiffundiert (Diffusion in Wasser läuft etwa mal langsamer ab als in Luft (PRINS & ELZENGA 1989)), stellt CO 2 einen Konkurrenzfaktor dar, der für das Pflanzenwachstum unter Wasser limitierend sein kann (POTT & REMY 2000; VADSTRUP & MADSEN 1995), zumal der Pflanzenoberfläche eine unbewegte ( unstirred ) Grenzschicht aufliegt, die zwischen 10 µm bei Mikroalgen in einer stark durchwirbelten Lösung und 500 µm bei submersen Makrophyten in unbewegter Lösung liegt (PRINS & ELZENGA 1989 nach SMITH & WALKER 1980; SMITH 1985; WALKER 1985). Diese stellt, in Abhängigkeit von ihrer Mächtigkeit, eine Diffusionsbarriere für die im Wasser gelösten Gase dar. Eine Entnahme von CO 2 aus dieser Grenzschicht führt zu einer Steigung des ph-wertes und - einer damit einhergehenden Verschiebung von CO 2 zu HCO 3 (PRINS & ELZENGA 1989). Um einer Limitierung der Photosynthese durch einen Mangel an CO 2 zu entgehen, verfügen aquatische Makrophyten über verschiedene Anpassungen, um die photosynthetische Kohlenstofffixierung zu erhöhen, die nachfolgend beschrieben werden. Dabei zielen letztendlich alle diese Strategien auf eine Erhöhung der CO 2 -Konzentration in der Pflanzenzelle ab, um die Photorespiration durch die Kondensation von O 2 mit RuBP möglichst gering zu halten. Submerse Makrophyten zeichnen sich i.d.r. durch eine bemerkenswerte Plastizität bezüglich ihres Kohlenstoffmetabolismus aus, die sich in der Verschiebung des CO 2 -Kompensationspunktes niederschlägt (BOWES & SALVUCCI 1989). So können sich die (meisten) untergetauchten Wasserpflanzen optimal an die (tageszeitlich) ändernden Umweltbedingungen anpassen und trotz hohen ph- Werten und niedrigen CO 2 -Konzentrationen im Wasser am Tag eine Netto- Photosynthese betreiben. Nutzung von Hydrogencarbonat Während für Landpflanzen nur CO 2 als Kohlenstoffquelle zur Verfügung steht, vermögen etwa die Hälfte der Wasserpflanzen auch HCO 3 - (Hydrogencarbonat) zu nutzen (MADSEN & SAND-JENSEN 1991). Arten, die über diese zusätzliche Kohlenstoffquelle verfügen, können die innere CO 2 -Konzentration entsprechend hoch halten und damit die Photorespiration unterdrücken, Carboxylierungsprozesse optimieren und dabei die Notwendigkeit hoher RuBisCO-Aktivität senken (MADSEN ET AL. 1993). Es scheint drei Mechanismen für die Nutzung von HCO 3 - als Kohlenstoffquelle für die Photosynthese zu geben: Den H + -HCO 3 - Cotransport, die externe Ansäuerung von 25

47 Einleitung HCO 3 - zu CO 2 und die durch Enzyme katalysierte Umwandlung von HCO 3 - zu CO 2 (PRINS & ELZENGA 1989). Während ungeladenes CO 2 frei durch das Plasmalemma und die Thylakoidmembran diffundieren kann, sind diese für die geladenen Ionen HCO 3 - und CO 3 2- impermeabel. Transporterproteine in der Membran ermöglichen unter ATP-Verbrauch das Passieren von HCO 3 - durch die Membran (FALKOWSKI & RAVEN 2007). Die aktive Aufnahme von HCO 3 - bei höheren Wasserpflanzen wird durch eine Protonenpumpe (H + -ATPase) angetrieben und erfolgt im Cotransport mit H + (BOSTON ET AL. 1989; LUCAS 1985). Dabei ist festzuhalten, dass das verstärkt bei höheren ph-werten vorkommende CO 3 2- als Inhibitor für die HCO 3 - -Aufnahme fungiert, indem es möglicherweise um die Bindungen an den Transporterproteinen konkurriert (BOWES & SALVUCCI 1989). Wird in der Pflanzenzelle das CO 2 dem HCO 3 - für die Kohlenstofffixierung entnommen, bleibt OH - übrig, das wieder von der Pflanze ausgeschieden wird (PRINS ET AL. 1980). Die Aufnahme von HCO 3 - und die Abgabe von OH - sind zwar miteinander gekoppelt (PRINS ET AL. 1980; PRINS ET AL. 1982), sind aber zumindest in einigen höheren Wasserpflanzen räumlich getrennt. Dieses Phänomen der Polarität von Blättern wurde bei mehreren Arten nachgewiesen (z.b. Potamogeton lucens, Elodea canadensis, Egeria densa (PRINS ET AL. 1980) oder Chara corallina (LUCAS 1982). Während hier HCO 3 - nur von den Epidermiszellen der Blattunterseite aufgenommen wird, werden die OH - - Ionen nur von der Blattoberseite abgegeben bzw. bei den Armleuchteralgen (Characeae) wird HCO 3 - nur von den sogenannten Säureringen (acid bands) aufgenommen und OH - nur von den Basenringen (alkaline bands) abgegeben (LUCAS 1983). Dabei können ph- Unterschiede zwischen Blattober- und unterseite, wie bei Hydrilla verticillata gemessen, von 6 Einheiten auftreten (VAN GINKEL ET AL. 2001). Diese Polarität der Blätter entsteht im Licht in zwei Phasen. Unter Licht findet zunächst in einer ersten Phase ein ph-anstieg auf beiden Seiten der Blätter statt, der auf den photosynthetischen CO 2 - Entzug zurückzuführen ist. Darauf folgt die zweite, sogenannte polare Phase, in der der ph-wert an der oberen Blattseite weiter steigt, während der ph-wert an der unteren Seite der Blätter auf einen niedrigeren ph-wert als der des Umgebungswassers fällt (PRINS ET AL. 1980). Diese Polarität führt neben den ph-unterschieden auch zu einem Unterschied des elektrischen Potentials beider Blattseiten, wobei die Oberseite elektrisch negativer gegenüber der Unterseite wird und somit das Durchwandern von Kationen ermöglicht (PRINS ET AL. 1980; PRINS & ELZENGA 1989). Die Polarität der Blätter ist jedoch nicht bei allen Wasserpflanzen anzutreffen, die Hydrogencarbonat als zusätzliche Kohlenstoffquelle nutzen (z.b. Myriophyllum spicatum). Daher scheint sie nicht obligat für die photosynthetische Nutzung von Hydrogencarbonat zu sein, sodass die genaue Funktion dieser Polarität noch im Unklaren liegt (PRINS & ELZENGA 1989). 26

48 Einleitung Die Aktivität der Protonenpumpe führt in der Grenzschicht des Blattes zu einer Ansäuerung des Mediums und einer damit einhergehenden Verschiebung von HCO 3 - zu CO 2, welches wiederum in die Pflanze diffundieren kann (BOSTON ET AL. 1989). Die Reaktion von H 2 CO 3 zu CO 2 + H 2 O (und umgekehrt) verläuft rein chemisch relativ langsam (9,4 x 10-7 m -3 s -1 ), kann aber durch Carboanhydrase-Enzyme enorm beschleunigt werden. So findet sich Carboanhydrase-Aktivität oft am Plasmalemma oder als extrazelluläres Enzym, um die Diffusion von CO 2 in die Pflanzenzellen zu unterstützen, indem die Bildung von CO 2 aus Kohlensäure beschleunigt wird (FALKOWSKI & RAVEN 2007). Zur Veranschaulichung sind die verschiedenen Aufnahmewege von CO 2 und HCO 3 - bei Wasserpflanzen noch einmal in der Abbildung 10 zusammengefasst. Abbildung 10: Schematische Darstellung der Aufnahme anorganischen Kohlenstoffs bei Wasserpflanzen mit polaren Blättern nach FALKOWSKI & RAVEN 2007; LUCAS 1982 und LUCAS Die Effizienz der Bicarbonatnutzung scheint bei schnell wachsenden Pflanzen, die in Gewässern mit hoher Primärproduktion vorkommen, höher zu sein (BOSTON ET AL. 1989; MABERLY & SPENCE 1983), wobei die Fähigkeit und Effizienz der HCO Nutzung je nach Entwicklungsstadium und biotischen und abiotischen Umwelteinflüssen variieren kann (JONES ET AL. 1993; PRINS & ELZENGA 1989). Wasserpflanzen, die ausschließlich gelöstes CO 2 aufnehmen können, müssen nicht die (energetischen) Kos- 27

49 Einleitung ten für die aktive HCO Entnahme aus dem Wasser aufwenden (BOSTON ET AL. 1989; LUCAS 1983). Diese sind dann in weichen Gewässern mit geringer Primärproduktion im Vorteil, bei Zugang zu atmosphärischem CO 2 und/oder bei hohen CO 2 -Konzentrationen in oder nahe dem Sediment (MABERLY & SPENCE 1983). Die Kohlenstoffaufnahme über die Wurzel aus dem Sediment scheint aber nur bei wenigen Makrophyten (z.b. bei dem Europäischen Strandling (Litorella uniflora) (SMOLDERS ET AL. 2002)), die in weichem oligotrophem Wasser wachsen, von Bedeutung. Die meisten Pflanzen entnehmen den Kohlenstoff direkt aus dem Wasser (LOCZY ET AL. 1983). C 4 -Photosynthese bei Wasserpflanzen Einige Wasserpflanzen können eine Art C 4 -Photosynthese betreiben, um eine CO 2 - Limitierung und Photorespiration zu vermeiden. Erhöhte PEP (Phosphoenolpyruvat)-Carboxylase-Werte und die Synthese von C 4 - Säuren konnten z.b. bei Elodea canadensis nachgewiesen werden (DEGROOTE & KENNEDY 1977). Diese aquatischen Pflanzen weisen allerdings nicht die für C 4 - Pflanzen typische Kranzanatomie der Mesophyllzellen auf (DEGROOTE & KENNEDY 1977) und verfügen damit über keine morphologischen Strukturen für eine räumliche Trennung von C 4 -Stoffwechsel und Calvin-Zyklus. Während, wie oben erwähnt, RuBisCO nur CO 2 als C-Quelle nutzen kann, wird der Kohlenstoff von PEP- Carboxylase in Form von HCO 3 - an PEP zu Oxalacetat fixiert (MARUYAMA ET AL. 1966). Hier scheint der Vorteil für die zusätzliche Nutzung des C 4 -Stoffwechselweges für Wasserpflanzen zu liegen: Die Synthese von Oxalacetat durch PEP-Carboxylase erschließt den Pflanzen eine weitere Möglichkeit Hydrogencarbonat photosynthetisch zu nutzen. Die C 4 -ähnliche Photosynthese ist mindestens bei einigen Arten (z.b. Egeria densa, Hydrilla verticillata) bei hohen Temperaturen, hohen Lichtintensitäten, geringer CO 2 - und hoher O 2 -Konzentration im Wasser induzierbar (BOSTON ET AL. 1989; VAN GINKEL ET AL. 2001). So kann im Sommer trotz geringer CO 2 -Verfügbarkeit bei starkem Lichteinfall die Photorespiration gering gehalten werden. CAM-Stoffwechsel bei Wasserpflanzen Eine andere Strategie von Wasserpflanzen, um CO 2 in der Pflanze anzureichern, ist der CAM (Crassulacean Acid Metabolism)-Stoffwechsel (MADSEN & SAND-JENSEN 1991), der sonst bei an heiße und trockene Gegenden angepassten Pflanzen, wie bei den namengebenden Dickblattgewächsen (Crassulaceae) oder z.b. Kakteengewächsen (Cactacea), anzutreffen ist. Durch die tageszeitliche Trennung von Aufnahme und Fixierung von CO 2 durch PEP-Carboxylase-Aktivität bei Nacht und der Lichtreaktion und dem Calvin-Zyklus bei Tag, kann das CO 2 nächtlicher Respiration photosynthetisch 28

50 Einleitung genutzt werden (BOSTON ET AL. 1989). Vor allem für langsam wachsende Arten in kohlenstoffarmen Gewässern kann dies ein Wettbewerbsvorteil sein. CAM ist bei Brachsenkräutern (Isoetes spec.) weit verbreitet. Hier kann die CAM-Aktivität einen beachtlichen Anteil am jährlichen Kohlenstoffgewinn haben (siehe z.b. BOSTON & ADAMS 1986). Ein CAM-ähnlicher Stoffwechsel mit nächtlicher CO 2 -Fixierung kommt auch bei anderen produktiveren Pflanzen, wie z.b. bei der Grundnessel (Hydrilla verticillata), vor (HOLADAY & BOWES 1980), wo er aber nur von geringerer Bedeutung für die Kohlenstoffversorgung ist (BOSTON ET AL. 1989) ÖKOLOGISCHE FUNKTION VON MAKROPHYTEN Makrophyten spielen in aquatischen Ökosystemen eine herausragende Rolle, indem sie sowohl die physikalische als auch chemische Umwelt aquatischer Systeme stark beeinflussen (JONIAK ET AL. 2007) und in zahlreiche Interaktionen mit verschiedensten Biota treten (CARPENTER & LODGE 1986). Die wichtigsten Funktionen seien hier kurz aufgeführt. Einfluss auf die physikalische Umwelt Makrophyten wirken sich durch Beschattung auf die Lichtverhältnisse eines Gewässers aus. Unterhalb der Blätter von Wasserpflanzen nimmt das Licht exponentiell mit der Tiefe ab (WESTLAKE 1964). Zudem wirkt sich die Beschattung auf die Temperatur im Gewässer aus. Der Temperaturgradient in Makrophytenbeständen beträgt ein Vielfaches von dem vegetationsloser Bereiche (DALE & GILLESPIE 1977). In Fließgewässern wird die Hydrodynamik und damit die räumliche Verteilung von Substrat im Flussbett stark durch Makrophyten gestaltet. In Makrophytenbeständen kann sich feines Sediment und Detritus ablagern, welches ohne den Schutz der Pflanzen durch die Strömung weggetragen werden würde (CARPENTER & LODGE 1986). Zum Beispiel wurde in Beständen von dem Stumpfkantigen Wasserstern (Callitriche cophocarpa) eine Sedimentanreicherung in einem Fließgewässer von 780 g/m 2 organischem Material mit 30 g/m 2 N und 25 g/m 2 P gegenüber dem Umgebungssubstrat gemessen (SAND-JENSEN 1998). Einfluss auf die chemische Umwelt Submerse Makrophyten reichern das Wasser tagsüber durch Photosynthese mit Sauerstoff an. Nachts findet aufgrund der Atmung ein Sauerstoffverbrauch statt. In dichten Beständen von Elodea canadensis wurden Tag/Nacht-Unterschiede im Sauerstoffgehalt von 16 zu 4 mg/l beschrieben (ONDOK ET AL. 1984). Dichte Decken an Wasserlinsen 29

51 Einleitung können den Sauerstoffgehalt eines Gewässers auch senken, indem sie den Sauerstoffaustausch aus der Atmosphäre ins Wasser einschränken (MORRIS & BARKER 1977). Submerse Makrophyten vermögen die Chemie der Rhizosphäre zu verändern, wenn der über die Aerenchyme in die Wurzeln diffundierte Sauerstoff in das Sediment entweicht (WIGAND ET AL. 1997). In einer Studie von CAFFREY & KEMP (1991) wurden an der Oberfläche von Makrophytenrhizomen Sauerstoffkonzentrationen zwischen 63 und 188 µm gemessen, die in 2 mm Entfernung zum Rhizom auf 0 µm sank. Die Sauerstoffabgabe der Wurzeln und Rhizome aquatischer Makrophyten korreliert stark mit der Photosynthese und variiert entsprechend tageszeitlich und saisonal. In der oben genannten Studie (CAFFREY & KEMP 1991) hatte die Sauerstoffabgabe der Rhizome des Durchwachsenen Laichkrauts (Potamogeton perfoliatus) ihr Maximum im April und sank im August gegen 0. Die Sauerstoffabgabe im Sediment führt zu Änderungen des ph-wertes und des Redoxpotentials und somit zu einer veränderten Nährstoff- und Metallverfügbarkeit. Die Oxidation der Rhizosphäre kann schwere biogeochemische Folgen haben, wenn so z.b. Eisen oder Mangan freigesetzt wird (CARPENTER & LODGE 1986; TESSENOW & BAYNES 1978). Außerdem werden durch die Oxidation der Rhizosphäre die bakterielle Nitrifikation und die an sie gekoppelte Denitrifikation begünstigt (OTTOSEN ET AL. 1999; RISGAARD-PETERSEN & JENSEN 1997). Die Photosynthese unter Wasser führt nicht nur zur Änderung des Sauerstoffgehaltes des Wassers sondern auch zum Verbrauch von anorganischem Kohlenstoff. Dieser wird dem Wasser entzogen, sowohl durch die direkte Assimilation des Kohlenstoffes in die Pflanze, als auch durch Kalkablagerungen an der Pflanze durch biogene Bicarbonatspaltung (CARPENTER & LODGE 1986; POTT & REMY 2000). In Wasser gelöstes CO 2 reagiert mit H 2 O zu einem geringen Teil zu freier Kohlensäure (H 2 CO 3 ), mit der es in einem Gleichgewicht steht. Durch den photosynthetisch bedingten CO 2 -Entzug erhöht sich entsprechend auch der ph-wert des umgebenden Wassers (POTT & REMY 2000). Das Pflanzenwachstum geht zudem mit einem Nährstoffverbrauch einher, während absterbende Pflanzen(-teile) dem System wieder Nährstoffe zuführen. Ausmaße dieser beiden Prozesse sind in erster Linie saisonal bedingt (siehe ASAEDA ET AL. 2000). Insgesamt spielt die Aufnahme von Nährstoffen aus dem Sediment durch wachsende Makrophyten und die Abgabe dieser durch absterbende Wasserpflanzen eine wichtige Rolle im Sediment-Nährstoff-Recycling von aquatischen Systemen (BARKO & SMART 1981). Ein weiterer Punkt bezüglich des Einflusses von Makrophyten auf den Gewässerchemismus ist das Potential von Makrophyten Schwermetalle aufzunehmen und zu akkumulieren, welches je nach Art unterschiedlich hoch ist. So wurden bei St. Petersburg Mangan-Konzentrationen in Ceratophyllum demersum bestimmt, die mit 8800 mg/kg Trockengewicht 15 mal höher waren als in Typha latifolia und Phragmites communis im gleichen Gewässer (KURILENKO & OSMOLOVSKAYA 2006). 30

52 Einleitung Klimarelevant ist die Ausscheidung von Methan emerser Pflanzen. Das Methan entsteht bei dem anaeroben Abbau organischen Materials im Sediment von Gewässern oder überstauten Böden. Emerse Pflanzen stellen mit ihrem Aerenchym die Hauptverbindung für den Gasaustausch zwischen diesen anaeroben Kompartimenten und der Atmosphäre dar % des Gasaustausches von Methan aus Feuchtgebieten in die Atmosphäre erfolgt über diesen Weg (WHITING & CHANTON 1996). Einfluss auf die belebte Umwelt Makrophyten wirken sich nicht nur durch ihren Einfluss auf physikalische und chemische Wasserparameter auf die Lebenswelt eines Gewässers aus. Sie führen zudem zu einer Erhöhung der Biodiversität, da sie Strukturen und Habitat für andere Organismen bieten (KUCZYNSKA-KIPPEN & NAGENGAST 2006; WARFE & BARMUTA 2006). Untergetauchte Blätter werden von Periphyton bewachsen, soweit algizide Wirkstoffe der Pflanze die Besiedlung nicht verhindern, wie z.b. bei Ceratophyllum demersum (POTT & REMY 2000). Die Zusammensetzung und Struktur der Periphytongemeinschaft unterscheidet sich im gleichen Gewässer in Abhängigkeit von der Makrophytenart aufgrund eines komplexen Faktorengeflechts (PIP & ROBINSON 1984). Bis zu 10% des durch Photosynthese fixierten Kohlenstoffs wird wieder als dissolved organic matter (DOM) von den Wasserpflanzen abgegeben (CARPENTER & LODGE 1986 nach WETZEL 1969; HOUGH & WETZEL 1975; SØNDERGAARD 1981a) und dient den epiphytischen Mikroorganismen und dem Bakterioplankton als Kohlenstoffquelle (ALLEN 1971). SØNDERGAARD (1981b) vermutet, dass es sich bei dem Verlust extrazellulären organischen Kohlenstoffs um frühe Produkte der Photosynthese handelt. Dagegen wird Phosphor von lebenden Wasserpflanzen nur in geringem Maße abgegeben und macht nach einer Studie von CARIGNAN & KALFF (1982) entsprechend nur einen geringen Teil der epiphytischen Phosphorquelle aus (3,4-9%). Der von absterbenden Wasserpflanzen entweichende Phosphor wird wiederum schnell vom Periphyton assimiliert (CARPENTER & LODGE 1986 nach HOWARD-WILLIAMS & ALLANSON 1981). Somit können Makrophyten auf der einen Seite das Wachstum von Algen fördern, indem sie sie mit Nährstoffen versorgen (siehe auch GODMAIRE & PLANAS 1986), andererseits stehen sie zu ihnen in Konkurrenz um Licht und Nährstoffe. Durch diesen Ressourcenwettbewerb in Kombination mit Allelopathie spielen Makrophyten eine Schlüsselrolle zur Stabilisierung eines Klarwasserstadiums flacher Gewässer (VAN DONK & VAN DE BUND 2002; HILT & GROSS 2008) und damit zur Stabilisierung dieses Ökosystems. Fallen submerse Makrophyten in einem Gewässer aus, besteht v.a. in eutrophierten Gewässern die erhöhte Gefahr von Algenblüten. Diese können nachts durch Respiration oder durch Absterben und dem einhergehenden mikrobiellen Abbau zu Sauerstoffarmut im Gewässer führen. Die Sauerstoffabnahme im Wasser wirkt sich entsprechend auf die Fauna aus. Fällt die Algenblüte mit einem ungünstigen Nährstoffverhält- 31

53 Einleitung nis im Gewässer zusammen, wird bei einigen Algenarten die Produktion allelopathischer Substanzen einschließlich Toxine angeregt (GRANELI ET AL. 2008). Insbesondere Cyanobakterien (Cyanophyceae) und Dinoflagellaten (Dinophyceae) sind für problematische Algenblüten bekannt, aber auch Grünalgen wie z.b. Pandorina oder Volvox können problematische Dichten erreichen (PAERL 1988). Im Jahre 1988 führte eine durch Eutrophierung begünstigte Algenblüte von dem Flagellaten Chrysochromulina polylepis vor der Küste Skandinaviens zu einem immensen Absterben von Fauna und Flora auf über km 2 (GRANELI 2008; MAESTRINI & GRANELI 1991). Für die Gewässerfauna stellen Makrophytenbestände einerseits Schutz vor Strömung und Prädatoren dar und anderseits bietet der Pflanzenaufwuchs ein reichhaltiges Nahrungsangebot (CARPENTER & LODGE 1986), sodass sich hier i.d.r. eine artenreiche Invertebratengemeinschaft einstellt. Dabei wird sogar vermutet, dass Wasserpflanzen Exsudate abgeben können, die Invertebraten anlocken, welche das Periphyton auf den Pflanzen dezimieren (BRÖNMARK 1985; CARPENTER & LODGE 1986). Diese Makrophyten-assoziierte Invertebratengemeinschaft variiert stark in Abundanz und Diversität in Abhängigkeit von der Makrophytenspezies (BOGUT ET AL. 2007; CYR & DOWNING 1988; DVORAK & BEST 1982). Dabei ist die Bindung einiger Invertebraten- Arten an bestimmte Makrophyten sehr eng (DVORAK & BEST 1982), wie z.b. bei der gefährdeten Grünen Mosaikjungfer (Aeshna viridis) an die Krebsschere (Stratiotes aloides) (RANTALA ET AL. 2004). In Fließgewässern wird v.a. durch die Auswirkung von Makrophyten auf die Strömung die Habitatdiversität für Invertebraten erhöht. In einer Studie von GREGG & ROSE (1985) wird gezeigt, dass in einem Fließgewässer in einem Makrophytenbestand von Wasserhahnenfuß (Ranunculus aquatalis) und Brunnenkresse (Rorippa nasturtiumaquaticum) Artenreichtum und Abundanzen signifikant höher waren als in vegetationslosen Bereichen. Wie schon oben erwähnt ist die aerobe Rhizosphäre ein eigener Lebensraum für eine Vielzahl von Mikroorganismen und kleinen Tieren und daher von großer Bedeutung für die Biozönose im Sediment eines Gewässers oder den Böden von Feuchtgebieten. Letztlich beeinflussen aquatische Makrophyten nicht nur die Lebensgemeinschaft im Gewässer und im Sediment, sondern auch gewässerassoziierte, terrestrische Tiere. Denn Herbivorie von Wasserpflanzen findet nicht nur durch Organismen der Gewässerfauna statt, sondern auch durch Wasservögel und Säugetiere, sodass sich die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wasserpflanzen auch auf das Nahrungsnetz außerhalb eines Gewässers auswirken kann (siehe z.b. HARGEBY ET AL. 1994). Makrophyten im weiteren Sinne sind elementarer Bestandteil von Feuchtgebieten, einschließlich Röhricht, Sümpfe, Moore etc. und bilden erst die Grundlage für die immense Biodiversität dieser Ökosysteme. 32

54 Einleitung EINFLUSS DES MENSCHEN AUF MAKROPHYTEN Wetlands are among the most productive life-support systems in the world and are of immense socio-economic and ecological importance to mankind. They are critical for the maintenance of biodiversity and perform a great role in the biosphere. Ironically, wetlands have been perceived as wastelands associated with disease, difficulty and danger. Emphasizing the negative impacts and ignoring their importance, these habitats were considered obstacles in the path of progress and hence drained, filled, despoiled and degraded for economic gains. The wetland loss has been responsible for bringing to the verge of extinction countless species of animals and plants. Inadequate understanding of the crucial role and utility of wetlands is a matter of serious concern. (Captain Jai Narain Prasad Nishad Minister, Environment and Forests, India) (HAILS 1997) In den letzten 100 Jahren sind v.a. durch Flurbereinigungsmaßnahmen wie Drainage in der nördlichen Hemisphäre Feuchtgebiete in hohem Maße durch den Menschen verändert und umgewandelt worden, meistens in landwirtschaftliche Flächen. Tabelle 3 zeigt den Flächenverlust an Feuchtgebieten 6 europäischer Länder auf, der in jedem dieser Länder über 50% liegt. Fließgewässer wurden begradigt, ausgeräumt und verbaut und sowohl terrestrische als auch aquatische Ökosysteme werden durch Eutrophierung und Schadstoffe menschlichen Ursprungs belastet. Über das Abwasser, den Oberflächenabfluss und durch unterirdischen Zustrom gelangen viele Schadstoffe letztendlich in Gewässer. Sowohl das Verschwinden von Feuchtgebieten als auch die wasserbaulichen Veränderungen und stofflichen Belastungen von Gewässern haben in den letzten 100 Jahren zu Tabelle 3: Verlust von Feuchtgebieten in ausgewählten Europäischen Staaten (BARBIER ET AL nach CEC 1995). Country Zeitraum % Verlust der Feuchtgebiete Niederlande Frankreich Deutschland Spanien Italien Griechenland

55 Einleitung einem rapiden Rückgang von Makrophyten geführt, sodass ein hoher Anteil der Makrophytenflora Nordwesteuropas selten geworden oder vom Aussterben bedroht ist (siehe z.b. SAND-JENSEN ET AL. 2000). Besonders langsam wachsende, an oligotrophe Gewässer angepasste Wasserpflanzen, wie Armleuchteralgen, sind aus den eutrophierten Gewässern weitgehend verschwunden und höchstens durch nährstofftolerante Makrophyten wie Ceratophyllum demersum oder Myriophyllum spec. ersetzt worden. Zum Beispiel waren in einer Studie aus Brandenburg in Abhängigkeit von der Tiefe der Gewässer von 100 Seen 55 bis 85% ohne oder nur mit wenigen submersen Makrophyten ausgestattet (KÖRNER 2002). 34

56 Allgemeiner Methodenteil 2 ALLGEMEINER METHODENTEIL 2.1 IN DER ARBEIT VERWENDETE TESTSUBSTANZEN ATRAZIN Stoffeigenschaften von Atrazin (Aus HILLENBRAND ET AL. (2006) nach GESTIS Stoffdatenbank (2006); EU Kommission (2005); PERKOW & PLOSS 1999): Identität des Wirkstoffes IUPAC-Name 6-Chlor-N-ethyl-N -(1-methylethyl)-1,3,5-triazin-2,4- diamin Summenformel C 8 H 14 ClN 5 CAS-Nr Strukturformel Physikalisch-chemische Eigenschaften Molare Masse Aggregatzustand Farbe Geruch Dichte 215,69 g/mol Pulver weiß bis beige geruchlos 1,23 g/cm3 Schmelzpunkt 176 C Siedepunkt 205 C Dampfdruck 80 mpa bei 25 C Wasserlöslichkeit Abbaubarkeit (biotischer und abiotischer Abbau) 33 mg/l (22 C) im Wasser: DT50 > d 35

57 Allgemeiner Methodenteil Sorptionsverhalten (KOC- Wert) 86 L/kg Bioakkumulation (log Pow) 2,5 Beschreibung Atrazin gehört zur Gruppe der Chlor-Triazine und ist ein Photosynthese-Hemmer. Es bindet, wie die meisten Photosynthese-Hemmer, in der Elektronentransportkette an das D1-Protein der Q B -Bindenische (JANSEN ET AL. 1993), verdrängt ein Plastochinon (TREBST 1995) und blockiert den Elektronenfluss vom Photosystem II zu Photosystem I (eine Beschreibung des Elektronentransports bei der Photosynthese erfolgt in Kapitel 1.6.3). Das D1-Protein ist zusätzlich sehr sensitiv gegenüber Photooxidation und wird normalerweise schnell ersetzt. Durch die Bindung an das Herbizid wird die Entfernung des geschädigten D1-Proteins gehemmt, sodass es zu irreversiblen Schädigungen durch das Herbizid kommen kann (HOCK ET AL. 1995). Die Blockierung des Elektronenflusses führt besonders im Starklicht zu schnellen Schädigungen der Pflanze: Überschüssige Triplett-Chlorophyll-Anregungszustände reagieren mit Sauerstoff. Der so gebildete Singulett-Sauerstoff zerstört die Membranen, indem er Lipide oxidiert (HOCK ET AL. 1995). Durch die Photosynthesehemmung werden durch Atrazin indirekt auch Prozesse, wie Stomatabewegungen, Transpiration und Ionentransport in der Pflanze beeinflusst und vermutlich wirkt sich Atrazin auch auf den Phytohormonhaushalt der Pflanze aus (HUBER & HUBER 1995). Obwohl Atrazin seit 1991 in Deutschland verboten ist, wurde Atrazin (und/oder der Metabolit Deethylatrazin) im Jahr 2003 in 611 von 3702 Messstellen im deutschen Grundwasser nachgewiesen. 111 der Messstellen wiesen eine Konzentration von >0,1 µg/l auf ( (abgerufen: 11/2009)). In der Europäischen Union ist Atrazin seit 2004 verboten, in den USA ist es aber nach wie vor erlaubt und wird in großen Mengen eingesetzt. Es ist das häufigste nachgewiesene Herbizid in den USA, sowohl in Fließgewässern als auch im Grundwasser und gehört zu den häufigsten Herbiziden, die die aquatic-life und humanhealth Grenzwerte in Fließgewässern landwirtschaftlich geprägter Räume überschreiten (GILLIOM ET AL. 2006). Während in den neunziger Jahren HUBER (1993) postulierte, dass Konzentrationen bis 20 µg/l keine nachhaltigen Schäden in aquatischen Ökosystemen verursachen und auch SOLOMON ET AL. (1995) zu dem Schluss kamen, dass Atrazin kein signifikantes Risiko für die aquatische Umwelt darstellt, zeigen aktuellere Studien, dass schon Konzentrationen unterhalb der EPA-Trinkwassergrenzwerte endokrine Effekte bei Amphibien hervorrufen (HAYES ET AL. 2003, HAYES ET AL. 2002). Langfristige Schäden können sich auch durch sublethale Dosen ergeben, wenn eine Schwächung eines Organismus zum Befall von Parasiten führt (KIESECKER 2002) oder die Substanz 36

58 Allgemeiner Methodenteil das Verhalten eines Organismus manipuliert. Salamander, die Atrazin-Konzentrationen von weniger als 40 µg/l ausgesetzt wurden, zeigten noch Monate später Verhaltensänderungen, die zur Austrocknung der betroffenen Organismen führen konnten (ROHR & PALMER 2005). Zudem liegt in der Umwelt ein Gemisch verschiedener Pestizide vor, deren Mischtoxizität die Toxizität der Einzelsubstanzen, wie eine Studie mit Atrazin und 3 Organophosphatinsektiziden zeigte (ANDERSON & LYDY 2002), übertreffen kann. Aus humantoxikologischer Sicht betrachtet, steht Atrazin im Verdacht krebserregend zu sein (IARC 1999) ,4-DICHLORPHENOXYESSIGSÄURE (2,4-D) Stoffeigenschaften von 2,4-D (GESTIS Stoffdatenbank 2010) Identität des Wirkstoffes IUPAC-Name 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure Summenformel C 8 H 6 Cl 2 O 3 CAS-Nr Strukturformel Physikalisch-chemische Eigenschaften Molare Masse Aggregatzustand Farbe Geruch Dichte Schmelzpunkt 221,04 g/mol Pulver weiß geruchlos 1,416 g/cm3 140,5 C Siedepunkt 160 C Dampfdruck 0,0186 mbar bei 25 C Wasserlöslichkeit 600 mg/l (20 C) 37

59 Allgemeiner Methodenteil Bioakkumulation (log Pow) 2,81 Beschreibung 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) ist ein sogenanntes Auxin-Herbizid aus der Gruppe der Chlorophenoxy-Herbizide. Auxine sind Pflanzenhormone, die Genexpression und Wachstum regulieren. Auxin-Herbizide sind synthetische Auxine, die in der Pflanze alle Auxin-Rezeptoren besetzen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Zunächst setzt ein erhöhtes Wachstum ein. Durch ungleiche Auxin-Konzentrationen verkrümmen und verdrehen sich die Blattstiele. Chloroplasten schwellen an und Endomembranen lösen sich im fortgeschrittenen Stadium auf (HOCK ET AL. 1995). Auxinherbizide werden v.a. gegen dikotyledone Unkräuter eingesetzt, da sie wesentlich sensitiver als monokytledone Pflanzen auf diese Herbizidgruppe reagieren (SANDMANN & BÖGER 1995). 2,4-D erlangte traurige Bekanntheit als Bestandteil von Agent Orange, welches großflächig während des Vietnamkrieges eingesetzt wurde. Heute ist es ein weitverbreitetes Herbizid, welches v.a. im Getreideanbau eingesetzt wird war es in den USA nach Atrazin und Metolachlor das Herbizid, welches mengenmäßig am dritt häufigsten eingesetzt wurde (GILLIOM ET AL. 2006). 2,4-D wird von den Pflanzen innerhalb von 4-6 Stunden nach Applikation über die Wurzeln und Blätter aufgenommen. Anschließend wird es mit dem Transpirationsstrom in die Meristeme transportiert, wo es akkumuliert (WALTERS 1999 nach MUNRO ET AL und EPA 1988). 38

60 Allgemeiner Methodenteil 2.2 IN DER ARBEIT VERWENDETE TESTORGANISMEN Die Nomenklatur und ihre Systematik der Farn- und Blütenpflanzen richten sich nach HAEUPLER & MUER (2000) (nach WISSKIRCHEN & HAEUPLER 1998). Die Nomenklatur und ihre Systematik der Moose richten sich nach FRAHM & FREY (1992) CERATOPHYLLUM DEMERSUM L. Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Magnoliopsida Nymphaeales Ceratophyllaceae Ceratophyllum Ceratophyllum demersum Beschreibung Das Raue Hornblatt (Ceratophyllum demersum) ist eine dikotyle submerse Wasserpflanze, die etwa eine Länge von einem Meter erreicht. Ihre schmalen, gegabelten Blätter sitzen in Wirteln am zuweilen stark verzweigten Stängel. Sie weisen eine Vielzahl kleiner Ausstülpungen auf, die dazu führen, dass sich die Pflanze rau anfühlt. Diese Eigenschaft schlägt sich im Namen wieder. Ceratophyllum verfügt über keine Wurzeln. Die Funktion der Verankerung im Sediment übernehmen die untersten Blattwirtel, die, wenn sie im Sediment vergraben sind, ihr Chlorophyll verlieren. Abbildung 11: Ceratophyllum demersum. 39

61 Allgemeiner Methodenteil Bestimmung Ceratophyllum demersum lässt sich von Ceratophyllum submersum durch seine festen Blätter unterscheiden. Ein weiteres Bestimmungsmerkmal ist die Blattgabelung beider Arten: Während die Blätter von Ceratophyllum demersum nur ein bis zweifach gegabelt sind, weisen die Blätter von Ceratophyllum submersum eine drei- bis vierfache Gabelung auf. Ökologie & Fortpflanzung In nährstoffreichen Gewässern kann Ceratophyllum demersum sowohl in Fließ- als auch in Stillgewässern dichte Bestände ausbilden (LUA 2003). Die Affinität zu eutrophen Gewässern macht Ceratophyllum demersum zu einem Nährstoffzeiger (OBERDORFER 1983), der entsprechend als Bioindikator herangezogen wird (SCHAUMBURG ET AL. 2004; STELZER 2003). Die Vermehrung des einhäusigen Ceratophyllums kann über die stachligen Früchte erfolgen, die sich u.a. im Gefieder von Wasservögeln verhaken und so für eine zoochore Verbreitung sorgen. Die vegetative Vermehrung scheint aber eine größere Rolle als die sexuelle Reproduktion zu spielen, wie Untersuchungen zur genetischen Diversität von Ceratophyllum-Populationen nahelegen (LES 1991). Hierzu entwickeln sich aus abgetrennten Sprossabschnitten wieder eigenständige Individuen. Bei Ceratophyllum demersum ist das Ausscheiden allelopathischer Substanzen nachgewiesen (siehe z.b. GROSS ET AL. 2003). Die Tatsache, dass Ceratophyllum demersum nur wenig von Epiphyten bewachsen ist, scheint auf das Ausscheiden von elementarem Schwefel zurückzuführen zu sein (MACIAS ET AL. 2008; WIUM-ANDERSEN ET AL. 1983). Gegen Herbivorie ist Ceratophyllum demersum relativ gut durch seine harte Textur und abstoßende Substanzen geschützt (BRÖNMARK 1985). Verbreitung Ceratophyllum demersum ist kosmopolitisch in den gemäßigten und subtropischen Zonen verbreitet (OBERDORFER 1983). 40

62 Allgemeiner Methodenteil ELODEA NUTTALLII (PLANCH.) H. ST. JOHN. Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Liliopsida Hydrocharitales Hydrocharitaceae Elodea Elodea nuttallii Beschreibung Die Schmalblättrige oder auch Nutalls Wasserpest genannte Elodea nuttallii ist eine monokotyledone, submerse, im Sediment wurzelnde Wasserpflanze. Die linealisch bis lanzettlichen Blätter sitzen in Wirteln meist zu dritt, seltener zu viert, am Stängel, der an den Nodien bräunlich-rote Verfärbungen aufweist. Von dem Hauptspross, der eine Länge von bis zu 3 Metern erreichen kann (nach HAEUPLER & MUER 2000), können zahlreiche Nebensprosse abgehen. Die unscheinbaren, kleinen Blüten sind von hellvioletter Farbe. E. nuttallii bildet dichte Bestände. Abbildung 12: Elodea nuttallii. Bestimmung Da sowohl E. nuttallii als auch ihre Schwesterart E. canadensis eine hohe phänologische Plastizität bezüglich Blattform, -größe und -stellung sowie Länge der Internodien und Farbe aufweist (SIMPSON 1988) und auch E. callitrichoides vegetativ nur 41

63 Allgemeiner Methodenteil schwer von E. nuttallii zu unterscheiden ist (siehe auch VANDERPOORTEN ET AL. 2000), ist eine Bestimmung aufgrund dieser Merkmale fehleranfällig. Da aber Elodea meistens im vegetativen Zustand angetroffen wird, zeigt Abbildung 13 Unterscheidungsmerkmale von E. canadensis, E. nuttallii und E. callitrichoides anhand der Blätter. Die Blätter von E. canadensis sind i.d.r. rundlicher als von E. nuttallii, während die Blätter von E. callitrichoides länglicher sind. Eine sichere Bestimmung dieser drei in Europa eingewanderten Neophyten ist mit dem entsprechenden Aufwand mit chemotaxonomischen und molekulartaxonomischen Methoden möglich (GROSS ET AL. 2003). Für eine Bestimmung zur Gattung sei auf die Bestimmungsschlüssel von BOWMER ET AL. (1995) und VAN DE WEYER & SCHMIDT (2007) verwiesen. E. canadensis E. nuttallii E. callitrichoides Abbildung 13: Bestimmungsmerkmale nach den Blättern zur Unterscheidung der 3 Elodea-Arten E. canadensis, E. nuttallii und E. callitrichoides (aus VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007). Ökologie & Fortpflanzung Die phänologische Plastizität von E. nuttallii wird als Anpassung an unterschiedliche aquatische Habitate angesehen, auf die zumindest zum Teil das hohe Invasionspotential dieser Art zurückzuführen ist (vergleiche DAEHLER 2003). Besonders große morphologische Unterschiede treten bei E. nuttallii zwischen in Fließgewässern wachsenden Pflanzen und in Stillgewässern wachsenden Pflanzen auf (THIEBAUT & DI NINO 2009). Die in Europa eingewanderten Vertreter von E. nuttallii zeigen eine höhere Vitalität und ein stärkeres Wachstum als in ihrer Heimat Amerika, was möglicherweise auf eine geringere Schädigung durch Herbivorie als bei heimischen Makrophyten zurückzuführen ist (THIEBAUT & DI NINO 2009). Pflanzliche Sekundärstoffe in E. nuttallii sind vermutlich dafür verantwortlich, dass der Verzehr dieser Pflanze für bestimmte herbivore Organismen, wie die aquatische Schmetterlingslarve Acentria ephemerella, hemmend wirkt (ERHARD ET AL. 2007). 42

64 Allgemeiner Methodenteil E. nuttallii verfügt über ein großes Regenerationspotential und einem damit verbundenem Wiederbesiedlungspotential (BARRAT-SEGRETAIN ET AL. 2002) und erträgt auch mehrere Tage Trockenheit besser als E. canadensis (BARRAT-SEGRETAIN & CELLOT 2007). Zudem weist Elodea einen relativ hohen Gehalt an PEP Carboxylase, dem Schlüsselenzym für den C4-Stoffwechselweg, auf (DEGROOTE & KENNEDY 1977). Durch das Vorhandensein sowohl von einem C3-, als auch einem C4-Enzymsystem, vermag Elodea sich besonders effizient auf verschiedene ph-werte und damit CO 2 - und Hydrogencarbonat-Konzentrationen des Umgebungswassers einzustellen (DEGROOTE & KENNEDY 1977), sodass die Anpassungsfähigkeit von E. nuttallii sowohl morphologisch als auch physiologisch begründet ist. Daher kommt sie entsprechend in verschiedensten aquatischen Habitaten, von oligo-mesotrophen bis hypertrophen Gewässern, vor (COOK & URMI-KÖNIG 1985; OZIMEK ET AL. 1993; NAGASAKA 2004). E. nuttallii ist eine diözische Pflanze. In Europa sind vermutlich nahezu alle Pflanzen dieser Spezies weiblich (in Großbritannien ist nach SIMPSON (1986) nur einmal im 19. Jahrhundert das Antreffen männlicher Blüten belegt). Daher findet hier Fortpflanzung ausschließlich vegetativ über das Abbrechen von Sprossfragmenten statt, die wieder zu eigenen Individuen austreiben (SIMPSON 1986). Eine Studie in Japan belegt, dass E. nuttallii-pflanzen aus 26 dort etablierten Populationen alle den gleichen Genotyp aufwiesen, sodass angenommen werden kann, dass alle diese Pflanzen aus Ramets eines Klones entstammten (KADONO ET AL. 1997). Verbreitung Die aus Nordamerika stammende Pflanze wurde in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts in Europa eingeführt und verdrängt hier seitdem zunehmend die 100 Jahre früher eingeführte Verwandte E. canadensis (BARRAT-SEGRETAIN ET AL. 2002; SIMPSON 1990). 43

65 Allgemeiner Methodenteil LEMNA GIBBA L. Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Liliopsida Arales Lemnaceae Lemna Lemna gibba Beschreibung Die Bucklige Wasserlinse (Lemna gibba) ist eine monokotyle, frei auf der Wasseroberfläche schwimmende Pflanze. Wie bei den meisten Arten der Familie Lemnaceae ist der gesamte Spross auf eine morphologische Einheit, den Frond, reduziert. Aus phylogenetischer Sicht ist ein Frond vermutlich ein Hybrid aus Spross und Blatt, wobei auch andere Ansichten diskutiert werden (LEMON & POSLUSZNY 2000). Jedes blattähnliche Frond hat eine Wurzel, die in den Wasserkörper ragt. In der Regel hängen immer zwei bis vier Fronds in Kolonien zusammen. Die Unterseite der Fronds kann gewölbt sein, sodass sich diese namengebende buckelige Gestalt ergibt. Oft ist aber auch eine flache Ausprägung von Lemna gibba anzutreffen. Die Wölbung der Frondunterseite bei Lemna gibba ist auf eine Vergrößerung der Luftkammern zurückzuführen (PIETERSE 1975), die unter bestimmten (Umwelt-) Bedingungen induziert wird (LANDOLT 1975). Bestimmung Während in der buckligen Ausprägung keine Verwechslungsmöglichkeiten zu anderen Arten bestehen, ist Lemna gibba in ihrer flachen Ausprägung nur mit Hilfe einer starken Vergrößerung von Lemna minor zu unterscheiden. Erst ein Blick auf die Anordnung der Zellen gibt Auskunft, um welche der beiden Arten es sich bei der zu bestimmenden Pflanze handelt: Die Zellen von Lemna minor sind gleichmäßig klein und es lassen sich keine Strukturen im Gewebe, wie bei Lemna gibba erkennen. Bei Lemna gibba treten zur Mitte hin im Zellverband der Frondunterseite Strukturen auf, die Luftkammern darstellen (siehe Abbildung 14A). Allerdings weist das Fehlen dieser Luftkammern nicht zwangsläufig auf Lemna minor hin, da diese sich noch zu einem späteren Zeitpunkt entwickeln können (DE LANGE 1975). Die Größe und Form der Fronds, als auch deren Farbe sowie die Größe 44

66 Allgemeiner Methodenteil A B Abbildung 14: Unterseite von (A) Lemna gibba und (B) Lemna minor unter ~20facher Vergrößerung. der Luftkammern und die Länge der Wurzeln sind sehr variabel (LANDOLT 1975). Der Umstand, dass diese beiden Arten in ihrer flachen Ausprägung makroskopisch nicht zu unterscheiden sind, hat dazu geführt, dass in der Vergangenheit oft flache Vertreter von Lemna gibba als Lemna minor angesprochen worden sind (DE LANGE 1975). Ökologie & Fortpflanzung Die Bucklige Wasserlinse (Lemna gibba) kommt v.a. auf nährstoffreichen Stillgewässern vor, wo sie dichte Decken bilden kann. Im Vergleich zu Lemna minor weist Lemna gibba eine höhere Reproduktionsrate auf und zeigte sich in wärmeren, nährstoffreichen Gewässern wesentlich konkurrenzstärker (REYMANKOVA 1975). Sie ist Charakterart der Pflanzengesellschaft Lemnetum gibbae (Oberdorfer 1983). Obwohl Lemna auch blühen und Früchte bilden kann, erfolgt die Vermehrung weitgehend vegetativ. Jede Lemna-Pflanze verfügt über zwei laterale Taschen ( pockets ), in denen Propagulen, vegetativ eigenständige Fortpflanzungseinheiten, produziert werden (LANDOLT 1986). Hier entstehen Knospungen ( buds ), aus denen sich Tochterfronds entwickeln, die sich zu einem bestimmten Zeitpunkt vom Mutterfrond ablösen und eigene Kolonien aufbauen können. Verbreitung Lemna gibba ist ein Kosmopolit, der aber zu kalte Regionen (-1 C Januar Isotherme), als auch zu warme Regionen (18 C Isotherme der drei kältesten Monate im Jahr), sowie Regionen mit zu hohen Niederschlägen meidet (LANDOLT 1975). 45

67 Allgemeiner Methodenteil MENTHA AQUATICA L. Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Magnoliopsidae Lamiales Lamiaceae Mentha Mentha aquatica Beschreibung Die Wasser-Minze (Mentha aquatica) ist eine dikotyle, amphibische Pflanze. Als Lippenblütler (Lamiaceae) weist sie die für diese Familie typischen Merkmale auf: Die namengebenden Lippenblüten, einen vierkantigen Stängel und eine gegenständige Blattstellung. Die rosa Blüten sitzen in Scheinquirlen oberhalb der Nodien oder kopfig an der Sprossspitze. Die Stängelkanten ziert ein feiner Haarsaum. Die eiförmigelliptischen Blätter sind gekerbt bis gesägt. Je nach Umweltbedingungen (Licht) können sowohl Stängel als auch Blätter eine tief purpurne Farbe annehmen. Hohe Lichtintensitäten induzieren die Bildung von kleinen, derben und stark pigmentierten Blättern (siehe auch ENRIQUEZ & SAND-JENSEN 2003). Mentha aquatica vermag Ausläufer zu bilden, deren Blätter kleiner und rundlicher und nur mit angedeuteter Kerbung sind. Auch die unter Wasser gebildeten Blätter weisen diesen Habitus auf. Pflanzen, die unter Wasser wachsen, weisen i.d.r. verkürzte Internodien gegenüber emersen und an Land wachsenden Pflanzen auf. Bei Berührung verströmt Mentha aquatica einen intensiven charakteristischen Minze-Geruch. A B Abbildung 15: Mentha aquatica. A: Blütenstand. B: submerse und emerse Form. 46

68 Allgemeiner Methodenteil Bestimmung Die Wasser-Minze ist von anderen Lippenblütlern mit ähnlichem Standort schon allein durch den Minzegeruch schnell zu unterscheiden. Innerhalb der Gattung können Verwechslungsmöglichkeiten auftreten, zumal die Wasser-Minze in ihrer phänologischen Ausprägung je nach Umweltbedingungen sehr variabel ist und auch die anderen Mentha-Arten feuchte Standorte aufsuchen. Besonders die Wirtel-Minze (M. x verticillata), ein sehr formenreicher Hybrid aus M. aquatica und M. arvensis, kann der Wasser- Minze sehr ähnlich werden. Aber sowohl M. x verticillata als auch M. arvensis schließen nicht an der Spitze der Pflanze mit dem Blütenstand ab, sondern mit Blättern, im Gegensatz zu M. aquatica, die an der Sprossspitze mit einer rundlichen Infloreszenz, einer Scheinähre, abschließt. Die Blütenstände anderer Mentha-Arten mit endständiger Infloreszenz sind länglicher. Ökologie & Fortpflanzung Die Wasser-Minze ist ein Amphiphyt - sie vermag sowohl an Land, als auch emers und submers in den Uferzonen von Gewässern zu wachsen. Sie bevorzugt nasse, zeitweise überflutete, nährstoffreiche Habitate (OBERDORFER 1983). Bei den untergetauchten Blättern von Mentha aquatica wird der für den Stofftransport in Pflanzen benötigte Wasserstrom in den Leitbündeln trotz fehlender Transpiration vermutlich durch Guttation aufrecht erhalten (PEDERSEN & SAND-JENSEN 1997). Hierzu verfügt die Wasser-Minze über zahlreiche Hydathoden an den Blattzähnen ( leaf teeth ), spezielle Drüsen zur Wasserausscheidung, die transpirationsunabhängig sind. Je nachdem, inwieweit die Pflanze überflutet ist, kann sie an Luft oder an Wasser angepasste Blätter entwickeln. Der submerse Blatttyp zeichnet sich durch eine erhöhte CO 2 -Leitfähigkeit und einen niedrigeren CO 2 -Kompensationspunkt aus (SAND-JENSEN CHRISTENSEN 1999). & FROST- Für den minzigen Geruch dieser Pflanze sind ätherische Öle verantwortlich, die eine leichte antimikrobielle Wirkung aufweisen (MIMICA-DUKIC ET AL. 2003) und auch medizinische Anwendung finden. In Südafrika z.b. wird Mentha aquatica traditionell als Heilpflanze gegen Erkältungen, geistige Erkrankungen und zur Vertreibung böser Geister angewendet (POOLEY 2005). Tatsächlich konnte eine leicht psychoaktive Wirkung von Mentha aquatica nachgewiesen werden (STAFFORD ET AL. 2008), die auf die stimmungserhellende Wirkung von MAO-Hemmern, wie das in Mentha aquatica nachgewiesene Naringenin (OLSEN ET AL. 2008), und die Affinität zu GABA A -Rezeptoren zurückzuführen ist, welche einen seditativen (beruhigenden) Effekt bewirkt (JÄGER ET AL. 2007; LOPEZ ET AL. 2009). 47

69 Allgemeiner Methodenteil Mentha aquatica ist gynodiözisch: Neben zwittrigen Pflanzen, kommen auch rein weibliche Pflanzen mit kleineren Blüten vor (DÜLL & KUTZELNIGG 2005). Die Fortpflanzung von Mentha aquatica erfolgt sowohl generativ als auch vegetativ über Ausläufer. Verbreitung Die Wasser-Minze ist in Europa, Nordafrika, Nord- und Westasien heimisch und wurde in Nordamerika eingebürgert (HORWOOD 1919) MYRIOPHYLLUM AQUATICUM (VELLOSO) VERDCOURT Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Magnoliopsidae Haloragales Haloragaceae Myriophyllum Myriophyllum aquaticum (Synonyme: Myriophyllum brasiliense Cambessedes; Myriophyllum proserpinacoides Gillies ex Hooker & Arnott; Enydria aquatica Vellozo) Beschreibung Das Brasilianische Tausendblatt (Myriophyllum aquaticum), auch Papageienfeder genannt, ist ebenso wie die zuvor beschriebene Mentha aquatica eine dikotyle, amphibische Pflanze. Sie ist ein Vertreter der Gattung Myriophyllum mit ausgeprägter Heterophyllie. Sie vermag sowohl submerse als auch emerse Blätter auszubilden. Die einfach gefiederten Blätter sitzen in Wirteln meistens zu fünft am Stängel. Unter Wasser kann diese im Sediment wurzelnde Pflanze eine Länge von bis zu über einem Meter erreichen. Die submersen Blätter sind dabei feiner gefiedert als die emersen Blätter und ohne Stützgewebe. Die gelblich-grüne Farbe der submersen Blätter kann gelegentlich einen Rotstich erhalten (siehe Abbildung 16A). Erreicht die Pflanze die Wasseroberfläche, bildet sie emerse Blätter von einem bläulichen Grün aus (siehe Abbildung 16B). Diese emersen Blätter sind derber und wasserabweisend und werden, wenn sie untergetaucht werden, von einer zarten Lufthülle umgeben (siehe Abbildung 17). 48

70 Allgemeiner Methodenteil A B Abbildung 16: (A) Submers gewachsenes Blatt von Myriophyllum aquaticum. (B) Emerse Blattstände von Myriophyllum aquaticum. Verantwortlich für diesen sogenannten Lotuseffekt bei Myriophyllum aquaticum sind mikroskopisch kleine Wachsplättchen, die die Blattoberflächen bedecken (NEINHUIS & BARTHLOTT 1997). In im Rahmen der Arbeit durchgeführten Freilanduntersuchungen an Myriophyllum aquaticum (die aber in dieser Abhandlung nicht näher dargestellt werden) konnte beobachtet werden, dass diejenigen Pflanzen, die die Wasseroberfläche erreichten und emerse Bereiche ausbildeten, im Laufe des Sommers ihre submersen Blätter zurückentwickelten bzw. diese absterben ließen. An den submersen kräftigen Stängeln von teilweiser beträchtlicher Länge ragte dann einzig an der Sprossspitze ein Büschel emerser Blattquirle wie ein Pinsel aus dem Wasser, während der Rest der Pflanze kahl war. Pflanzen, die jedoch keine emersen Bereiche ausbildeten, behielten ihre submersen Blätter den ganzen Sommer über. Unter starker Sonneneinstrahlung kann eine purpurrote Verfärbung des Blattstängels eintreten. Abbildung 17: Lufthülle um untergetauchte emers gewachsene Blätter von Myriophyllum aquaticum. 49

71 Allgemeiner Methodenteil Bestimmung Anhand der emersen Blätter und ihrer charakteristischen bläulichgrünen Farbe lässt sich Myriophyllum aquaticum gut von anderen Arten dieser Gattung unterscheiden. Für Pflanzen in rein submersem Zustand ist die Bestimmung dagegen schwierig. Bislang gibt es keinen Bestimmungsschlüssel, der die Bestimmung von Myriophyllum aquaticum in rein submerser Ausprägung zulässt (HUSSNER 2008). Ökologie & Fortpflanzung Myriophyllum aquaticum ist eine amphibische Pflanze, die flache Binnengewässer mit einem weiten Spektrum von Tümpeln bis langsam fließende Gewässer besiedeln kann. Tiefen bis zu einem Meter werden favorisiert (MOREIRA ET AL. 1999), aber Myriophyllum aquaticum wurde auch schon in bis zu zwei Meter Tiefe angetroffen (WERSAL & MADSEN 2007). Ihr rasches Wachstum kann in flachen Gewässern zu Dominanzbeständen führen (MOREIRA ET AL. 1999), sodass dort andere höhere, einheimische Wasserpflanzen durch diesen Neophyten verdrängt werden können. In Deutschland scheint aber die invasive Gefahr, die von dieser Pflanze ausgeht, eher gering zu sein (HUSSNER 2008). Bei Myriophyllum aquaticum konnten allelopatische Substanzen nachgewiesen werden, die (mindestens) Blaualgen hemmen (SAITO ET AL. 1989). Sie ist eine diözische Pflanze. Allerdings wurden bislang außerhalb von Südamerika nur weibliche Blüten nachgewiesen (AIKEN 1981; ORCHARD 1979; ORCHARD 1981; ORCHARD 1985), sodass hier die Reproduktion ausschließlich vegetativ über Fragmentierung erfolgt. Myriophyllum aquaticum verfügt über eine beeindruckende Regenerationsfähigkeit gegenüber mechanischer Beschädigung. Verbreitung Die aus dem tropischen bis subtropischen Südamerika stammende Papageienfeder ist eine beliebte Aquarien- und Gartenteichpflanze und es wird vermutet, dass sie sich auf diesem Weg, als Aquarienflüchtling viele Länder auf der ganzen Welt erschließen konnte (HUSSNER 2008; LES & MEHRHOFF 1999). Sie kommt heute außer in (Nord- und Süd-) Amerika auch in vielen Ländern Europas, Asiens, Afrikas und in Australien vor (siehe HUSSNER 2008). Während die (sub-) tropische Myriophyllum aquaticum milde Winter in den gemäßigten Klimazonen erträgt, schafft sie es nicht, lang anhaltende Frostperioden zu überdauern (AIKEN 1981; CESKA & CESKA 1985; LES & MEHRHOFF 1999). 50

72 Allgemeiner Methodenteil RICCIA FLUITANS L. Systematik Abteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Marchantiophyta Hepaticae Ricciales Ricciaceae Riccia Riccia fluitans Beschreibung Das Flutende Teichlebermoos oder auch Untergetauchtes Sternlebermoos (Riccia fluitans) ist ein frei schwimmendes Wasserlebermoos ohne Rhizoide, dessen Thalli mehrfach gegabelt sind. Abbildung 18: Riccia fluitans. Bestimmung Es gibt in Europa 30 verschiedene Spezies der Gattung Riccia (über 100 weltweit), von denen einige auch im Wasser oder auf ausgetrockneten Gewässern vorkommen. Hier soll nur auf die Unterscheidung der drei submersen Spezies R. fluitans, R. rhenana und R. duplex eingegangen werden (nach FRAHM & FREY 1992). Während der Thallus von R. fluitans und R. rhenana an den Enden etwas verbreitert und deutlich gefeldert ist, weist der Thallus von R. duplex stumpf zugespitze Enden ohne deutliche Felderung auf. Diese Felder an den Astspitzen sind bei R. fluitans mit bis zu 0,3 mm Länge kleiner als die von R. rhenana. Ein weiteres Bestimmungsmerkmal ist die Gabelung der Äste, die bei R. fluitans spitzwinklig und bei R. rhenana stumpfwinklig ausfällt. Eine sichere 51

73 Allgemeiner Methodenteil morphologische Unterscheidung von R. fluitans und R. rhenana ist allerdings nur in der Landform möglich, zumal hier eine taxonomische Trennung von R. rhenana, die sich durch einen doppelten Chromosomensatz zu R. fluitans unterscheidet, umstritten ist (NEBEL & PHILIPPI 2005). Ökologie & Fortpflanzung Riccia fluitans ist nur in der Lage CO 2 als anorganische Kohlenstoffquelle zu nutzen und damit entsprechend ph-abhängig (BALLESTEROS ET AL. 1998). Bei ph 5,5 konnte BALLESTEROS ET AL. (1998) eine 10mal stärkere Photosyntheserate bei Riccia fluitans als bei einem ph-wert von 7 messen. Riccia fluitans ist ein poikilohydrisches Moos. Bei Trockenfallen bildet es eine kleinere Landform aus und kann so längere Trockenzeiten von über einem halben Jahr überstehen (DÜLL 1993). Die Vermehrung scheint überwiegend vegetativ zu sein. Bei Experimenten zur sexuellen Reproduktion von Riccia fluitans konnte zwar die Bildung des weiblichen Gametangiums, das Archegonium, induziert werden, aber nicht das männliche Antheridium (SELKIRK 1979). Verbreitung Riccia fluitans ist ein Kosmopolit, der in stehenden, meist nährstoffärmeren und sauberen Gewässern vorkommt (DÜLL 1993), seltener auch als Landform auf temporär überschwemmten Schlammböden (FRAHM & FREY 1992) SALVINIA NATANS L. Systematik Abteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Pteridophyta Pteridodopsida Salviniales Salviniaceae Salvinia Salvinia natans Beschreibung Der Gewöhnliche Schwimmfarn (Salvinia natans) ist ein frei auf der Wasseroberfläche schwimmender Wasserfarn (Hydropterides), der reich verzweigt kleinere Matten ausbilden kann. Die Blätter stehen in dreizähligen Quirlen, wobei zwei Blätter jeweils als 52

74 Allgemeiner Methodenteil Schwimmblätter ausgebildet sind, die sich gegenüber stehen, während ein Blatt morphologisch derart umgewandelt ist, dass es als Wurzel fungiert. Dieses wurzelähnliche bräunliche Blatt ragt fein zerteilt in den Wasserkörper. Die beiden grünen Schwimmblätter eines Quirls sind elliptisch bis nahezu rundlich mit einer kleinen herzförmigen Einkerbung am Blattansatz. Auf der Blattunterseite sind die Härchen eher bräunlich (siehe Abbildung 19A), auf der Blattoberseite (siehe Abbildung 19B) sind die Härchen bzw. Papillen hell und wasserabweisend, sodass beim Untertauchen eine Luftschicht auf der Blattoberseite verbleibt, die für entsprechenden Auftrieb sorgt. An der Basis der submersen Blätter können sich die Sporokarpien bilden. Alle Salvinia-Arten haben keine echten Wurzeln. A B Abbildung 19: (A) Unterseite und (B) Oberseite von Salvinia natans unter ~4facher Vergrößerung. Bestimmung Salvinia natans ist die einzige heimische Art dieser Gattung und in seiner Gestalt unverwechselbar. Der aus Amerika stammende Rundblättrige Schwimmfarn (Salvinia auriculata) (genau genommen handelt es sich hierbei um einen Komplex, der mindestens 4 verschiedene Arten umfasst (siehe MITCHELL & THOMAS 1972)) kann gelegentlich als Aquariums- oder Gartenteichflüchtling in Deutschland auftreten und somit zu Verwechslungen führen. Während beim Salvinia auriculata-komplex die Haare an der Blattspitze am Ende verbunden sind, sind sie es nicht bei S. natans (VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007). Ökologie & Fortpflanzung Die dünne Epidermis des wurzelähnlichen Blattes verfügt über keine Cuticula und ist mit unzähligen absorbierenden Härchen ausgestattet (BERCU 2006), die die Oberfläche extrem vergrößern. Die Oberflächenvergrößerung des Blattes und das Fehlen der Cuti- 53

75 Allgemeiner Methodenteil cula lässt auf Nährstoffversorgung als Hauptfunktion dieser Blattmetamorphosen schließen (siehe auch GAUDET 1973). Salvinia vermehrt sich sowohl vegetativ als auch generativ, wobei die generative Vermehrung von geringerer Bedeutung ist (MITCHELL & THOMAS 1972). Wie alle Wasserfarne ist Salvinia heterospor (BRESINKSKY ET AL. 2008), das heißt, dass die männlichen sogenannten Mikrosporen kleiner als die weiblichen Megasporen sind. Verbreitung Der Gewöhnliche Schwimmfarn kommt in ruhigen, windgeschützten Gewässern, wie z.b. Altwasserbuchten, vor (OBERDORFER 1983). In Mitteleuropa ist Salvinia natans mittlerweile selten geworden und steht in Deutschland auf der Roten Liste als stark gefährdet (KORNECK ET AL. 1996) VALLISNERIA SPIRALIS L. Systematik Abteilung: Unterabteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung: Art: Spermatophyta Magnoliophytina (Angiospermae) Liliopsida Hydrocharitales Hydrocharitaceae Vallisneria Vallisneria spiralis Beschreibung Die Wasserschraube (Vallisneria spiralis) ist eine monokotyle, submerse, im Sediment wurzelnde Wasserpflanze. Ihre langen, breit-linealen Blätter sitzen rosettenförmig am Grund und geben der Pflanze das Aussehen eines Unterwassergrases. Über Ausläufer, die in der Schlammschicht verborgen sind, können mehrere Tochterpflanzen mit der Mutterpflanze verbunden sein. Der Perianth der weibliche Blüte besitzt einen äußeren Ring von 3 Kelchblättern (Sepalen) und einen inneren Ring von 3 rudimentären Kronblätter (Petalen). Die männlichen Blüten weisen dagegen nur ein rudimentäres Kronblatt zwischen den beiden größeren Sepalen auf. 54

76 Allgemeiner Methodenteil Abbildung 20: Vallisneria spiralis. Bestimmung Da die Gattung Vallisneria sich durch eine hohe phänologische Plastizität auszeichnet und die taxonomische Diversität in der Vergangenheit unklar war (COOK ET AL. 1974; COOK 1996; LOWDEN 1982), ist eine sichere Bestimmung ausschließlich anhand morphologischer Merkmale kritisch zu betrachten. LES ET AL. (2008) konnten kürzlich 12 Vallisneria-Arten anhand molekularer Daten und zusätzlich 2-3 Spezies anhand morphologischer Daten unterscheiden. Obwohl Bestände von Vallisneria americana noch nicht in Deutschland nachgewiesen wurden (VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007), soll dennoch an dieser Stelle auf die Unterscheidung von V. spiralis und V. americana eingegangen werden, da V. americana ebenso wie V. spiralis eine beliebte Aquarienpflanze ist und oft im Wasserpflanzenhandel angeboten wird. Bestimmungsmerkmale nach VAN DE WEYER & SCHMIDT (2007) und CASPER & KRAUSCH (1980) sind in Tabelle 4 gelistet. Tabelle 4: Unterscheidungsmerkmale für Vallisneria spiralis und Vallisneria americana nach van DE WEYER & SCHMIDT (2007) und CASPER & KRAUSCH (1980). Merkmal V. spiralis V. americana Länge der Spatha (Blütenscheide) 6-9 mm mm Länge des Stiels der Spatha mm 2-20 (45) mm Breite des Stiels der Spatha 0,5-1,2 mm 2-3 mm Staubblätter schräg verlängert aufrecht Haare an der Basis des Androceums nein ja Gefranste Narben ja nein 55

77 Allgemeiner Methodenteil Außerdem beträgt nach eigenen Beobachtungen die Breite der Blätter von V. spiralis 0,5-1 cm, während die Blätter von V. americana mit etwa 2,5 cm deutlich breiter ausfallen. Zur Bestimmung der Varietäten sei auf LOWDEN (1982) verwiesen. Gegenüber anderen Gattungen grundständiger Makrophyten mit langen, flutenden Blättern (sogenannte Vallisneriden) kann Vallisneria spiralis durch die leichte Zähnung an der Blattspitze erkannt werden. Ökologie & Fortpflanzung Die Gewöhnliche Wasserschraube besitzt eine breite ökologische Amplitude und kommt in Still- und in Fließgewässern bis 1 m Tiefe vor (HUSSNER 2008). Sie ist eine diözische Pflanze und vermag sich sowohl generativ durch Bestäubung an der Wasseroberfläche als auch vegetativ über Ausläufer im Sediment zu vermehren (WYLIE 1917). Verbreitung Vallisneria spiralis ist eine kosmopolitisch in den Subtropen und Tropen vorkommende Pflanze, die in Amerika, Asien, Afrika und Südeuropa heimisch ist (HUSSNER 2008). Sie ist eine beliebte Aquarienpflanze mit langer Tradition (siehe Abbildung 21) und entsprechendem Potential aus der Kultur in die freie Wildbahn zu gelangen. Abbildung 21: Zeichnung eines Aquariums aus dem 19. Jahrhundert mit u.a. Vallisneria spiralis (Quelle: HIBBERD 1856). 56

78 Allgemeiner Methodenteil 2.3 IN DER ARBEIT VERWENDETE FLUORESZENZ-MESSTECHNIKEN ENTSTEHUNG DER CHLOROPHYLLFLUORESZENZ Die Voraussetzung für die photosynthetische Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie in Form von Kohlenstoffverbindungen ist zunächst die Absorption des Lichts. Diese findet in den Pigment-Protein-Komplexen (sogenannte Photosysteme) photoautotropher Organismen statt. Höhere Pflanzen besitzen zwei Photosysteme, das Photosystem I und das Photosystem II, die durch eine Elektronentransportkette miteinander verbunden sind. Eingebettet in der Thylakoidmembran der Chloroplasten setzt sich jedes Photosystem aus einem Antennenkomplex und einem Reaktionszentrum zusammen. Die Pigmente des Antennenkomplexes, bestehend aus Molekülen Chlorophyll a, Chlorophyll b und Carotinoiden, sind in der Lage Photonen zu absorbieren und die Energie auf benachbarte Pigmente zu übertragen (Resonanz- Energieübertragung). So gelangt die Energie des absorbierten Lichts der Antennenpigmente zu dem Chlorophyll a-molekül-paar des Reaktionszentrums, wo es photochemisch genutzt werden kann (RAVEN ET AL. 2006). Bei der Absorption von Licht durch Pigmentmoleküle werden Elektronen auf ein höheres Energieniveau gehoben bzw. es werden weiter außenliegende Orbitale (Singulettzustände) eingenommen. Das Molekül geht in einen angeregten Zustand über, der extrem kurzlebig ist. Wird ein energiereiches Photon aus dem Blaulichtbereich absorbiert, wird das Elektron in das Orbital des Singulettzustand S 2 gehoben, aus dem es sofort wieder unter Abgabe von Wärme in das energieärmere Orbital des Singulettzustandes S 1 zurückfällt. Bei der Absorption eines Photons aus dem energieärmeren roten Spektralbereich erreicht das Elektron nur das Orbital des Singulettzustandes S 1. Von diesem Singulettzustand aus beginnt die photochemische Primärreaktion (KUTSCHERA 2002). Fällt das Elektron wieder auf den Grundzustand S 0 zurück, weil es nicht auf einen Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette übertragen wurde, wird die Energie als Wärme oder Fluoreszenzlicht wieder abgegeben. Dieser theoretische Hintergrund zu Lichtabsorption und Fluoreszenz wird anhand der Abbildung 22 verdeutlicht. 57

79 Allgemeiner Methodenteil Abbildung 22: Schematische Darstellung des Zusammenhangs Lichtabsorption und Chlorophyllfluoreszenz verändert nach KUTSCHERA (2002). Lichtenergie, die von Chlorophyll-Molekülen der Pflanzen absorbiert wird, kann demnach drei unterschiedliche Schicksale erfahren: Sie kann für photosynthetische Arbeit (photochemistry) genutzt werden oder als überschüssige Energie wieder in Form von Wärme (heat dissipation) oder Licht (chlorophyll fluorescence) abgegeben werden (siehe auch Abbildung 23). Die drei genannten Prozesse stehen zueinander in Konkurrenz, sodass ein Anstieg des Ausmaßes eines Prozesses zum Sinken des Ausmaßes der anderen beiden führt. Die letztgenannte Chlorophyll-Fluoreszenz beträgt etwa 1-2% des absorbierten Lichts (MAXWELL & JOHNSON 2000) und wird als prompte und verzögerte Fluoreszenz emittiert (GERHARDT & BODEMER 1999). Dabei ist das Spektrum des emittierten Lichts von dem des absorbierten Lichts verschieden. Das Licht der Chlorophyll-Fluoreszenz wird immer im roten Spektralbereich zwischen 650 und 780 nm emittiert (GERHARDT & BODEMER 1999), da die Elektronen immer nur vom Singulettzustand S 1 auf S 0 zurückfallen. Bei Algen liegt die Chlorophyllfluoreszenz-Emission um 685 nm (FALKOWSKI & RAVEN 2007). Chlorophyllfluoreszenz stammt nahezu ausschließlich von Chlorophyll a-molekülen, da die Energie angeregter Chlorophyll b-moleküle mit hoher Effizienz an diese übertragen wird (ROHACEK & BARTAK 1999). Bei der prompten Fluoreszenz sind fast nur Chlorophyll a-moleküle aus dem Antennenkomplex des Photosystems II beteiligt (GERHARDT & BODEMER 1999). Die Chlorophyllmoleküle des Photosystems I emittieren kaum Fluoreszenzlicht (HENRIQUEZ 2009). Allerdings steigt bei hoher Wellenlänge über 700 nm der Anteil des Photosystems I an der 58

80 Allgemeiner Methodenteil Abbildung 23: Schicksal des vom Chlorophyll absorbiertem Licht nach WALZ (1996). Chlorophyllfluoreszenz bis auf 30 bis 50% (PFÜNDEL 1998). Bei der Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz muss außerdem beachtet werden, dass die ermittelten Werte nur relativ sind, da immer Licht verloren geht (MAXWELL & JOHNSON 2000) CHLOROPHYLL-FLUORESZENZ-MESSUNGEN MIT DER PAM-TECHNIK Die Puls Amplituden-Modulierte (PAM) Messtechnik ermöglicht das Messen der prompten Chlorophyll-Fluoreszenz bei (Tages-) Licht, in dem die Lichtquelle, die zur Anregung der Chlorophyll-Moleküle verwendet wird, moduliert ist. Das heißt, das Licht wird mit hoher Frequenz ein- und ausgeschaltet. Der Detektor eines PAM-Gerätes erfasst nur die Fluoreszenz, die durch dieses modulierte Licht angeregt wurde. Somit kann die Hintergrundbeleuchtung (background illumination) ausgeblendet werden (MAXWELL & JOHNSON 2000). Wird eine Pflanze aus der Dunkelheit ins Licht gestellt, steigt in der ersten Sekunde die Chlorophyll-Fluoreszenz stark an, da die Reaktionszentren des PSII noch geschlossen sind (MAXWELL & JOHNSON 2000). Darauf sinkt die Chlorophyll-Fluoreszenz wieder und nach 15 bis 20 Minuten wird ein Dauerzustand (steady-state) F t erreicht (Kautsky-Kinetik). Das Abfallen der Chlorophyll-Fluoreszenz basiert auf Fluoreszenzlöschung (fluorescence quenching) und ist auf zwei grundlegend unterschiedliche Prozesse zurückzuführen. Einerseits werden zunehmend Elektronen vom PSII über die Elektronentransportkette zum PSI abgeleitet, da das Licht eine Aktivierung der dabei beteiligten Enzyme und die Öffnung der Stomata induziert (MAXWELL & JOHNSON 2000). Dieser Prozess wird photochemische 59

81 Allgemeiner Methodenteil Löschung (photochemical quenching) genannt. Gleichzeitig steigt aber auch die Umwandlung der Lichtenergie in Wärme. Dieser Prozess wird nicht-photochemische Löschung (non-photochemical quenching) genannt wird (siehe auch BRADBURY & BAKER 1983). Mit der Sättigungs-Puls-Methode (saturation pulse method), die bei dem in dieser Arbeit benutztem Gerät Anwendung findet, wird ein sehr starker Lichtimpuls abgegeben, der die komplette Elektronentransportkette zwischen den beiden Photosystemen durchreduziert und zu einem Elektronenstau führt. Absorbierte Lichtenergie kann in diesem Moment nicht den photochemischen Weg bestreiten, sodass das photochemische Löschen 0 beträgt und bei unverändertem nichtphotochemischem Löschen, die Energie, die normalerweise photosynthetisch genutzt wird, als Chlorophyll-Fluoreszenz verloren geht. Dieser Wert wird als maximale Fluoreszenz (maximum fluorescence) F m` bezeichnet. Über die beiden Parameter F t und F m` lässt sich die effektive Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung des Photosystems II berechnen (siehe Kapitel ). Der von GENTY ET AL. (1989) eingeführte Term ist ein Maß für die Effektivität des Photosystems II. Führt Stress, z.b. durch Xenobiotika verursacht, zu einer Verringerung der Effektivität des Photosystems II, kann mit der Quantenausbeute des PSII das relative Ausmaß der Beeinträchtigung erfasst werden. Die Quantenausbeute des PSII korreliert dazu linear zu Sauerstoffproduktion und CO 2 -Assimilation unter vielen Bedingungen (GENTY ET AL. 1992; HARBINSON ET AL. 1990; HENRIQUES 2009) und eignet sich daher als guter Indikator für die Photosyntheseleistung einer Pflanze und findet bereits Anwendung in zahlreichen ökotoxikologischen Untersuchungen (z.b. CONRAD ET AL. 1993; KÜSTER & ALTENBURGER 2007; MARWOOD ET AL. 2001; MARWOOD ET AL. 2003; RITZENTHALER 2006; SNEL ET AL. 1998; VERVLIET SCHEEBAUM 2006) ENTSTEHUNG DER VERZÖGERTEN FLUORESZENZ Bei der prompten Fluoreszenz emittiert das durch aktinisches Licht angeregte Chlorophyll a-molekül das rote Fluoreszenzlicht, bevor diese Energie für photochemische Reaktionen genutzt wird. Diese erlischt einige Nanosekunden, nachdem die Lichtquelle ausgeschaltet wurde (KRAUSE & WEIS 1991). Neben der prompten Fluoreszenz gibt es noch die oben erwähnte verzögerte Fluoreszenz (delayed fluorescence oder DF), die noch mehrere Minuten nach Ausschalten der Lichtquelle als Nachleuchten (mit der entsprechenden Technik) zu beobachten ist. Die verzögerte Fluoreszenz kommt zustande, weil alle Redox-Reaktionen der Elektronentransportkette reversibel sind und nach Ausschalten der Lichtquelle ein Zurückwandern der Elektronen eintritt, das je nach Lage der Elektronen in der Elektronentransportkette unterschiedlich lange dauert (GOLTSEV ET AL. 2009). Dieser Umstand führt zu einer sekundären Anregung des oxidierten Chlorophyllmoleküls im Reaktionszentrum des Photosystems II und einer entsprechen- 60

82 Allgemeiner Methodenteil den Fluoreszenz, wenn dieses wieder in den S o -Zustand zurück fällt. Die verzögerte Fluoreszenz dauert so lange an, bis ein Ladungsgleichgewicht zwischen Donorseite (Innenseite der Thylakoidmembran) und Akzeptorseite (Außenseite der Thylakoidmembran) durch diesen Rückfluss wieder hergestellt ist (GERHARDT & BODEMER 2001). Die Abbildung 24 veranschaulicht diese Prozesse. Abbildung 24: Schematische Darstellung zur Entstehung der verzögerten Fluoreszenz (Quelle: GERHARDT & BODEMER 2001). An der verzögerten Fluoreszenz sind im Gegensatz zur prompten Fluoreszenz keine Antennenpigmente beteiligt (GERHARDT & BODEMER 1999). Dies gewährleistet, dass nur lebende photosynthesebetreibende Zellen durch DF-Messungen erfasst werden (siehe KRAUSE ET AL. 1984), während die prompte Fluoreszenz auch Chlorophyllmoleküle erfasst, die nicht mehr in einem intakten Photosystem eingebunden sind VERZÖGERTE FLUORESZENZ-ANREGUNGSSPEKTROMETRIE Mit dem Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometer bzw. dem DF-Anregungsspektrometer ist eine Differenzierung verschiedener Algentaxa einer Wasserprobe auf der Basis verzögerter Fluoreszenz möglich (GERHARDT & BODEMER 1998; GERHARDT & BODEMER 1999; GERHARDT & PUTZGER 1991). Dazu werden vorverdunkelte Wasserproben kontinuierlich in eine Anregungskuvette gepumpt, wo sie mit monochromatischem Licht in 2 nm Abständen im Bereich des sichtbaren Lichts von 400 bis 730 nm 61

83 Allgemeiner Methodenteil bestrahlt werden, um darauf weiter in eine Emissionskuvette gepumpt zu werden (siehe Abbildung 25). Dort werden mit einem Photomultiplier die Anzahl der Photonen erfasst, die durch verzögerte Fluoreszenz emittiert werden. Es wird die Abklingkinetik der verzögerten Fluoreszenz in einem Zeitbereich von 0,2 bis 1 s nach Anregung durch das monochromatische Licht gemessen (GERHARDT & BODEMER 1999). Auf diese Weise kann die DF-Antwort den unterschiedlichen Wellenlängen zugeordnet und über eine Software die Kallibrations-Spektren der Algenklassen berechnet werden (siehe Abbildung 26). Dies ist möglich, da die unterschiedlichen Algengruppen unterschiedliche Pigmentzusammensetzungen mit unterschiedlichen Absorptions-Spektren aufweisen und die Software auf eine große Datenbank an Absorptions-Spektren einzelner Algentaxa zurückgreift. Auf diese Weise kann sowohl der Chlorophyll-Gehalt des Phytoplanktons als auch dessen Zusammensetzung, einer Wasserprobe bzw. eines Testmediums, ermittelt werden (siehe auch YACOBI ET AL. 1998). Da Algen und Makrophyten sowohl über Konkurrenz als auch Allelopathie in Interaktion treten (siehe oben), können mit Hilfe der DF-Anregungsspektroskopie wertvolle Informationen gewonnen werden, die zur Beurteilung der Validität eines Makrophytentests herangezogen werden können. Abbildung 25: Schematischer Aufbau des Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometers nach BODEMER 1996 (Quelle: GERHARDT & BODEMER 1999). 62

84 Allgemeiner Methodenteil Abbildung 26: Kallibrations-Spektren der verschiedenen Algengruppen ermittelt nach Messungen eines Verzögerte Fluoreszenz-Anregungsspektrometers. 63

85 Biotestentwicklung I 3 BIOTESTENTWICKLUNG I: VERGLEICH VON NATÜRLICHEM TEICHWASSER UND MIT NÄHRSTOFFEN ANGEREICHERTEM TEICHWASSER ALS TESTMEDIUM FÜR BIOTESTS MIT CERATOPHYLLUM DEMERSUM, ELODEA NUTTALLII UND RICCIA FLUITANS UNTER VERSCHIEDENEN LICHTBEDINGUNGEN 3.1 ZIELSETZUNG Die Voraussetzung für das Gelingen eines Biotests mit (Wasser-)Pflanzen ist, (reproduzierbare) Bedingungen zu schaffen, die ein gesundes Pflanzenwachstum ermöglichen. Neben dem geeigneten Licht- und Temperaturregime ist die Nährstoffverfügbarkeit essentiell für das Pflanzenwachstum. Ziel dieses Versuches war es, geeignete Bedingungen hinsichtlich Licht- und Nährstoffansprüchen der drei submersen Makrophyten Ceratophyllum demersum, Elodea nuttallii und Riccia fluitans zu evaluieren. Hierzu wurde das Wachstum der Pflanzen in nährstoffarmem Teichwasser (Medium I) mit dem in mit Nährstoffen angereichertem Teichwasser unter Laborbedingungen verglichen. Dabei wurde ein Testmedium mit einer geringen Konzentration (Medium II), ein anderes mit einer hohen Konzentration (Medium III) an Nährstoffen angereichert. In einem ersten Versuchsdurchgang wurden die drei Makrophyten in den drei Testmedien unter hohen Lichtbedingungen (8000 Lux) gehalten, in einem zweiten Versuchsdurchgang wurden schwächere Lichtbedingungen (5000 Lux) eingestellt. Ein optimales Versuchsdesign ermöglicht nicht nur ein gutes Wachstum der Testorganismen, sondern minimiert auch das Potential von Algenentwicklungen in den Testsystemen, da die Algen das Makrophytenwachstum hemmen und ihre Vitalität herabsetzen können. SZABO ET AL. (1998) konnten z.b. in Labortests eine durch Algen hervorgerufene Chlorophyllabnahme in den Fronds von Lemna gibba von 21-64% nachweisen. Da eine sterile Kultivierung der meisten Makrophyten nur mit einem erheblichen Aufwand möglich ist, besteht immer die Gefahr der übermäßigen Algenbildung in den Testsystemen. Daher war neben dem Pflanzenwachstum der Testorganismen auch die Phytoplanktonentwicklung in den Medien von Interesse. Welche Bedingungen führen in den Testsystemen zu einem starken Algenwachstum, wie sieht die zeitliche Dynamik der Algenentwicklung aus und um welche Algengruppen handelt es sich überhaupt? Um diese Fragen zu beantworten, wurden während des Versuchszeitraumes in wöchentlichen Abständen Phytoplanktonanalysen mit einem DF-Anregungsspektrometer (siehe Kapitel 2.3.4) durchgeführt. 64

86 Biotestentwicklung I 3.2 MATERIAL & METHODEN TESTORGANISMEN Für diesen Versuch wurden die submersen Makrophyten Ceratophyllum demersum, Elodea nuttallii und Riccia fluitans als Testorganismen verwendet. C. demersum und E. nuttallii stammen aus einem künstlichen Teich im Freiland, der für die Kultivierung verschiedenster Makrophyten im Rahmen dieser Arbeit angelegt wurde. Ursprünglich entstammen sie aus einem Baggersee bei Kirchhain (Hessen). Vor Versuchsbeginn wurden die Testorganismen einige Wochen im Labor in Aquarien mit natürlichem Teichwasser gehalten. Riccia fluitans ist eine reine Laborkultur, die ebenso in natürlichem Teichwasser gehalten wurde und aus dem Botanischen Garten Frankfurt (Hessen) stammt. Die Bestimmung der Arten wurde mit einschlägiger Bestimmungsliteratur durchgeführt (ROTHMALER 2000; SCHMEIL 1996; VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007) VERSUCHSAUFBAU Es wurden 2 Testreihen mit jeweils unterschiedlichen Lichtintensitäten (siehe unten) zeitlich hintereinander durchgeführt. Die erste Testreihe mit hoher Lichtintensität wird im Folgenden HL, die zweite Versuchsreihe mit mittlerer Lichtintensität ML genannt. Die Versuche wurden in einer Wachstumskammer aus Glas mit einem Volumen von 450 L durchgeführt. Die Innenwände und der Boden wurden von außen mit Aluminiumfolie beklebt, um Lichtverluste durch Reflexion zu minimieren und Lichteinfall von außerhalb auszuschließen. Die Abdeckung der Wachstumskammer wies ein Beleuchtungssystem mit 12 (HL) bzw. 6 (ML) Energiesparlampen (Sylvania CF-D18W/840) auf. Die Wachstumskammern wurden auf eine Höhe von ca. 8 cm mit entionisiertem Wasser aufgefüllt. Die Temperatur dieses Wassers wurde über einen Heizstab (JBL Pro Temp 100 W) reguliert. Eine Tauchpumpe (JBL Proflow mini 400) neben dem Heizstab sorgte für eine homogene Verteilung des erwärmten Wassers in der Wachstumskammer. Die Testorganismen C. demersum und E. nuttallii wurden in 2 L Bechergläser (hohe Passform; 12 cm Durchmesser) mit 1750 ml Medium gesetzt. R. fluitans wurde in 400 ml Bechergläser (hohe Passform; 7 cm Durchmesser) mit 350 ml Medium gesetzt. Bei C. demersum und E. nuttallii wurde je Becherglas eine Testpflanze, bei R. fluitans 0,2 g eingesetzt. Die Bechergläser wurden für den Versuch in das temperierte Wasserbad der Wachstumskammer gestellt. Die Bechergläser von R. fluitans wurden in dem Wasser auf ein PVC-Gittergestell gestellt, um ein Eindringen des Wasserbades in die Bechergläser auszuschließen. Die Abbildung 27 soll den Versuchsaufbau in der Wachs- 65

87 Biotestentwicklung I tumskammer veranschaulichen. Pro Testreihe wurden die drei Pflanzen in den drei Testmedien mit 3 Replikaten untersucht. Licht Licht Glas Becherglas Entionisiertes H 2 O PVC-Gestell Pumpe Heizstab R. fluitans C. demersum & E. nuttallii Testpflanze Testmedium Abbildung 27: Schematischer Aufbau der Wachstumskammer LICHT & TEMPERATUR In diesem Versuch wurden 2 Lichtverhältnisse untersucht. In dem ersten Ansatz (HL) betrug die Lichtintensität ca Lux, im 2. Ansatz (ML) wurde die Lichtintensität auf ca Lux reduziert. Die Lichtintensitäten wurden regelmäßig mit einem Luxmeter (LXOIOBS LX1010BS) überprüft. Während des Versuchszeitraumes wurden die Bechergläser alle 2-3 Tage nach einem Rotationsprinzip umgesetzt, um möglichen Inhomogenitäten der Lichtintensität innerhalb der Wachstumskammer Rechnung zu tragen. Per Zeitschaltuhr wurde ein Licht-Dunkel-Rhythmus von 16 h:8 h eingestellt. Die Temperatur des Wassers betrug während des Versuches 21 +/- 2,5 C und wurde mit einem digitalen Min/Max-Thermometer überprüft MEDIUM In dem Versuch wurden drei verschiedene Medien getestet. Medium I war reines nährstoffarmes Teichwasser aus einem Folienteich ohne Sediment. Dem Medium II und dem Medium III wurden Nährstoffe in Form von Stammlösungen zugefügt, die für die Herstellung des Steinberg-Mediums verwendet werden (nach ISO/DIS ). Dabei wurde für Medium II ein Zehntel der Menge an Stammlösungen gewählt, die zur Herstellung von Steinberg-Medium nötig gewesen wären. Medium III wurde exakt die Menge an Stammlösung zugegeben, die für Steinberg-Medium verwendet wird. Die 66

88 Biotestentwicklung I Zusammensetzung der Stammlösungen und deren Konzentration in den unterschiedlichen Testmedien ist der Tabelle 5 zu entnehmen. Das Teichwasser wurde mit einem Analysesieb mit einer Maschenweite von 63 µm gesiebt. Während des Versuches verdunstetes Medium wurde 1 mal wöchentlich mit gesiebtem Teichwasser wieder auf 1750 ml bzw. 350 ml aufgefüllt. Tabelle 5: Zusammensetzung der Nährstoff-Stammlösungen für das Steinberg-Medium nach ISO/DIS (2003) und deren Konzentration in den Testmedien. Medium I Medium II Medium III Stammlösung 1 0 ml/l 2 ml/l 20 ml/l KNO 3 17,5 g/l 0 g/l 0,035 g/l 0,35 g/l KH 2 PO 4 4,5 g/l 0 g/l 0,009 g/l 0,09 g/l K 2 HPO 4 0,63 g/l 0 g/l 0,00126 g/l 0,0126 g/l Stammlösung 2 0 ml/l 2 ml/l 20 ml/l MgSO 4 *7H 2 O 5 g/l 0 g/l 0,01 g/l 0,1 g/l Stammlösung 3 0 ml/l 2 ml/l 20 ml/l Ca(NO 3 ) 2 *4H 2 O 14,75 g/l 0 g/l 0,0295 g/l 0,295 g/l Stammlösung 4 0 ml/l 0,1 ml/l 1 ml/l H 3 BO 3 0,120g/L 0 g/l 0,0120 mg/l 0,120 mg/l ZnSO 4 *7H 2 O 0,18 g/l 0 g/l 0,018 mg/l 0,18 mg/l Na 2 Mo O 4 *2H 2 O 0,044 g/l 0 g/l 0,0044 mg/l 0,044 mg/l MnCl 2 *4H 2 O 0,180 g/l 0 g/l 0,0180 mg/l 0,180 mg/l Stammlösung 5 0 ml/l 0,1 ml/l 1 ml/l FeCl 3 *6H 2 O 0,76 g/l 0 g/l 0,076 mg/l 0,76 mg/l Titriplex3 (EDTA) 1,5 g/l 0 g/l 0,15 mg/l 1,5 mg/l VERSUCHSDAUER Die Versuchsdauer betrug je Testreihe 4 Wochen. 67

89 Biotestentwicklung I NÄHRSTOFF-ANALYTIK Vor Versuchsbeginn wurde mit einem Spektralphotometer (PhotoLabSpectral der Firma WTW) das gesiebte Teichwasser unter Verwendung von Schnellkuvettentests auf die Stickstoffverbindungen Nitrat (NO 3 ), Nitrit (NO 2 ) und Ammonium (NH 4 ) sowie Gesamt-Phosphat und Sulfat (SO 4 ) analysiert. Ferner wurde mit dem Spektralphotometer die Gesamthärte des Teichwassers bestimmt MONITORING DER CHEMISCH-PHYSIKALISCHEN PARAMETER Mit einem WTW Multiparameter Messgerät (Multi 197i) wurden die physikalischen Parameter Sauerstoffgehalt (Sauerstoffsensor CellOx 325), ph-wert (ph- Einstabmesskette SinTex 61) und Leitfähigkeit (Leitfähigkeitsmeßzelle TetraCon 325) der Medien gemessen. Diese Parameter wurden zu Beginn und zum Ende der Studie aufgenommen. Ferner wurden sie alle 2-3 Tage gemessen, um etwaige Störungen oder Besonderheiten in den Testsystemen aufzudecken ERFASSUNG DER WACHSTUMSPARAMETER Zu Beginn der Studie und dann im wöchentlichen Abstand wurde das Frischgewicht der Testorganismen bestimmt. Bei C. demersum und E. nuttallii wurde zusätzlich die Sprosslänge vermessen. Zur Ermittlung der Wachstumsparameter wurden die Testorganismen aus dem Medium entnommen und vorsichtig mit Papiereinwegtüchern trocken getupft, bis die Papiertücher keine Feuchtigkeit mehr aufnahmen. Nach dem Messvorgang wurden die Pflanzen wieder zurück in ihr Medium gesetzt. Die Ermittlung des Frischgewichtes erfolgte über eine digitale Tafelwaage (Kern GS LMOM 1203) mit einer Genauigkeit von d=0,01 g. Die Ermittlung der Sprosslänge erfolgte mit Hilfe eines Lineals. Hier wurde auf 0,5 cm Einheiten gerundet ERFASSUNG DES PHYTOPLANKTONS IM MEDIUM Parallel zur Bestimmung der Wachstumsparameter wurde im gleichen Messintervall (wöchentlich) die Phytoplanktondichte und Phytoplanktonzusammensetzung der Medien von C. demersum und E. nuttallii per verzögerter Fluoreszenz analysiert (nach GERHARDT & BODEMER 1999; KRAUSE & GERHARDT 1984; KRAUSE ET AL. 1984). Das hierfür genutzte DF-Spektrometer ist ein Prototyp, der an der Universität Regensburg, Fachbereich Physik entwickelt wurde (KRAUSE & GERHARDT 1984). Hierzu wurden jeweils 350 ml des Mediums entnommen und in ein spezielles Verdunkelungsgefäß 68

90 Biotestentwicklung I überführt. Da die verzögerte Fluoreszenz stark temperaturabhängig ist, wurden die Proben in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 21 C eingestellt. Daraufhin wurde der Probe ein Rührfisch zugegeben, mit einem speziellen Verschluss verdunkelt und auf einen Magnetrührer gestellt um eine Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Nach einer 10 minütigen Verdunkelungsphase wurden die DF-Messungen durchgeführt. Anschließend wurde das analysierte Medium wieder zurück in die Bechergläser überführt, aus dem es entnommen wurde. Das während der Messungen im Becherglas verbliebene Medium bedeckte zu jedem Zeitpunkt die Testorganismen vollständig DATEN-ANALYSE Die Datenaufbereitung und -analyse erfolgte über die Software Graphpad Prism 5.0 und MS Excel Für alle Parameter wurden der Mittelwert (arithmetisches Mittel) und der Variationskoeffizient ermittelt. Für die Wachstumsparameter wurden zusätzlich die durchschnittlichen Wachstumsraten berechnet, die mit ihrer Standardabweichung graphisch dargestellt werden. Die Wachstumsrate berechnet sich nach der Formel des OECD-Lemna Test (OECD 2002), da sie ebenfalls sowohl in zahlreichen Veröffentlichungen zum Thema Makrophyten und Ökotoxikologie verwendet wird (siehe z.b. ARTS ET AL. 2008; CEDERGREEN ET AL. 2004; KNAUER ET AL. 2006; KNAUER ET AL. 2008) als auch im Normentwurf für den Myriophyllum-Sedimentkontakttest (FEILER 2008) und im AMRAP-Myriophyllum-Test (MALTBY ET AL. 2010) Verwendung findet. So können die Ergebnisse dieser Arbeit besser mit anderen Arbeiten verglichen werden. An dieser Stelle sei aber darauf hingewiesen, dass durch die Logarithmisierung, die in dieser Formel stattfindet, die Einheit im Zähler verloren geht, sodass es sich um abstrakte Wachstumsraten mit der Einheit Tag -1 (d -1 ) handelt, die zwar miteinander verglichen werden können, aber keine direkte Aussage zum tatsächlichen Zuwachs in einer Zeiteinheit erlauben. Die Berechnung des arithmetischen Mittels erfolgte nach Formel 1: Formel 1: 1 x n n x i i 1 Die Berechnung des Variationskoeffizienten () erfolgte nach Formel 2: Formel 2: % CV T / XT 100 %CV: σ T : x T : Variationskoeffizient Standardabweichung der jeweiligen Testreihe Arithmetisches Mittel der jeweiligen Testreihe 69

91 Biotestentwicklung I Die Berechnung der Wachstumsraten erfolgte nach Formel 3: Formel 3: µ i j (ln( N j ) ln( Ni)) ( t t ) j i µ i-j : spezifische Wachstumsrate vom Zeitpunkt i zum Zeitpunkt j N i : Frischgewicht bzw. Sprosslänge zum Zeitpunkt i N j : Frischgewicht bzw. Sprosslänge zum Zeitpunkt j t i : Zeitpunkt zum Start der Studie (in Tagen) t j : Zeitpunkt zum Ende der Studie (in Tagen) 3.3 ERGEBNISSE WASSERCHEMIE Die Ergebnisse der Nährstoffanalytik des Teichwassers vor Versuchsbeginn der jeweiligen Testreihen sind der Tabelle 6 zu entnehmen. Bei dem Teichwasser der ersten Versuchsreihe HL lag der Phosphatgehalt unter der Messgrenze von 0,01 mg/l. In der zweiten Versuchsreihe ML, wies der Phosphatgehalt eine Konzentration von 0,1 mg/l auf. Allerdings lag hier der Ammonium-Gehalt unterhalb der Messgrenze von 0,01 mg/l. Im Gegenzug stieg die Nitrat-Konzentration von 0,5 mg/l bei der ersten Versuchsreihe HL auf 0,9 mg/l bei der zweiten Versuchsreihe ML. Tabelle 6: Ergebnisse der Nährstoffanalytik des Teichwassers vor Versuchsbeginn der jeweiligen Testreihen. ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Versuchsreihe NO 3 [mg/l] NH 4 [mg/l] NO 2 [mg/l] Phosphat [mg/l] Gesamthärte [ d] SO 4 [mg/l] HL 0,5 0,08 0,03 <0,01 2,6 10 ML 0,9 <0,01 0,01 0,1 3, CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Die Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien sind nach Testorganismus getrennt in den Tabelle 7 bis Tabelle 9 wiedergegeben. Die Leitfähigkeit des Mediums I ist bei allen drei Testorganismen unter beiden Lichtbedingungen über den Versuchszeitraum angestiegen. Der stärkste Anstieg von 32 µs/cm fand bei R. fluitans in HL statt. Die Leitfähigkeit der Medien II und III dagegen verringerte sich über den Versuchszeitraum in allen Fällen. Die Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums II war deutlich geringer als die des Mediums III. Während bei C. demersum hier kaum Unterschiede zwischen den beiden Lichtverhältnissen auftraten (Δ HL : 14 µs/cm; Δ ML : 15 µs/cm) und auch bei E. nuttallii die Unterschiede gering 70

92 Biotestentwicklung I waren (Δ HL : 14 µs/cm; Δ ML : 18 µs/cm), zeigten sich bei dem Medium von R. fluitans deutlichere Unterschiede zwischen den beiden Lichtverhältnissen (Δ HL : 22 µs/cm; Δ ML : 5 µs/cm). Die Abnahme der Leitfähigkeit von Medium III war bei E. nuttallii am geringsten (Δ HL : 88 µs/cm; Δ ML : 86 µs/cm), gefolgt von C. demersum (Δ HL : 122 µs/cm; Δ ML : 136 µs/cm) und R. fluitans, das große Unterschiede zwischen den beiden Lichtverhältnissen aufwies (Δ HL : 181 µs/cm; Δ ML : 97 µs/cm). Tabelle 7: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Ceratophyllum demersum (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Leitfähigkeit [µs/cm] ph O 2 [mg/l] HL ML HL ML HL ML Tag der Studie , , , , , , , , , , , ,5 0 7,9 0,4 7,4 0,5 6,5 0,3 28 9,2 1,2 9,6 0,4 10,3 1,3 0 7,7 0,3 7,2 0,1 6,5 0,0 28 9,0 4,6 9,7 2,1 9,3 0,8 0 10,9 0,6 10,7 1,1 10,3 1, ,5 2,3 14,5 2,6 19,1 13,9 0 10,3 0,1 10,3 0,1 10,3 0, ,2 14,6 18,1 14,5 17,7 3,0 Tabelle 8: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Elodea nuttallii (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Leitfähigkeit [µs/cm] ph O 2 [mg/l] HL ML HL ML HL ML Tag der Studie Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert , , , , , , , , , , , ,4 0 7,9 0,4 7,3 0,1 6,5 0,3 28 8,8 1,5 10,0 0,5 9,0 5,3 0 7,7 0,1 7,2 0,6 6,6 0,8 28 9,5 1,9 9,8 0,8 8,6 4,3 0 10,9 0,3 10,6 0,2 10,2 0,3 28 9,5 2,7 18,2 3,7 12,0 5,2 0 10,3 0,4 10,3 0,2 10,3 0, ,4 5,7 19,7 4,2 16,5 8,3 71

93 Biotestentwicklung I Tabelle 9: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter zu Beginn und zum Ende der Testreihen der Medien von Riccia fluitans (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Leitfähigkeit [µs/cm] ph O 2 [mg/l] HL ML HL ML HL ML Tag der Studie Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert , , , , , , , , , , , ,6 0 7,5 2,2 7,4 0,8 6,6 0,6 28 8,6 0,5 9,7 2,9 9,3 5,6 0 7,5 2,2 7,2 0,2 6,6 0,2 28 8,6 0,5 9,6 1,6 7,7 1,6 0 10,4 0,3 10,4 0,3 10,4 0, ,0 23,0 12,3 20,9 10,7 24,3 0 10,2 0,1 10,2 0,4 10,2 0, ,1 3,1 18,5 7,9 11,7 2,5 Bezüglich des ph-wertes kann eine Verringerung durch die Zugabe der Steinberg- Stammlösungen von durchschnittlich 7,8 (Medium I) über 7,3 (Medium II) zu 6,5 (Medium III) verzeichnet werden. Der ph-wert stieg in allen Fällen über den Versuchszeitraum an. Dabei waren die ph-wert-änderungen beim Medium I mit 0,9 (HL E. nuttallii ) bis 1,8 (ML E. nuttallii ) am geringsten. Beim Medium II gab es keine großen Unterschiede in den ph-wert-änderungen zwischen den beiden Lichtverhältnissen, die im Bereich zwischen 2,2 (HL C. demersum ) und 2,7 (HL E. nuttallii ) lagen. Der Anstieg des ph-wertes bei dem Medium von C. demersum betrug unter hoher Lichtintensität (HL) 3,8 gegenüber 2,7 bei mittlerer Lichtintensität (ML) und damit etwa 1/3 mehr. Der ph-anstieg des Mediums bei R. fluitans betrug bei HL mehr als das Doppelte (Δ HL : 2,7) gegenüber ML (Δ ML : 1,2). Der Sauerstoffgehalt stieg in den meisten Fällen an (bis zu 9,4 mg/l bei ML E. nuttallii ). Nur beim Medium I kam es bei C. demersum (Δ HL : -0,4 mg/l) und E. nuttallii (Δ HL : -1,3) unter hoher Lichtintensität zu einer Sauerstoffabnahme. Im Medium II wurde bei allen drei Testorganismen eine stärkere O 2 -Erhöhung bei ML gemessen als bei HL. In Medium III führte bei C. demersum HL zu der stärksten O 2 -Erhöhung, bei E. nuttallii führte ML zu der stärksten O 2 -Erhöhung, während bei R. fluitans beide Lichtverhältnisse nur zu minimalen O 2 -Erhöhungen führten, die vergleichbar mit Medium I sind. 72

94 Wachstumsrate Wachstumsrate Biotestentwicklung I WACHSTUMSPARAMETER Die Wachstumsraten und deren Variationskoeffizienten, bzw. Standardabweichungen von C. demersum sind der Abbildung 28 und der Tabelle 10 zu entnehmen. C. demersum erfährt in den mit Nährstoffen angereicherten Medien II und III ein deutlich höheres Wachstum bezüglich des Frischgewichts als in dem reinen Teichwasser von Medium I. Die höchsten durchschnittlichen Wachstumsraten von 0,022-0,023 d -1 wurden in Medium II bei ML und in Medium III unter beiden Lichtbedingungen erzielt. Dabei ist der Variationskoeffizient von Medium II ML mit 20,2% der niedrigste der drei Medien. Der Variationskoeffizient von Medium II bei HL ist mit 6% am geringsten, von Medium III in ML mit 41,6% am höchsten bei C. demersum. Die Wachstumsraten bezüglich Sprosslänge korrelieren nur sehr eingeschränkt mit den Wachstumsraten bezüglich Frischgewicht. So liegt die Wachstumsrate Sprosslänge in HL in Medium II mit Frischgewicht Sprosslänge HL ML 0.00 HL ML Medium I Medium II Medium III Abbildung 28: Darstellung der Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge [d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Ceratophyllum demersum (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Tabelle 10: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Wachstumsraten [d -1 ] von Ceratophyllum demersum (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Frischgewicht Sprosslänge Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert HL 0,016 10,8 0,019 6,0 0,023 21,7 ML 0,013 11,5 0,022 20,2 0,022 41,6 HL 0,018 30,0 0,014 45,4 0,043 36,0 ML 0,026 16,8 0,028 48,1 0,036 24,1 73

95 Sprosslänge [cm] Sprosslänge [cm] Frischgewicht [g] Frischgewicht [g] Biotestentwicklung I 0,014 d -1 unter der von Medium I mit 0,018 d -1. Insgesamt sind bei diesem Parameter bei C. demersum auch die Variationskoeffizienten größer. Betrachtet man den zeitlichen Verlauf des Wachstums von C. demersum (siehe Abbildung 29), lassen sich folgende Beobachtungen festhalten: In ML verläuft sowohl das Wachstum bezüglich Frischgewicht als auch das Wachstum bezüglich Sprosslänge in allen Medien relativ gleichmäßig über den Versuchszeitraum. In HL verläuft nur das Wachstum in Medium I und Medium II relativ kontinuierlich. In Medium III erfährt C. demersum ab Tag 14 eine starke Steigerung des Wachstums, die sich v.a. in der Sprosslänge niederschlägt. 15 HL 15 ML Tage Tage HL ML Tage Medium I Medium II Medium III Tage Abbildung 29: Mittelwerte des Wachstumsverlaufs (Frischgewicht & Sprosslänge) von Ceratophyllum demersum über den Versuchszeitraum von 28 Tagen (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Die Wachstumsraten und deren Variationskoeffizienten bzw. Standardabweichungen von E. nuttallii sind der Abbildung 30 und der Tabelle 11 zu entnehmen. Auffallend ist das geringe durchschnittliche Wachstum in Medium III, das in ML für Sprosslänge sogar negativ ist. Betrachtet man die zeitliche Entwicklung des Wachstums (siehe Abbildung 31), ist hier ab der 2. Woche ein Verlust von Frischgewicht und Sprosslänge zu verzeichnen. Nach der ersten Woche konnte bereits eine Ausbleichung der Neutriebe 74

96 Wachstumsrate Wachstumsrate Biotestentwicklung I beobachtet werden und ab der zweiten Woche lösten sich die Blätter vom Spross. Auch im Medium II kam es ab der zweiten Woche zu einer Ausbleichung von E. nuttallii und das Wachstum verringerte sich, blieb aber positiv. Das Wachstum von E. nuttallii verlief dagegen im Medium I über den Versuchszeitraum konstant (siehe Abbildung 31). Über den gesamten Zeitraum betrachtet, ist das Wachstum von E. nuttallii bezüglich Frischgewicht in den Medien I und II unter beiden Lichtverhältnissen vergleichbar hoch (0,046 d -1 +/- 0,001). Bezüglich der Sprosslänge wurde die höchste Wachstumsrate von E. nuttallii in Medium I in ML erreicht (µ Sprosslänge : 0,045 d -1 ). Der Variationskoeffizient der Wachtumsrate Frischgewicht ist in HL geringer als in ML. Besonders der Variationskoeffizient in HL in Medium I und Medium II ist mit 2,1% (Medium I) und 2,6% (Medium II) sehr niedrig. Frischgewicht Sprosslänge HL ML 0.00 Medium I Medium II Medium III HL ML Abbildung 30: Darstellung der Wachstumsraten Frischgewicht und Sprosslänge [d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Elodea nuttallii (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Tabelle 11: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Wachstumsraten [d -1 ] von Elodea nuttallii (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Frischgewicht Sprosslänge Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert HL 0,047 2,1 0,045 2,6 0,014 10,7 ML 0,046 19,9 0,047 21,5 0, ,8 HL 0,030 12,5 0,035 33,0 0,017 53,3 ML 0,045 11,5 0,034 10,2-0, ,3 75

97 Sprosslänge [cm] Sprosslänge [cm] Frischgewicht [g] Frischgewicht [g] Biotestentwicklung I 1.0 HL 1.0 ML Tage Tage 40 HL 40 ML Tage Medium I Medium II Medium III Tage Abbildung 31: Mittelwerte des Wachstumsverlaufes (Frischgewicht & Sprosslänge) von Elodea nuttallii über den Versuchszeitraum von 28 Tagen (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Die durchschnittlichen Wachstumsraten und deren Variationskoeffizienten bzw. Standardabweichungen von R. fluitans sind der Abbildung 32 und der Tabelle 12 zu entnehmen. Hier sind die Unterschiede v.a. zwischen den Lichtintensitäten am auffälligsten. Stärkeres Wachstum erfuhr R. fluitans in HL. Hier wird der höchste Wert in Medium III erreicht (µ Frischgewicht : 0,018 d -1 ). Der Wert von Medium II liegt nur unwesentlich darunter (µ Frischgewicht : 0,017 d -1 ). Er weist aber gegenüber Medium III (Variationskoeffizient: 102,9%) mit 25% nur einen viertel so großen Variationskoeffizienten auf. In ML erreicht R. fluitans den höchsten Wert in Medium I (µ Frischgewicht : 0,008 d -1 ), während er bei Medium II und Medium III bei 0 liegt. Diese Werte erklären sich bei einem Blick auf den zeitlichen Wachstumsverlauf in Abbildung 33. Ab der 2. Woche kommt es bei R. fluitans in ML in den Medien II und III zu einem Gewichtsverlust. Bei der Betrachtung des Wachstumsverlaufes in HL lässt sich in der 3. Versuchswoche ebenfalls eine Stagnation bzw. bei Medium I eine Verringerung des Gewichts feststellen. In der 4. Woche kommt es dagegen bei R. fluitans wieder in allen Medien zu einer Gewichtszunahme bei HL. 76

98 Frischgewicht [g] Frischgewicht [g] Wachstumsrate Biotestentwicklung I Frischgewicht HL Medium I Medium II Medium III ML Abbildung 32: Darstellung der Wachstumsraten [d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Riccia fluitans (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Tabelle 12: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Wachstumsraten [d -1 ] von Riccia fluitans (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III Frischgewicht Mittelwerwerwert Mittel- Mittel- Lichtintensität HL 0,012 47,2 0,017 25,0 0, ,9 ML 0,008 54,3 0, ,4 0, ,0 0.4 HL 0.4 ML Tage Medium I Medium II Medium III Tage Abbildung 33: Mittelwerte des Wachstumsverlaufes (Frischgewicht) von Riccia fluitans über den Versuchszeitraum von 28 Tagen (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. 77

99 Biotestentwicklung I PHYTOPLANKTON Die Ergebnisse der über den Chlorophyll-Gehalt ermittelten Phytoplanktondichte am Versuchsende (Tag 28) in den unterschiedlichen Medien von C. demersum und E. nuttallii unter den verschiedenen Lichtbedingungen sind in der Tabelle 13 aufgelistet. Insgesamt wurden die niedrigsten Phytoplanktondichten in reinem Teichwasser (Medium I) und die höchsten Phytoplanktondichten im Medium III erreicht. Bei beiden Testorganismen wies das Medium in ML höhere Chlorophyll-Gehalte auf als in HL. Bis auf den Ausreißer von 186,7 µg/l in dem Medium II von E. nuttallii ML liegen dabei die Phytoplanktondichten von Medium I und Medium II in der gleichen Größenordnung von bis zu ca. 60 µg/l. Bei Medium III fällt nur ein Wert in diesen Bereich (C. demersum HL : 42,3 µg/l), während die anderen Werte von Medium III deutlich höher liegen (202,1-311,7 µg/l). Der Variationskoeffizient schwankt zwischen 6,4% bei E. nuttallii HL-Medium III und 95,6% bei E. nuttallii HL-Medium I. Ein Zusammenhang zwischen Höhe des Variationskoeffizienten und Medium, Licht oder Testorganismus ist nicht ersichtlich. Beim Vergleich der beiden Testorganismen liegen die Chlorophyll-Werte der Medien von C. demersum bei gleichem Medium und gleichen Lichtbedingungen stets niedriger als bei E. nuttallii. Tabelle 13: Durchschnittlicher Chlorophyll-Gehalt in µg/l (Mittelwert) und die zugehörigen Variationskoeffizienten () der Medien von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii am Ende des jeweiligen Versuches (Tag 28) (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. Medium I Medium II Medium III C. demersum E. nuttallii Lichtintensität Mittelwert Mittelwert Mittelwert HL 8,4 12,9 21,8 93,3 42,3 64,9 ML 23,4 27,9 53,8 50,0 308,5 9,3 HL 10,4 25,0 31,2 79,4 202,1 51,2 ML 61,6 95,6 186,7 53,4 311,7 6,4 Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der Phytoplanktonentwicklung in den Testmedien (siehe Abbildung 34), zeigt in allen Fällen die Phytoplanktonentwicklung in Medium I den konstantesten Verlauf in einer logarithmischen Skalierung (die auf der Annahme exponentiellem Wachstum bei Algen begründet ist). Nur bei E. nuttallii in ML kommt es in der 2. Versuchswoche zu einem verhältnismäßig starken Anstieg. Den Medien II und III ist in allen Fällen ein starker Anstieg zu Versuchsbeginn in der 1. Woche gemein. Ab der 2. Versuchswoche fällt im Medium III das Algenwachstum deutlich langsamer aus bzw. stagniert bei dem Versuch mit C. demersum in HL. In Medium II folgt 78

100 Chlorophyll [µg/l] Clorophyll [µg/l] Chlorophyll [µg/l] Clorophyll [µg/l] Biotestentwicklung I Ceratophyllum-Test 1000 HL 1000 ML Tage Tage Elodea-Test 1000 HL 1000 ML Tage Medium I Medium II Medium III Tage Abbildung 34: Phytoplanktonentwicklung in den Testsystemen von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii über den Versuchszeitraum von 28 Tagen (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. auf ein verringertes Wachstum in Woche 2 bis auf in dem E. nuttallii ML -Versuch eine Verringerung der Phytoplanktondichte in Woche 3. Der zeitliche Verlauf der Phytoplanktonzusammensetzung der unterschiedlichen Medien unter den beiden Lichtbedingungen ist in Abbildung 35 dargestellt. Die Gruppe der Grünalgen ist mit ca % in allen Fällen dominant. Im Medium II in HL kommt es bei beiden Testorganismen zu verstärkten Blaualgen (Cyanobakterien)-Wachstum, die hier in der 2. Versuchshälfte auf einen Anteil von 30-40% kommen. Kieselalgen erreichen in einigen Fällen bis zu ca. 20%, während der Anteil an Kryptomonaden vernachlässigbar gering ist. Insgesamt scheint ein Trend erkennbar, dass in Medium III die Dominanz der Grünalgen am ausgeprägtesten ist, während in Medium I und Medium II auch Blau- und Kie- 79

101 % % % % % % % % % % % % Biotestentwicklung I selalgen größere Anteile an der Zusammensetzung der Phytoplanktonzönose erreichen können. Ceratophyllum-Test Elodea-Test HL ML HL ML Medium I Tage Medium I Tage Medium I days Medium I Tage Medium II Tage Medium II Tage Medium II Tage Medium II Tage Medium III Tage Blaualgen Grünalgen Kieselalgen Kryptomonaden Sediment Medium III Tage Medium III days Medium III Tage Abbildung 35: Entwicklung der durchschnittlichen Zusammensetzung des Phytoplanktons über den Versuchszeitraum von 28 Tagen in den Testsystemen von Ceratophyllum demersum und Elodea nuttallii (n=3). ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. 3.4 DISKUSSION WASSERCHEMIE Pflanzen können Stickstoff nur in Form von Nitrat, Nitrit und Ammonium aufnehmen (sofern sie nicht über das Enzym Nitrogenase verfügen) und für den Aufbau von Biomasse nutzen (LAMPERT & SOMMER 1999). Zu welchen Anteilen Nitrat, Nitrit und Ammonium vorliegen, ist v.a. vom Sauerstoff abhängig. Bei hohem Sauerstoffgehalt wird über Nitrifikation Ammonium zu Nitrat transformiert. Daher lassen sich die Unterschiede in den Verhältnissen der Stickstoffverbindungen des Teichwassers zwischen 80

102 Biotestentwicklung I den beiden Versuchsansätzen erklären. Ein geringerer Nitrat-Wert (0,5 mg/l) bei HL als bei ML (0,9 mg/l) geht mit einem höheren Ammonium-Wert (0,08 mg/l) als bei ML (<0,01 mg/l) einher. Die Werte sind vergleichbar mit denen naturnaher Stillgewässer wie z.b. Heiliges Meer (Steinfurt/NRW) (HAGEMANN 2000). Neben Stickstoff ist v.a. Phosphor in Form von Phosphat entscheidend für die Primärproduktion in Gewässern. Bei dem unter der Nachweisgrenze gemessenen Phoshat-Wert von <0,01 mg/l ist es möglich, dass der Phosphatgehalt des Mediums limitierend auf das Pflanzenwachstum wirkte. POTT & REMY (2000) nennen Phosphat als bedeutendsten produktionsbegrenzenden Faktor in unbelasteten Gewässern, der schon bei geringer Erhöhung zu einer deutlichen Steigerung der Phytomasse führt. Dagegen postulieren ANDERSON & KALFF (1986) zumindest für Myriophyllum spicatum, dass v.a. eine Stickstoff-Düngung zu gesteigerten Wachstum führt, während Phosphat- und Kalium-Anreicherungen keinen Effekt auf das Pflanzenwachstum in ihren Versuchen zeigten. Mit einer Gesamthärte von 2,6 bzw. 3,2 wird das Teichwasser als sehr weich eingestuft (nach KLEE 1998) CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Neben der Temperatur, die in dem Versuch konstant gehalten wurde, geben v.a. die drei chemisch-physikalischen Parameter Leitfähigkeit, ph-wert und Sauerstoffgehalt wichtige Informationen über das Medium und die (Lebens-)Bedingungen der darin enthaltenen Organismen. Die elektrische Leitfähigkeit des Mediums ist ein Summenparameter für gelöste, dissoziierte Stoffe (HÜTTER 1988) und lässt somit Rückschlüsse auf den Nährstoffgehalt des Mediums zu. Die geringe Nährstoff-Zugabe bei Medium II führte fast zu einer Verdoppelung der elektrischen Leitfähigkeit (von durchschnittlich 93 µs/cm auf durchschnittlich 176 µs/cm), die hohe Nährstoff-Zugabe bei Medium III etwa zu einer Verneunfachung (auf durchschnittlich 873 µs/cm). Bei allen drei Testorganismen kam es sowohl bei HL als auch bei ML zu einer Zunahme der elektrischen Leitfähigkeit in Medium I über den Versuchszeitraum. Dies bedeutet, dass die Pflanzen mehr Ionen in das Medium abgegeben haben als aufgenommen. HOUGH (1979) konnte z.b. bei Elodea canadensis signifikante Abgaben von organischem Kohlenstoff in das Medium in Laborexperimenten messen. Hier muss von einer Nährstofflimitierung für das Pflanzenwachstum ausgegangen werden. Die Abnahme der Leitfähigkeit in Medium II und Medium III zeigt einen unterschiedlich starken Nährstoffverbrauch v.a. in Abhängigkeit vom Testorganismus. Generell sollte ein höherer Nährstoffverbrauch mit einer höheren Biomasseproduktion einhergehen. Allerdings muss hier auch das Phyto- 81

103 Biotestentwicklung I plankton mit berücksichtigt werden, welches vermutlich in einigen Fällen zu einem bedeutenden Anteil am Nährstoffentzug aus dem Medium beiträgt. Die Abnahme der Leitfähigkeit in dem Medium III von C. demersum beträgt bei HL 122 µs/cm im Laufe des Versuches, während sie bei ML 136 µs/cm beträgt. Gleichzeitig ist bei ML die Phytoplanktondichte am Ende des Versuches im Medium mit 308,5 µg/l etwa 7-mal höher als bei HL mit 42,3 µg/l. Hier ist der höhere Nährstoffverbrauch zumindest teilweise durch die höhere Phytoplanktondichte nahe liegend. Bei E. nuttallii fällt die Abnahme der elektrischen Leitfähigkeit über den Versuchszeitraum mit 88 µs/cm (HL) bzw. 86 µs/cm (ML) geringer als bei C. demersum aus. Dabei ist zu beachten, dass C. demersum im Durchschnitt 16-mal mehr Biomasse als E. nuttallii aufwies. Die Phytoplanktondichte (mit einer Chlorophyll-Konzentration von 202,1 µg/l (HL) bzw. 311,7 µg/l (ML)) korreliert hier nicht mit der Leitfähigkeitsabnahme, die unter beiden Lichtbedingungen nahezu gleich ist. Die Änderungen des Ausgangs-pH-Wertes der Medien durch die Zugabe von Steinberg- Stammlösungen führt entsprechend zu einer Änderung der Konfiguration von CO 2 (siehe Kapitel 1.6.3). Je nach Möglichkeiten der Pflanze ausschließlich freies CO 2 oder auch Hydrogencarbonat photosynthetisch zu nutzen (siehe POTT & REMY 2000), kann dieser Umstand unterschiedlich starken Einfluss auf die Photosyntheseleistung und damit das Pflanzenwachstum haben. Die niedrigen ph-änderungen in Medium I lassen auf eine geringe Photosyntheseaktivität in dem Medium schließen. Diese Annahme wird unterstützt durch die gemessene Sauerstoffabnahme im Medium I bei HL. Diese Sauerstoffabnahme ist vermutlich auf ein ungünstiges Verhältnis von Photosynthese zu Atmung und Photorespiration der Pflanzen (einschließlich des Phytoplanktons) zurückzuführen. In Medium II scheinen alle Testorganismen den ph- und O 2 -Werten nach die beste Photosyntheseleistung bei ML zu erbringen, da hier die Differenzen von Ausgangs- zu Endwert am höchsten sind. In Medium III findet nach den ph- und O 2 - Differenzen die höchste Photosyntheseaktivität bei C. demersum bei HL statt, bei E. nuttallii bei ML und für R. fluitans scheint sich dieses Medium in beiden Fällen ungünstig auf die Photosyntheseleistung auszuwirken, da hier die ph- und O 2 -Differenzen vom Ausgangs- zum Endwert sehr gering sind. Eine Bewertung der Medien und Lichtverhältnisse nach den chemisch-physikalischen Parametern führt nach den oben genannten Ausführungen zu folgenden Schlüssen: Das Medium I erweist sich als ungeeignet, da hier kein Verbrauch an Nährstoffen über die Leitfähigkeit gemessen werden konnte und die Photosyntheseaktivität stark hinter der in den Medien II und III liegt. Bei Medium II wird ML favorisiert, da hier bei allen Testorganismen die stärkste Photosynthese stattgefunden hat, welche die Basis für Biomassezunahme bildet. Das Medium III scheint nach der über den ph-wert und den O 2 - Gehalt erfassten Photosyntheseaktivität für R. fluitans wenig geeignet zu sein. 82

104 Biotestentwicklung I WACHSTUMSPARAMETER Die höheren Wachstumsraten von C. demersum in Medium II und Medium III gegenüber dem reinen Teichwasser von Medium I decken sich mit den höheren Abnahmen der elektrischen Leitfähigkeit in diesen Medien. Ein Vergleich von Medium II und Medium III bezüglich der Frischgewicht-Wachstumsraten, die mit 0,022 d -1 identisch sind, und bezüglich der Leitfähigkeitsabnahme des Mediums, die sich fast um den Faktor 10 unterscheidet, führt allerdings zu dem Schluss, dass für einen erheblichen Anteil des Nährstoffentzuges aus dem Medium III das Phytoplankton verantwortlich sein muss. Die hohen Wachstumsraten bezüglich der Sprosslänge von C. demersum in Medium III bei HL ist auf ein enormes Streckenwachstum in der 4. Versuchswoche zurückzuführen. Insgesamt lassen sich über die gemessenen Sprosslängen-Wachstumsraten weniger scharfe Aussagen treffen, die eine Bewertung der Medien und Lichtbedingungen erlauben. Mit dem Ziel, bei einem Makrophyten-Biotest möglichst hohe Wachstumsraten der Testorganismen bei möglichst geringen Variationskoeffizienten zu erreichen, wird für C. demersum das Medium II bei ML favorisiert. Die geringen Wachstumsraten und das Absterben von Blättern in der 2. Versuchshälfte von E. nuttallii in Medium III führen zu dem Schluss, dass dieses Medium keine geeigneten Bedingungen für ein gesundes Wachstum von E. nuttallii bietet. Diese Ergebnisse decken sich mit Untersuchungen von ÖZBAY (2001), der Versuche mit E. nuttallii u.a. in Steinberg-Medium mit unterschiedlich hohem Phosphat- und Stickstoffgehalt durchgeführt hat. Auch hier führte die nährstoffreichere Variante zu keinem Wachstum bei E. nuttallii. Auch das Ausbleichen der Blätter von E. nuttallii in Steinberg-Medium mit geringeren N- und P-Gehalten, welches mit einem Verlust von Chlorophyll einhergeht, wird in dieser Studie beschrieben. Die Wachstumsraten von E. nuttallii in Medium I und Medium II sind vergleichbar hoch, wie die in einer Veröffentlichung von OZIMEK ET AL. (1993) angegebenen Wachstumsraten von E. nutallii in mit Nitrat angereichertem Seewasser. Bezüglich Wachstumsraten und Variationskoeffizienten kann für E. nuttallii zwischen Medium I und Medium II und den Lichtbedingungen kein eindeutiger Favorit ermittelt werden. R. fluitans erzielt eindeutig höhere Wachstumsraten bei HL gegenüber ML. Im Vergleich der Medien wird Medium II favorisiert, da es eine nahezu gleich hohe Wachstumsrate wie Medium III von 0,017 d -1 gegenüber 0,018 d -1 bei einem viertel so hohen Variationskoeffizienten von 25,0% gegenüber 102,9% aufweist. Generell lässt sich der Trend beobachten, dass der Variationskoeffizient der Wachstumsparameter mit zunehmender Nährstoffanreicherung des Mediums steigt. Eine zweite generelle Beobachtung betrifft den Wachstumsverlauf der Testorganismen. Tenden- 83

105 Biotestentwicklung I ziell ist der Wachstumsverlauf der Testorganismen in den ersten 2 Wochen konstanter gegenüber den letzten beiden Testwochen PHYTOPLANKTON Bezüglich der Entwicklung von Phytoplankton in den Testmedien im Laufe der Versuche sind generell zwei Trends zu erkennen. Zum einem nimmt die Phytoplanktondichte mit steigendem Nährstoffgehalt der Medien zu. Zum anderen fällt die Phytoplanktonentwicklung bei HL geringer als bei ML aus. Hier scheinen C. demersum und E. nuttallii das Algenwachstum zu unterdrücken. Inwieweit das verminderte Algenwachstum auf (Nährstoff-)Konkurrenz oder auf das Ausscheiden allelopathischer Substanzen von C. demersum und E. nuttallii zurückzuführen ist (siehe ERHARD & GROSS 2006; GROSS ET AL. 2003; HILT & GROSS 2008; LÜRLING ET AL. 2006), kann nicht abschließend geklärt werden. Da sowohl eine Nährstofflimitierung beim Medium III (die elektrische Leitfähigkeit betrug am letzten Versuchstag 786 bzw. 784 µs/cm) als auch eine Lichtlimitierung durch die Testpflanzen, die nur verhältnismäßig wenig Raum im Becherglas einnahmen, unwahrscheinlich ist, scheint zumindest bei C. demersum eine verstärkte Abgabe allelopathischer Substanzen durch hohe Lichtintensitäten induziert zu werden: Mit einem durchschnittlichen Chlorophyll-Gehalt von 42,3 µg/l wies das Medium III von C. demersum bei HL eine mehr als 7-mal geringere Phytoplanktondichte auf als bei ML mit 308,5 µg/l. Bei E. nuttallii ist möglicherweise die hohe Algendichte in Medium III (HL: 202,1 µg/l; bzw. ML: 311,7 µg/l) die Ursache für das schlechte Wachstum von E. nuttallii in Medium III. In einem Laborexperiment konnten OZIMEK ET AL. (1991) einen Gewichtsverlust von Elodea canadensis in der Gegenwart von Algen um 35-57% in 20 bzw. 30 Tagen feststellen, während E. canadensis in der Abwesenheit von Algen eine Gewichtszunahme verzeichnen konnte. Bezüglich der Algenzusammensetzung in den gemessenen Testsystemen lässt sich festhalten, dass die Gruppe der Grünalgen prozentual am stärksten vertreten ist. Kieselalgen und Blaualgen können vereinzelt eine Rolle spielen, wobei kein direkter Zusammenhang zwischen Nährstoffgehalt und Blaualgenanteil hergestellt werden konnte, wie er theoretisch für Binnengewässer besteht (siehe z.b. NIXDORF ET AL. 2000) GESAMTBEWERTUNG Eine zusammenfassende Bewertung der getesteten Medien und Lichtintensitäten wird in Tabelle 14 wiedergegeben. Dabei fungieren die chemisch-physikalischen Parameter des Mediums als Summenparameter für Stoffwechselprozesse und geben Auskünfte über Nährstoffverbrauch und zu dem Verhältnis von Photosynthese zu Atmung. In dieser 84

106 Biotestentwicklung I Tabelle 14: Übersicht über das jeweils geeigneteste Testdesign nach den Parametern physikalisch-chemische Parameter des Mediums, Wachstum des Testorganismus und Algenentwicklung im Medium bezüglich Licht intensität und Nährstoffgehalt des Mediums. ML: Mittlere Lichtintensität; HL: Hohe Lichtintensität. C. demersum E. nuttallii R. fluitans Parameter Licht Medium Licht Medium Licht Medium physikalisch-chemische Parameter des Mediums ML II ML II ML II Wachstum der Testorgansimen ML II - I & II HL II Algenentwicklung im Medium HL I HL I - - Kategorie wird für alle drei Testorganismen Medium II bei ML favorisiert. Hohe Wachstumsraten bei geringem Variationskoeffizienten konnten für C. demersum ebenfalls in Medium II bei ML erreicht werden, während für R. fluitans Medium II bei HL am günstigsten war. Bezüglich des Wachstums konnten für E. nuttallii keine Präferenzen in der Lichtintensität ermittelt werden. Medium I und Medium II scheinen nach dem Wachstum von E. nuttallii gleich geeignet zu sein, während Medium III sich als ungeeignet für diesen Testorganismus erwiesen hat. Die geringste Algenentwicklung (genauer Phytoplankton) fand in Medium I bei HL statt. Insgesamt zeigt sich, dass das Medium III tendenziell ungeeigneter ist als Medium I und II. Wird bei dem Versuchsdesign der größte Wert auf ein hohes Pflanzenwachstum der Testorganismen mit geringem Variationskoeffizienten gelegt, wird nach den Ergebnissen dieses Versuches ein Medium mit geringer Nährstoffzugabe, die eine ausreichende Versorgung der Testorganismen gewährleistet, empfohlen. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen: Je geringer der Nährstoffgehalt des Mediums ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit einer hohen Algenentwicklung. Andererseits kann ein zu geringes Nährstoffangebot im Medium das Wachstum des Testorganismus limitieren. Die optimale Lichtintensität unterscheidet sich je nach Testorganismus. Soll für Studien mit mehreren Makrophyten eine einheitliche Lichtintensität gewählt werden, wird von den beiden getesteten Lichtintensitäten ML (5000 Lux) empfohlen, da die Algenhemmung bei HL von C. demersum und E. nuttallii vermutlich auf Allelopathie beruht, die bei diesen beiden Pflanzen bekannt ist (ERHARD & GROSS 2006; GROSS ET AL. 2003; HILT & GROSS 2008; LÜRLING ET AL. 2006), aber nicht für andere Makrophyten gelten muss. Bei den anderen beiden für die Bewertung des Testdesigns herangezogenen Parametern überwiegt die Favorisierung von ML. Für eine geringere Lichtintensität spricht zudem der Umstand, dass Wasserpflanzen eher als Schattenpflanzen bezüglich ihrer Blattmorphologie und ihres Photosyntheseapparates gelten (RONZHINA & P`YANKOV 2001). 85

107 Biotestentwicklung II 4 BIOTESTENTWICKLUNG II: VERGLEICH DER 3 STANDARD- MEDIEN CHU-, STEINBERG- UND AAP-MEDIUM FÜR BIOTESTS MIT MENTHA AQUATICA UND MYRIOPHYLLUM AQUATICUM 4.1 ZIELSETZUNG Wie die vorangegangen Versuche aus Kapitel 3 zielte auch dieser Versuch auf eine möglichst optimale Wahl des Testmediums. Neben der Nährstoffkonzentration spielen auch die Nährstoffzusammensetzung und der ph-wert des Mediums eine Rolle, da sie die Sensitivität von Makrophyten gegenüber toxischer Substanzen beeinflussen (NASU & KUGIMOTO 1981). Daher wurden in diesem Versuch drei verschiedene mit entionisiertem Wasser verdünnte Standardnährmedien (Chu-, Steinberg- und AAP-Medium) auf ihre Eignung für die potentiellen Testorganismen Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum untersucht. Anhand des Verlaufes chemisch-physikalischer Parameter während des 14-tägigen Versuches, der Wachstumsparameter der Testorganismen und dem Aufkommen von Algen sollten die verschiedenen Medien bewertet werden. 4.2 MATERIAL & METHODEN TESTORGANISMEN Für diesen Versuch wurden die beiden Amphiphyten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum in ihrer submersen Form gewählt. Die beiden Testorganismen wurden im Labor nach FEILER (2008) in mit Steinberg-Medium angerührtem OECD-Sediment unter Versuchsbedingungen (siehe unten) mehrere Wochen emers vorkultiviert. Dabei wurden die Pflanzen etwa alle 4 Wochen über Stecklinge verjüngt. Für den Ansatz mit Myriophyllum aquaticum wurden 14 Tage alte Stecklinge, für den Ansatz mit Mentha aquatica 21 Tage alte Stecklinge verwendet. Ursprünglich entstammte Myriophyllum aquaticum einer Laborkultur der Bundesanstalt für Gewässerkunde, Koblenz (Rheinland-Pfalz). Die Mentha aquatica-pflanzen entstammten ursprünglich der Uferzone des Erlensees, Kirchhain (Hessen). Die Bestimmung der Arten wurde mit einschlägiger Bestimmungsliteratur durchgeführt (ROTHMALER 2000; SCHMEIL 1996; VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007). 86

108 Biotestentwicklung II VERSUCHSAUFBAU Der Versuch wurde in der in Kapitel 3 beschriebenen Wachstumskammer durchgeführt. Je Art wurden möglichst gleich große Sprossspitzen mit einer Rasierklinge abgetrennt, vermessen, gewogen und in ein mit 60 g Sediment (siehe unten) befülltes 40 ml- Becherglas gesteckt. Dabei wurde jeweils das untere Blattpaar bzw. der untere Blattwirtel in das Sediment gesteckt, um die Pflanze zu verankern. Jeweils 3 Pflanzen wurden mit ihren Sedimentbechergläsern in ein 2 L-Becherglas (hohe Passform; 12 cm Durchmesser) gestellt. Danach wurden in die 2 L-Bechergläser mit Mentha aquatica jeweils 1500 ml Testmedium zugegeben, in die 2 L-Bechergläser mit Myriophyllum aquaticum jeweils 1750 ml Testmedium (siehe Abbildung 36). Je Pflanzenart und zu testendem Medium wurden drei 2 L-Bechergläser à 3 Testpflanzen in die Wachstumskammer gestellt, sodass sich je Pflanze und Medium 9 (Pseudo-)Replikate ergeben. Die 2 L- Bechergläser wurden anschließend mit einer perforierten Klarsichtfolie abgedeckt, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Perforierte Klarsichtfolie Test-Medium 2 L Becherglas Testpflanze 40 ml Becherglas + Sediment Abbildung 36: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in einem 2 L-Becherglas LICHT & TEMPERATUR Für diesen Versuch wurde eine Lichtstärke von ca Lux in der Wachstumskammer gewählt und regelmäßig mit einem Luxmeter (LXOIOBS LX1010BS) überprüft. Während des Versuchszeitraumes wurden die Bechergläser alle 2-3 Tage nach einem Rotationsprinzip umgesetzt, um möglichen Inhomogenitäten der Lichtintensität innerhalb der Wachstumskammer Rechnung zu tragen. Per Zeitschaltuhr wurde ein Licht-Dunkel-Rhythmus von 16 h:8 h eingestellt. Die Temperatur des Wassers betrug während des Versuches 21+/-2 C und wurde mit einem digitalen Min/Max-Thermometer überprüft. 87

109 Biotestentwicklung II MEDIUM Es wurden die drei Standard-Medien Steinberg- (ISO/DIS ), Chu- und 20X AAP-Medium (OECD 2002) getestet. Steinberg-Medium wurde 1:2 mit entionisiertem Wasser verdünnt. Chu- und 20X AAP-Medium wurden 1:4 mit entionisiertem Wasser verdünnt. Die tatsächlichen Nährstoffzusammensetzungen bzw. -konzentrationen können den Tabellen 15 bis 17 entnommen werden. Tabelle 15: Zusammensetzung des Chu-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten Chu-Mediums. Substanz Konzentration Orig. Chu [mg/l] Konzentration Mod. Chu [mg/l] NaNO ,5 CaCl 2 *2H 2 O 25 6,25 MgSO 4 *7 H 2 O 75 18,75 K 2 HPO ,75 KH 2 PO ,75 NaCl 25 6,25 EDTA Titriplex III 50 12,5 KOH 31 7,75 FeSO 4 *7 H 2 O 4,98 1,245 H 3 BO 3 11,42 2,855 ZnSO 4 *7 H 2 O 8,82 2,205 MnCl 2 *4 H 2 O 1,44 0,36 MoO 3 0,71 0,1775 CuSO 4 *5 H 2 O 1,57 0,3925 Tabelle 16: Zusammensetzung des Steinberg-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten Steinberg-Mediums. Substanz Konzentration Orig. Steinberg [mg/l] Konzentration Mod. Steinberg [mg/l] KNO KH 2 PO K 2 HPO 4 12,6 6,3 MgSO 4 *7H 2 O Ca(NO 3 ) 2 *4H 2 O ,5 H 3 BO 3 0,12 0,06 ZnSO 4 *7H 2 O 0,18 0,09 Na 2 Mo O 4 *2H 2 O 0,044 0,022 MnCl 2 *4H 2 O 0,18 0,09 FeCl 3 *6H 2 O 0,76 0,38 EDTA Titriplex III 1,5 0,75 88

110 Biotestentwicklung II Tabelle 17: Zusammensetzung des 20X AAP-Mediums bzw. des für diesen Versuch modifizierten 20X AAP-Mediums. Substanz Konzentration Orig. 20X AAP [mg/l] Konzentration Mod. 20X AAP [mg/l] Na NO ,5 MgCl 2 *6H 2 O CaCl 2 *2H 2 O 90 22,5 MgSO 4 *7H 2 O ,5 K 2 HPO 4 *3H 2 O 30 7,5 H 3 BO 3 3,7 0,925 MnCl 2 *4H 2 O 8,3 2,075 FeCl 3 *6H 2 O 3,2 0,8 Na 2 EDTA*2H 2 O 6 1,5 ZnCl 2 0,066 0,0165 CoCl 2 *6H 2 O 0,029 0,00725 Na 2 MoO 4 *2H 2 O 0,145 0,03625 CuCl 2 *2H 2 O 0, ,00006 NaHCO SEDIMENT Es wurde künstliches OECD-Sediment, modifiziert nach FEILER (2008), verwendet. Auf 1100 g des nach Tabelle 18 gemischten Sedimentpulvers wurden 600 ml Steinberg- Medium (siehe Tabelle 16 Orig. Steinberg) gegeben und zu einer homogenen Masse gemischt. Tabelle 18: Zusammensetzung des Sedimentpulvers nach FEILER (2008). Substanz g/kg Trockengewicht Bemerkungen Quartzsand 750 F36 Kaolin 200 p.a. Torf 50 auf < 1 mm gesiebt Zugabe von 10% CaCO 3 für ph-justierung VERSUCHSDAUER Die Versuchsdauer betrug 14 Tage. 89

111 Biotestentwicklung II MONITORING DER CHEMISCH-PHYSIKALISCHEN PARAMETER Mit einem WTW Multiparameter Messgerät (Multi 197i) wurden die physikalischen Parameter Sauerstoffgehalt (Sauerstoffsensor CellOx 325), ph-wert (ph- Einstabmesskette SinTex 61) und Leitfähigkeit (Leitfähigkeitsmeßzelle TetraCon 325) der Medien gemessen. Diese Parameter wurden am Tag 2 und zum Ende der Studie (Tag 14) aufgenommen. Ferner wurden sie alle 2-3 Tage gemessen, um etwaige Störungen oder Besonderheiten in den Testsystemen aufzudecken ERFASSUNG DER WACHSTUMSPARAMETER Zu Beginn und am Ende des Versuches wurden das Frischgewicht und die Sprosslänge der Testorganismen bestimmt. Zur Ermittlung der Wachstumsparameter am Ende des Versuches wurden die Testorganismen aus dem Sediment entnommen, mit Wasser abgespült, sodass kein Sediment mehr an den Pflanzen haftete und vorsichtig mit Papiereinwegtüchern trocken getupft, bis die Papiertücher keine Feuchtigkeit mehr aufnahmen. Die Ermittlung des Frischgewichtes erfolgte über eine digitale Tafelwaage (Kern GS LMOM 1203) mit einer Genauigkeit von d=0,01 g. Die Ermittlung der Sprosslänge erfolgte mit Hilfe eines Lineals. Hier wurde auf 0,1 cm Einheiten gerundet ERFASSUNG DES PHYTOPLANKTONS IM MEDIUM Am Ende des Versuches wurden jeweils 350 ml des Mediums entnommen und wie in Kapitel 3 beschrieben per DF-Spektroskopie auf die Phytoplanktondichte (Chlorophyll- Konzentration des Mediums) analysiert (nach GERHARDT & BODEMER 1999; KRAUSE & GERHARDT 1984; KRAUSE ET AL. 1984) DATEN-ANALYSE Die Datenaufbereitung und -analyse erfolgte über die Software Graphpad Prism 5.0 und MS Excel Für alle Parameter wurde der Mittelwert (arithmetisches Mittel) und der Variationskoeffizient ermittelt. Für die Wachstumsparameter wurden zusätzlich die durchschnittlichen Wachstumsraten berechnet, die mit ihrer Standardabweichung graphisch dargestellt werden. Die entsprechenden Formeln sind dem Kapitel zu entnehmen. 90

112 Biotestentwicklung II 4.3 ERGEBNISSE CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Die Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Testmedien sind in den Tabellen 19 und 20 wiedergegeben. Außer bei dem Chu-Medium mit Myriophyllum aquaticum, wo während des Versuches eine Abnahme der durchschnittlichen Leitfähigkeit um 19 µs/cm stattgefunden hat, stieg in allen anderen Versuchsansätzen die durchschnittliche Leitfähigkeit um bis zu 95 µs/cm. Der Variationskoeffizient liegt mit unter 10% bei diesem Parameter in allen Ansätzen sehr niedrig. Der ph-wert erhöhte sich bei einem Variationskoeffizient von unter 1% in allen drei Medien bei Mentha aquatica um etwa eine Einheit. Die ph-wert-erhöhung fiel bei Myriophyllum aquaticum mit bis zu 1,8 Einheiten im Steinberg-Medium etwas höher aus. Ebenso wie der Sauerstoffgehalt in den Testmedien, der bei Mentha aquatica eine Erhöhung um 2,2 mg/l (AAP) bis 4,9 mg/l (Chu) erfuhr, während bei Myriophyllum aquaticum eine Erhöhung des durchschnittlichen Sauerstoffgehaltes um 6,0 mg/l (AAP) bis 11,2 mg/l (Steinberg) über den Versuchszeitraum zu verzeichnen war. Bei diesem Parameter sind die Unterschiede zwischen den Medien bei Myriophyllum aquaticum am ausgeprägtesten. Tabelle 19: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien an Tag 2 und zum Ende (Tag 14) der Testreihen von Myriophyllum aquaticum (n=9). Steinberg Chu AAP Leitfähigkeit [µs/cm] ph O 2 [mg/l] Tag der Studie , , , , , ,8 2 6,6 0,3 6,9 0,1 6,8 0,5 14 8,4 1,9 8,3 1,0 8,5 1,9 2 5,5 6,2 7,3 0,3 8,2 9, ,7 3,8 16,0 4,9 14,2 8,3 Tabelle 20: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien an Tag 2 und zum Ende (Tag 14) der Testreihen von Mentha aquatica (n=9). Steinberg Chu AAP Leitfähigkeit [µs/cm] ph O 2 [mg/l] Tag der Studie Mittelwert Mittelwert Mittelwert Mittelwert Mittelwert Mittelwert , , , , , ,9 2 6,6 0,4 6,8 0,3 6,9 0,2 14 7,8 0,3 7,8 0,7 7,9 0,6 2 8,7 5,6 8,1 9,5 9,1 4, ,2 8,1 13,0 3,7 11,3 4,4 91

113 Wachstumsrate Wachstumsrate Biotestentwicklung II WACHSTUMSPARAMETER Die Ergebnisse der Wachstumsparameter werden zusammenfassend in der Tabelle 21 und graphisch in der Abbildung 37 dargestellt. Myriophyllum aquaticum erzielte die höchsten durchschnittlichen Wachstumsraten bezüglich Frischgewicht (0,129 d -1 ) im Chu-Medium, während in diesem Medium die geringsten Wachstumsraten bezüglich Sprosslänge (0,073 d -1 ) gemessen wurden. Im Steinberg-Medium wurde die höchste durchschnittliche Wachstumsrate von Myriophyllum aquaticum bezüglich Sprosslänge (0,083 d -1 ) gemessen. Bezüglich Frischgewicht besetzt Steinberg-Medium eine mittlere Position mit einer durchschnittlichen Wachstumsrate von 0,122 d -1 bei Myriophyllum aquaticum. Gleichzeitig ist hier insgesamt der Variationskoeffizient mit 7,8% (Frischgewicht) und 10,1% (Sprosslänge) am geringsten. Aber auch die Variationskoeffizienten der durchschnittlichen Wachstumsraten in den anderen Medien liegen mit bis zu 15,1% (AAP) relativ niedrig.mentha aquatica erfuhr die höchste durchschnittliche Tabelle 21: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Wachstumsraten von Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum (n=9). Steinberg Chu AAP Mittelwert Myriophyllum aquaticum Mittelwert Mittelwert Frischgewicht 0,122 7,8 0,129 10,6 0,113 6,0 Sprosslänge 0,083 10,1 0,073 9,4 0,080 15,1 Mentha aquatica Frischgewicht 0,062 16,8 0,059 18,5 0,060 10,6 Sprosslänge 0,067 13,5 0,066 14,8 0,070 13,2 Myriophyllum aquaticum Mentha aquatica FG SL 0.00 FG SL Steinberg Chu AAP Abbildung 37: Darstellung der Wachstumsraten Frischgewicht (FG) und Sprosslänge (SL) [d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica (n=9). 92

114 Biotestentwicklung II Wachtumsrate von 0,062 d -1 bezüglich Frischgewicht in Steinberg-Medium bei einem Variationskoeffizienten von 16,8%. Die Wachstumsraten in den anderen beiden Medien liegen mit 0,059 d -1 (Chu) und 0,060 d -1 (AAP) nur unwesentlich darunter. Der Variationskoeffizient liegt bei Chu mit 18,5% etwas höher, bei AAP mit 10,6% etwas unter dem vom Steinberg-Medium. Auch bezüglich der Sprosslänge gibt es bei Mentha aquatica kaum Unterschiede zwischen den Medien, sowohl im Hinblick auf die Wachstumsrate (0,066-0,070 d -1 ) als auch im Hinblick auf den Variationskoeffizienten (13,2-14,8%) PHYTOPLANKTON Die Ergebnisse des Chlorophyll-Gehaltes in den Medien am Ende des Versuches (Tag 14), der die Phytoplanktondichte wiedergibt, sind zusammenfassend in der Tabelle 22 und zur Veranschaulichung graphisch anhand der Abbildung 38 dargestellt. Für beide Testorganismen wurde die geringste Phytoplanktondichte im Steinberg-Medium gemessen (10,7 µg/l bzw. 1,3 µg/l) bei gleichzeitig den geringsten Schwankungen zwischen den Replikaten (Variationskoeffizient von 20,5% bzw. 12,3%). Während die Unterschiede zwischen den Medien bei Myriophyllum aquaticum nur unwesentlich sind (13,6 µg/l Chlorophyll-Gehalt bei Chu; 11,1 µg/l bei AAP gegenüber 10,7 µg/l bei Steinberg), fallen sie bei Mentha aquatica deutlicher aus (10,9 µg/l Chlorophyll-Gehalt bei Chu; 5,9 µg/l bei AAP gegenüber 1,3 µg/l bei Steinberg). Tabelle 22: Durchschnittlicher Chlorophyll-Gehalt in µg/l (Mittelwert) und die zugehörigen Variationskoeffizienten () der Medien von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica am Ende des jeweiligen Versuches (Tag 14) (n=3). Steinberg Chu AAP Mittelwert [µg/l] Mittelwert [µg/l] Mittelwert [µg/l] Myriophyllum aquaticum 10,7 20,5 13,6 37,2 11,1 41,4 Mentha aquatica 1,3 12,3 10,9 23,7 5,9 39,5 93

115 Chlorophyll [µg/l] Biotestentwicklung II Myriophyllum Steinberg Chu AAP Mentha Abbildung 38: Darstellung des durchschnittlichen Chlorophyll-Gehalts in µg/l (Mittelwert) mit Standardabweichung der Medien von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica am Ende des jeweiligen Versuches (Tag 14) (n=3). 4.4 DISKUSSION CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Der Anstieg der Leitfähigkeit über den Versuchszeitraum in fast allen Ansätzen ist vermutlich auf ein Nachdiffundieren von Ionen aus dem künstlichen Sediment zu erklären, da dieses mit unverdünntem Steinberg-Medium angesetzt wurde und somit eine höhere Konzentration an Nährstoffen als die verdünnten Testmedien aufwies. Nur bei Myriophyllum aquaticum in Chu-Medium überwog der Nährstoffverbrauch durch die Pflanzen das Nachdiffundieren der Nährstoffe aus dem Sediment, sodass hier eine Verringerung der Leitfähigkeit verzeichnet werden konnte. Bezüglich des ph-wertes können zwischen den Medien keine signifikanten Unterschiede aufgedeckt werden. Myriophyllum aquaticum führte während des Versuchszeitraumes zu höheren ph-erhöhungen des Mediums als Mentha aquatica, was auf eine höhere Netto-Photosyntheseleistung schließen lässt. Bekräftigt wird diese Hypothese durch die Sauerstoffmessungen der Testmedien, die bei Myriophyllum aquaticum am Versuchsende wesentlich höher als bei Mentha aquatica ausfielen. Während nach dem Sauerstoffgehalt Mentha aquatica die höchste Photosyntheseleistung im Chu-Medium erbracht hat, wurde bei Myriophyllum aquaticum der höchste Anstieg des Sauerstoffgehaltes im Steinberg-Medium gemessen. 94

116 Biotestentwicklung II WACHSTUMSPARAMETER Die Unterschiede der Wachstumsparameter bei Mentha aquatica sind zu gering, um eine Bewertung der Medien vorzunehmen. Etwas deutlichere Unterschiede zeigen sich bei den Ergebnissen von Myriophyllum aquaticum. Hier werden die konstantesten Ergebnisse beim Steinberg-Medium erzielt. Insgesamt weisen beide Pflanzen verglichen mit Werten anderer Makrophyten aus Literaturangaben hohe Wachstumsraten (µ Mentha aquatica: 0,060-0,070 d -1 ; µ Myriophyllum aquaticum : 0,073-0,129 d -1 ) bei geringen Variationskoeffizienten ( Mentha aquatica : 10,6-18,5%; Myriophyllum aquaticum : 6,0-15,1%) auf. In einer Makrophytenstudie von ARTS ET AL. (2008) werden bezüglich relativen Wachstums Variationskoeffizienten zwischen 11,9% (Myriophyllum spicatum) und 31,0% (Elodea canadensis) angegeben, bei Wachstumsraten in einem Bereich von 0,015 d -1 bis 0,065 d -1. In einer Studie von KNAUER ET AL. (2008) werden für Myriophyllum aquaticum sogar noch etwas höhere Wachstumsraten von bis zu 0,199 d -1 (Sprosslänge) angegeben. Diese enorme Längenzunahme ist vermutlich auf die in Kapitel beschriebene Ethylen induzierte Internodienstreckung zurückzuführen, die bei semiaquatischen Pflanzen eintritt, wenn sie komplett überflutet werden (siehe COOKSON & OSBORNE 1978; JACKSON 1985; KENDE ET AL. 1998; OSBORNE 1984; VOESENEK ET AL. 2004). Die geringen Variationskoeffizienten der beiden in diesem Versuch getesteten Pflanzen sind vermutlich auf die Möglichkeiten zurückzuführen, sehr ähnliche Ausgangsindividuen für die Versuche zu generieren (siehe auch KNAUER ET AL. 2006). Die Kultivierung über Stecklinge bei Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica unter definierten Bedingungen bietet ideale Voraussetzungen, eine hohe Anzahl von Pflanzen gleichen Entwicklungsstadiums, gleicher Größe und Form zu erhalten. Für aussagekräftige Biotests mit Makrophyten mit geringen Varianzen innerhalb der Kontrollen bzw. Belastungsstufen ist es daher unerlässlich, standardisierte Angaben zur Durchführung und Dauer der Vorkulturen zu machen, wie es bei dem OECD-Lemna-Test der Fall ist (OECD 2002) PHYTOPLANKTON Die Algenentwicklung in den Testmedien hielt sich in allen Ansätzen in Grenzen, wobei insgesamt die geringste Algenentwicklung mit 10,7 µg/l bzw. 1,3 µg/l Chlorophyll im Steinberg-Medium gemessen wurde. Leider konnten in keiner Veröffentlichung, die Labor-Biotests mit Makrophyten behandelt, qualitative Angaben zu Algen in den Testmedien gefunden werden, obwohl Algen die Sensitivität der Testorganismen beeinflussen können (siehe SZABO ET AL. 1998). So kann an dieser Stelle kein Vergleich zur Literatur vollzogen werden. Für die geringen Chlorophyll-Werte der in diesem Versuch getesteten Medien gegenüber den wesentlich höheren Werten des vorangegangen Ver- 95

117 Biotestentwicklung II suches (siehe Kapitel 3), bietet sich folgende Hypothese an, die sich auf zwei Überlegungen stützt: 1. Die Medien dieses Versuches wurden mit entionisiertem Wasser angesetzt, welches frei von Algen sein sollte. Die Medien aus Kapitel 3 wurden mit Teichwasser angesetzt, welches naturgemäß schon zu Versuchsbeginn eine Algenlebensgemeinschaft aufweist. 2. Durch die emerse Vorkultivierung der Testorganismen und einem anschließenden Untertauchen der Testorganismen zu Versuchsbeginn sind die Pflanzen nahezu frei von Periphyton, während submerse Pflanzen, die nicht unter sterilen Bedingungen kultiviert werden, i.d.r. eine Periphyton-Lebensgemeinschaft aufweisen (siehe z.b. PIP & ROBINSON 1984), auch wenn diese oft ohne Zuhilfenahme eines Mikroskops für das menschliche Auge unsichtbar ist. Würden mit Algen bewachsene Makrophyten in ein algenfreies Medium gesetzt werden, bestünde immer die Gefahr von Algenblüten GESAMTBEWERTUNG Eine abschließende Bewertung der drei getesteten Medien erfolgt maßgeblich aufgrund des Parameters Phytoplankton. Die Unterschiede zwischen den Medien bei den physikalisch-chemischen und den Wachstumsparametern sind zu gering, um eindeutig ein Medium für Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica zu empfehlen, auch wenn das Steinberg-Medium bezüglich Wachstumsparameter in einem Ranking leicht vor den anderen beiden liegt. Die geringste Algenentwicklung in diesem Medium sollte allerdings das ausschlaggebende Argument sein, Steinberg-Medium (bzw. verdünntes Steinberg-Medium) für weitere Versuche mit Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica zu empfehlen. 96

118 Biotestentwicklung III 5 BIOTESTENTWICKLUNG III: UNTERSUCHUNG DER AUSWIRKUNGEN EINER SELEKTIERENDEN WURZELVORBILDUNGSPHASE AUF DIE TESTORGANISMEN MENTHA AQUATICA UND MYRIOPHYLLUM AQUATICUM VOR VERSUCHSBEGINN 5.1 ZIELSETZUNG In der aktuellen Veröffentlichung Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides (MALTBY ET AL. 2010) wird ein Biotestdesign mit Myriophyllum sp. vorgestellt, welches eine Wurzelvorbildungsphase vor Versuchsbeginn beinhaltet. Hierzu werden die Sprossspitzen der Testpflanzen abgeschnitten und in künstliches, mit Wasser bedecktes, Sediment gesteckt. Nach 3 (M. aquaticum) bzw. 7 Tagen (M. spicatum) werden die Sprossspitzen aus dem Sediment entnommen und auf eine Eignung für den Versuch überprüft. Pflanzen, die ungesund aussehen oder noch keine Wurzeln gebildet haben, werden verworfen. Ziel dieses Versuches war es, den Nutzen bzw. die Notwendigkeit dieser Maßnahme zu überprüfen. In Anlehnung an MALTBY ET AL. (2010) wurde diese Wurzelvorbildungsphase in ein Testdesign mit Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica in emerser Form aufgenommen und einem Testdesign mit diesen beiden Makrophyten ohne eine derartige Wurzelvorbildungsphase gegenüber gestellt. 5.2 MATERIAL & METHODEN TESTORGANISMEN Für diesen Versuch wurden die beiden Amphiphyten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum im Gegensatz zum vorangegangenen Versuch aus Kapitel 4 in ihrer emersen Form gewählt. Angaben zu Herkunft, Vorkultur und Identifikation können dem Kapitel 4 entnommen werden. Für den Ansatz mit Wurzelvorbildungsphase wurden möglichst gleich große Sprossspitzen der Vorkulturen mit einer Rasierklinge abgeschnitten und in das künstliche Sediment gesteckt, welches mit Medium bedeckt war. Myriophyllum aquaticum wurde 3 Tage und Mentha aquatica 5 Tage unter Versuchsbedingungen (Licht, Temperatur) gehalten, um anschließend die Stecklinge auf Wurzelbildung zu untersuchen. Hierzu wurden die Stecklinge vorsichtig aus dem Sediment genommen und mit Wasser abgespült. Nur Organismen, die Wurzelansätze gebildet hatten und einen vitalen Eindruck vermittelten, wurden für den weiteren Versuch verwendet. Für den Ansatz ohne Wur- 97

119 Biotestentwicklung III zelvorbildungsphase wurde auf diesen Schritt verzichtet und die Stecklinge wurden gleich nach Abschneiden vermessen und für den Versuch eingesetzt VERSUCHSAUFBAU Der Versuch wurde in der in Kapitel 3 beschriebenen Wachstumskammer durchgeführt. Die Sprossspitzen der Testorganismen wurden wie in Kapitel 4 beschrieben, in ein mit 60 g Sediment (siehe unten) befülltes 40 ml-becherglas gesteckt. Dabei wurde jeweils das untere Blattpaar bzw. der untere Blattwirtel in das Sediment gesteckt, um die Pflanze zu verankern. Jeweils drei Pflanzen wurden mit ihren Sedimentbechergläsern in ein 2 L-Becherglas (hohe Passform; 12 cm Durchmesser) gestellt. Danach wurden in die 2 L-Bechergläser jeweils 500 ml Testmedium zugegeben, sodass die Sedimentgläschen und der untere Teil der Testpflanzen überflutet wurden, der obere Teil der Testpflanzen aber noch aus dem Medium herausragte (siehe Abbildung 39 und Abbildung 40). Je Pflanzenart und zu testenden Medium wurden vier 2 L-Bechergläser à 3 Testpflanzen in die Wachstumskammer gestellt, sodass sich je Pflanze und Medium 12 (Pseudo-)Replikate ergaben. Die 2 L-Bechergläser wurden anschließend mit einer perforierten Klarsichtfolie abgedeckt um Transpirationsverluste gering zu halten. Perforierte Klarsichtfolie 2 L Becherglas Testpflanze Test-Medium 40 ml Becherglas + Sediment Abbildung 39: Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in einem 2 L-Becherglas LICHT & TEMPERATUR Es wurde eine Lichtstärke von ca Lux in der Wachstumskammer eingestellt und regelmäßig mit einem Luxmeter (LXOIOBS LX1010BS) überprüft. Während des Versuchszeitraumes wurden die Bechergläser alle 2-3 Tage nach einem Rotationsprinzip umgesetzt. Per Zeitschaltuhr wurde ein Licht-Dunkel-Rhythmus von 16 h:8 h einge- 98

120 Biotestentwicklung III stellt. Die Temperatur des Wassers betrug während des Versuches 21 +/- 2 C und wurde mit einem digitalen Min/Max-Thermometer überprüft. A B Abbildung 40: (A) Sprossspitze von Myriophyllum aquaticum im 40 ml-sedimentgläschen. (B) Testpflanzen mit 40 ml-sedimentgläschen im 2 L-Becherglas mit 500 ml Medium MEDIUM Für diesen Versuch wurde Steinberg-Medium, 1:2 mit entionisiertem Wasser verdünnt, verwendet. Die Zusammensetzung des Mediums ist dem Kapitel 4 zu entnehmen SEDIMENT Es wurde künstliches OECD-Sediment, modifiziert nach FEILER (2008), verwendet. Die Zusammensetzung des künstlichen Sediments ist dem Kapitel 4 zu entnehmen VERSUCHSDAUER Die Versuchsdauer betrug 7 Tage bei Myriophyllum aquaticum und 14 Tage bei Mentha aquatica, gegebenenfalls zusätzlich zu der Wurzelvorbildungsphase MONITORING DER CHEMISCH-PHYSIKALISCHEN PARAMETER Mit einem WTW Multiparameter Messgerät (Multi 197i) wurden die physikalischen Parameter Sauerstoffgehalt (Sauerstoffsensor CellOx 325), ph-wert (ph- Einstabmesskette SinTex 61) und Leitfähigkeit (Leitfähigkeitsmesszelle TetraCon 325) der Medien gemessen. Diese Parameter wurden zu Beginn (Tag 0) und zum Ende des Versuches (Tag 7 bzw. Tag 14) aufgenommen. 99

121 Biotestentwicklung III ERFASSUNG DER WACHSTUMSPARAMETER Zu Beginn und am Ende des Versuches wurden das Frischgewicht und die Sprosslänge der Testorganismen bestimmt. Nähere Angaben zur Ermittlung der Wachstumsparameter sind dem Kapitel 3 zu entnehmen. Ferner wurde zum Ende des Versuches die längste Wurzel jeder Testpflanze mit einem Lineal gemessen (Genauigkeit: 0,1 cm) DATEN-ANALYSE Die Datenaufbereitung und -analyse erfolgte über die Software Graphpad Prism 5.0 und MS Excel Für alle Parameter wurden der Mittelwert (arithmetisches Mittel) und der Variationskoeffizient ermittelt. Für die Wachstumsparameter wurden zusätzlich die durchschnittlichen Wachstumsraten berechnet, die mit ihrer Standardabweichung graphisch dargestellt werden. Die entsprechenden Formeln sind dem Kapitel zu entnehmen. Die Wachstumsrate der Wurzellänge konnte nicht mit der logarithmischen Formel 3 berechnet werden, da die Länge zum Versuchsbeginn 0 ist. Daher wurde zur Berechnung der Wachstumsrate bezüglich Wurzellänge die Formel 4 angewendet, die lineares Wachstum zugrunde legt. Formel 4: µ i j N j ( t j i t ) µ i-j : spezifische Wachstumsrate vom Zeitpunkt i zum Zeitpunkt j N j : Wurzellänge zum Zeitpunkt j t i : Zeitpunkt zum Start der Studie (in Tagen) t j : Zeitpunkt zum Ende der Studie (in Tagen) 5.3 ERGEBNISSE CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Die Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien werden zusammenfassend in den Tabelle 23 und Tabelle 24 wiedergegeben. Bei keinem der beiden Testorganismen können bei den Parametern Leitfähigkeit, ph-wert und Sauerstoffgehalt des Mediums signifikante Unterschiede zwischen dem Ansatz mit Wurzelvorbildungsphase und dem Ansatz ohne Wurzelvorbildungsphase festgestellt werden. 100

122 Biotestentwicklung III Tabelle 23: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien zu Beginn (Tag 0) und am Ende (Tag 7) der Testreihen von Myriophyllum aquaticum (n=12). ohne Wurzelvorbildungsphase mit Wurzelvorbildungsphase Leitfähigkeit [µs/cm] ph O2 [mg/l] Tag der Studie Mittelwert Mittelwert , , , ,7 0 6,6 0,5 6,5 0,5 7 7,9 1,3 7,9 0,2 0 7,2 7,8 8,3 1,1 7 12,4 0,8 11,9 0,9 Tabelle 24: Ergebnisse der chemisch-physikalischen Parameter der Medien zu Beginn (Tag 0) und am Ende (Tag 14) der Testreihen von Mentha aquatica (n=12). ohne Wurzelvorbildungsphase mit Wurzelvorbildungsphase Leitfähigkeit [µs/cm] ph O2 [mg/l] Tag der Studie Mittelwert Mittelwert , , , ,2 0 6,7 1,6 6,7 0,1 14 8,2 0,8 8,2 1,1 0 7,9 1,6 7,2 4,8 14 9,5 4,5 10,4 7, WACHSTUMSPARAMETER Die Ergebnisse der Wachstumsparameter Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge sind zusammenfassend in der Tabelle 25 dargestellt. Die logarithmisch berechneten Parameter Frischgewicht und Sprosslänge sind zusätzlich graphisch in der Abbildung 41, der linear berechnete Parameter Wurzellänge in Abbildung 42 dargestellt. In der Abbildung 41 wird deutlich, dass insbesondere Myriophyllum aquaticum ohne Wurzelvorbildungsphase ein deutlich höheres Wachstum bezüglich Frischgewicht (12% höher) und Sprosslänge (40% höher) aufweist als mit Wurzelvorbildungsphase. Auch das Wachstum von Mentha aquatica ist ohne Wurzelvorbildungsphase bezüglich Frischgewicht um 19%, bezüglich Sprosslänge um 13% höher als mit Wurzelvorbildungsphase. Dagegen ist das Wurzellängenwachstum mit Wurzelvorbildungsphase bei Myriophyllum aquaticum um 32%, bei Mentha aquatica um 20% höher als ohne Wurzelvorbildungsphase. Betrachtet man die Variationskoeffizienten der unterschiedlichen Parameter bei den beiden Testorganismen, liegt bei zwei von sechs Parametern der Variationskoeffizient ohne Wurzelvorbildungsphase höher (Frischgewicht bei Myriophyllum aquaticum und Sprosslänge bei Mentha aquatica), bei den anderen vier Parametern liegt der Varia- 101

123 Wachstumsrate Wachstumsrate Biotestentwicklung III tionskoeffizient mit Wurzelvorbildungsphase höher. Während bei dem Ansatz ohne Wurzelvorbildungsphase alle gemessenen Parameter einen Variationskoeffizienten kleiner als 20% aufweisen, liegen bei dem Ansatz mit Wurzelvorbildungsphase drei von sechs Variationskoeffizienten höher als 20%. Alle Testorganismen wiesen sowohl bei dem Ansatz mit Wurzelvorbildungsphase als auch ohne Wurzelvorbildungsphase eine Wurzelbildung am Ende des Versuches auf. Tabelle 25: Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Wachstumsraten ohne Wurzelvorbildungsphase und mit Wurzelvorbildungsphase. ohne Wurzelvorbildungsphase Myriophyllum aquaticum mit Wurzelvorbildungsphase Mittelwert Mittelwert Frischgewicht * 0,116 15,0 0,102 6,7 Sprosslänge * 0,048 11,4 0,029 22,3 Wurzellänge ** 0,408 9,3 0,540 12,9 Mentha aquatica Frischgewicht * 0,053 12,0 0,043 36,8 Sprosslänge * 0,060 17,3 0,052 14,7 Wurzellänge ** 0,332 14,0 0,400 27,2 *µ i-j = (ln(n j)-ln(n i))/(t j-t i) [d -1 ] **µ i-j = N j/(t j-t i) [cm*d -1 ] Myriophyllum aquaticum Mentha aquatica FG SL 0.00 FG SL ohne Wurzelvorbildungsphase mit Wurzelvorbildungsphase Abbildung 41: Darstellung der Wachstumsraten Frischgewicht (FG) und Sprosslänge (SL) [d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica (n=12). 102

124 Wachstumsrate Wachstumsrate Biotestentwicklung III Myriophyllum aquaticum Mentha aquatica WL ohne Wurzelvorbildungsphase mit Wurzelvorbildungsphase 0.0 WL Abbildung 42: Darstellung der Wachstumsraten Wurzellänge (WL) [cm*d -1 ] und ihrer Standardabweichung von Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica (n=12). 5.4 DISKUSSION CHEMISCH-PHYSIKALISCHE PARAMETER Da die chemisch-physikalischen Parameter keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Ansätzen mit Wurzelvorbildungsphase und ohne Wurzelvorbildungsphase aufweisen, können diese Parameter auch nicht für eine Bewertung herangezogen werden WACHSTUMSPARAMETER Die Wachstumsparameter Frischgewicht und Sprosslänge zeigen bei beiden Testorganismen, dass ein höheres Wachstum erzielt wird, wenn auf eine Wurzelvorbildungsphase verzichtet wird. Ein vermindertes Wachstum ist vermutlich auf Stress zurückzuführen, dem die Pflanzen ausgesetzt werden, wenn die Stecklinge aus dem Sediment genommen werden, um sie auf Wurzelbildung zu untersuchen. Dieser wachstumshemmende Stress lässt sich durch 2 Hypothesen erklären: 1. Die an der Spitze der Wurzel liegende Kalyptra (Wurzelhaube) sondert ein schleimiges Polysaccharid ab, das als Gleitmittel für die ins Sediment vordringende Wurzel fungiert (RAVEN ET AL. 2006). Der umgesetzte Steckling mit Wurzelansätzen muss wieder neu anfangen, das chemische Milieu und die Schleimhülle im Sediment um die Kalyptra aufzubauen. 103

125 Biotestentwicklung III 2. Mikroskopisch kleine, einzellige Wurzelhaare spielen aufgrund der enormen Oberflächenvergrößerung der Rhizodermis eine wichtige Rolle in der Absorption von Nährstoffen und Wasser (siehe z.b. BRESINSKY ET AL. 2008). Bei dem Herausnehmen des Stecklings aus dem Sediment werden diese feinen Wurzelhaare, die in kleinste Hohlräume in der Erde bzw. im Sediment eindringen, unweigerlich abgerissen. Das Ziel der Wurzelvorbildungsmaßnahme, geringere Varianzen zwischen den Replikaten zu erhalten (siehe MALTBY ET AL. 2010), konnte anhand dieses Versuches nicht bestätigt werden. Im Gegenteil - die höchsten Variationskoeffizienten wurden bei dem Ansatz mit Wurzelvorbildungsphase verzeichnet. Bei beiden Testorganismen gab es keine Ausfälle durch Stecklinge, die kein Wurzelwachstum zeigten oder durch eine nicht-vitale Erscheinung auffielen GESAMTBEWERTUNG Dieser Versuch zeigt für die Testorganismen Myriophyllum aquaticum und Mentha aquatica, dass die Maßnahme der Wurzelvorbildungphase zum Erreichen geringerer Varianzen zwischen den Replikaten zu einem gegenteiligen Ergebnis führt. Da 100% der Testorganismen eine stattliche Wurzelbildung am Ende des Versuches bei beiden Ansätzen zeigten, scheint für diese beiden Arten eine Wurzelvorbildungsphase unnötig. Bei anderen Makrophyten, deren Stecklinge mit geringerer Wahrscheinlichkeit zur Wurzelbildung angeregt werden, könnte ein derartiges Vorgehen weiterhin eine geeignete Maßnahme sein. Allerdings wird eine Selektion der Testorganismen nach einer Wurzelvorbildungsphase immer eine gewisse Stresssituation für die Pflanzen bedeuten, da die Pflanzen nach beginnender Wurzelbildung aus dem Sediment genommen werden und gegebenenfalls ein zweites Mal eingepflanzt werden. 104

126 Biotestentwicklung IV 6 BIOTESTENTWICKLUNG IV: DIE EFFEKTIVE QUANTENAUSBEUTE DER PHOTOCHEMISCHEN ENERGIEÜBER- TRAGUNG VON MAKROPHYTEN ALS BIOMARKER 6.1 ZIELSETZUNG Die Erfassung von durch eine Testsubstanz hervorgerufenen Effekten erfolgt bei dem zurzeit einzigen in Europa nach OECD standardisierten Makrophytenbiotest mit der Wasserlinse (Lemna) nur anhand des Wachstums (OECD 2002). Auch bei den zwei sich in der Entwicklung befindenden Myriophyllum-Tests der AMRAP-Gruppe und des Umweltbundesamtes sind bislang nur Wachstums-Endpunkte vorgesehen (MALTBY ET AL. 2010; MALETZKI & BEULSHAUSEN 2009). Da unterschiedliche Pflanzen verschieden auf unterschiedliche Stresssituationen reagieren, müssen diese nicht zwangsläufig zeitnah zu vermindertem Wachstum führen. Eine für die Pflanze toxische Substanz kann z.b. zunächst erst mal zu einer Änderung des Gewebes oder zu Chlorosen führen, die sich möglicherweise erst zeitversetzt auf das Wachstum auswirken. Daher wäre es günstig, für eine effektive Risikobewertung eines Stoffes bezüglich Makrophyten zusätzlich zu Wachstumsparametern auch physiologische bzw. biochemische Endpunkte anzuwenden. Mit Hilfe eines derartigen Biomarkers, also einer Messung von Umweltstress auf suborganismischem Level (ADAMS 2002), könnten bestimmte Effekte schneller erfasst und identifiziert werden. Die Photosynthese als zentraler biochemischer Prozess von Pflanzen ist ein idealer Indikator um eine Beeinträchtigung der Vitalität von Pflanzen aufzudecken bzw. zu quantifizieren. Die Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz hat sich bereits als eine sensitive, einfache und schnelle Methode bewährt um Stress wie z.b. Photoinhibition und Effekte von Schadstoffen auf Pflanzen zu erfassen (JUNEAU ET AL. 2001; KRAUSE & WEIS 1984; LICHTENTHALER 1988). Besonders die Erfassung der effektiven Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung des Photosystems II anhand eines PAM-Fluorometers stellt eine äußerst sensitive Methode dar um Störungen im Photosyntheseapparat zu detektieren (HUANG ET AL. 1997; KRAUSE & WEIS 1991). Obwohl mehrere Veröffentlichungen auf den Nutzen der PAM-Technologie in ökotoxikologischen Tests und Untersuchungen mit Makrophyten hinweisen oder diese in ökotoxikologischen Fragestellungen bereits zum Einsatz kam (CONRAD ET AL. 1993; KNAUERT ET AL. 2010; KÜSTER & ALTENBURGER 2007; LAMBERT ET AL. 2006; MARWOOD ET AL. 2001; MARWOOD ET AL. 2003; RALPH 2000; RITZENTHALER 2006; SNEL ET AL. 1998; VERVLIET-SCHEEBAUM ET AL. 2008), ist sie noch nicht in der Risikobewertung von Herbiziden etabliert. Ziel dieser Studie ist es daher die Anwendung dieser Methode bei Makrophytenbiotests zu 105

127 Biotestentwicklung IV validieren und systematisch bei verschiedenen Makrophyten zu untersuchen. Hierzu wurde in jeweils 14tägigen Einzelspeziestests die Wirkung der beiden Testsubstanzen Atrazin und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) auf eine Reihe verschiedener Makrophyten sowohl bezüglich Wachstumsparameter, physikalisch-chemischer Parameter des Mediums als auch Chlorophyll-Fluoreszenz mit einer Mini-PAM (Walz) untersucht. Anhand der beiden Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D sollte überprüft werden, ob die Quantenausbeute des PSII sich als Biomarker in Makrophytenbiotests eignet um das Umweltgefährdungspotential von Herbiziden bezüglich Wasserpflanzen zu bewerten. Atrazin als Photosyntheseinhibitor bindet an das Chinon Q B der Elektronentransportkette im Photosystem II von Pflanzen und unterbricht dort den Elektronentransport (TREBST 1995), was folglich zu einer Absenkung der effektiven Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung im Photosystem II führt. Daher bietet sich Atrazin als Referenzsubstanz an um die Korrelation der Quantenausbeute des PSII auf das Pflanzenwachstum zu untersuchen. 2,4-D hingegen zielt nicht direkt auf den Photosyntheseapparat, sondern schädigt Pflanzen durch die hohe Auxinaktivität, die zu unkontrolliertem Wachstum, Deformationen und welkenden Blättern führt. Das unkontrollierte Wachstum kann schließlich zum Absterben der Pflanze führen und kann nicht oder nur schlecht inaktiviert werden (SANDMANN & BÖGER 1995). Andererseits sind von 2,4-D auch schädigende Effekte auf Chlorophyll bzw. die Chlorophyllproduktion bekannt (EA 2007; GÖNCZ & SENČIČ 1994). Mit dieser Modellsubstanz sollte der Frage nachgegangen werden, ob mit Hilfe der Quantenausbeute des PSII auch Substanzen auf ihr Umweltrisiko bewertet werden können, die nicht direkt auf den Photosyntheseapparat zielen, aber möglicherweise zu sekundären Schädigungen dessen führen. Die Ergebnisse der Quantenausbeute des PSII wurden konventionellen Wachstumsendpunkten gegenübergestellt, um die Sensitivität dieser Methode gegenüber bestimmten Wirkmechanismen einzuordnen. Zudem wurden auch die physikalisch-chemischen Parameter des Mediums ph-wert, O 2 -Gehalt und Leitfähigkeit herangezogen, um weitergehende Informationen zu Photosyntheseleistung, Nährstoffverbrauch bzw. Elektrolytaustritt zu erhalten. Um der Vielfalt bezüglich Taxonomie, Morphologie und Lebensform von Makrophyten Rechnung zu tragen, wurden 7 verschiedene, repräsentative Makrophyten ausgewählt. Diese wurden nach ihrer Lebensform in drei Gruppen eingeteilt, für die jeweils ein angepasstes Testdesign entwickelt wurde. Dabei sollte ein möglichst standardisiertes Testdesign eine hohe Reproduzierbarkeit der Tests gewährleisten. Die erste Gruppe umfasst die kleinen, an der Wasseroberfläche frei schwimmenden Arten Lemna gibba, Riccia fluitans und Salvinia natans. Die zweite Gruppe setzt sich aus den beiden emersen Arten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum zusammen, während die dritte Gruppe von den beiden submersen Wasserpflanzen Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis gebildet wird. Neben der Validierung der PAM-Technik war ein 106

128 Biotestentwicklung IV weiteres Ziel der Studie, die für die verschiedenen Makrophyten-Gruppen angepassten Testdesigns und die verwendeten Makrophyten bezüglich Sensitivität und Handhabbarkeit zu validieren. Um unerwünschte Algenbildung in den Testsystemen zu quantifizieren, wurde bei den beiden Makrophytengruppen mit submersen und emersen Wasserpflanzen jeweils zum Ende der Studie die Phytoplanktondichte des Mediums per verzögerter Fluoreszenz analysiert. 6.2 MATERIAL & METHODEN TESTORGANISMEN Die Studie umfasst Versuche mit 7 verschiedenen Makrophyten, die nach ihrer Lebensform in 3 Gruppen unterteilt wurden. Die Tabelle 26 listet die verwendeten Makrophyten auf, stellt ihre Gruppenzugehörigkeit nach der Lebensform dar und gibt Informationen bezüglich Wurzeln und Taxonomie. Die Bestimmung der Arten wurde mit einschlägiger Bestimmungsliteratur durchgeführt (ROTHMALER 2000; SCHMEIL 1996; VAN DE WEYER & SCHMIDT 2007). Tabelle 26: Übersicht über die verwendeten Makrophyten und ihre Gruppenzugehörigkeit mit Informationen zu Lebensform, Wurzeln und Taxonomie. Lebensform Wurzeln Taxonomie 1. Gruppe Lemna gibba frei schwimmend Wurzel frei im Wasser Monokotyledonae Riccia fluitans frei schwimmend keine Wurzel Marchantiophyta Salvinia natans frei schwimmend Wurzel frei im Wasser 1 Pteridophyta 2. Gruppe Mentha aquatica emers im Sediment wurzelnd Dikotyledonae Myriophyllum aquaticum emers im Sediment wurzelnd Dikotyledonae 3. Gruppe Ceratophyllum demersum submers keine Wurzel Dikotyledonae Vallisneria spiralis submers im Sediment wurzelnd Monokotyledonae Die Testorganismen wurden vor Versuchsbeginn 2 Wochen unter Versuchsbedingungen (Sediment, Medium, Licht, Temperatur) in 60 L Aquarien vorkultiviert (siehe Abbildung 43). Nach jeweils einer Woche wurde das Medium der Vorkulturen durch neues Medium ersetzt. Die standardisierte Gewinnung von Testorganismen der Gruppe 2- Makrophyten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum ist dem Kapitel 4 zu entnehmen. 1 Es handelt sich eigentlich um Blattmorphosen, die das Aussehen und die Funktion von Wurzeln übernommen haben. 107

129 Biotestentwicklung IV Abbildung 43: Vorkultur von Ceratophyllum demersum VERSUCHSAUFBAU Die 14 Versuche (7 Makrophyten Einzelsspeziestests á 2 Modellsubstanzen) wurden in der in Kapitel 3 beschriebenen Wachstumskammer durchgeführt. Vor Einsetzen der Testorganismen wurde dem Medium der belasteten Systeme Atrazin-Stammlösung bzw. 2,4-D-Stammlösung zugegeben, sodass sich die in Tabelle 27 angegebenen Nominalkonzentrationen ergaben. Die Modellsubstanzen der Stammlösung wurde mit 98%igen unvergälltem Ethanol als Lösungsvermittler unter 48 h Rühren auf einem Magnetrührer in Lösung gebracht. Es wurden 4 Konzentrationsstufen sowie eine Kontrollreihe mit (SC) und eine Kontrollreihe ohne Lösungsvermittler (C) angesetzt. Der Kontrollreihe mit Lösungsvermittler (SC) und den unterschiedlichen Belastungsstufen wurde eine entsprechende Menge an Ethanol zugefügt um die Endkonzentration an Ethanol der höchsten Konzentrationsstufe zu erreichen. In der Gruppe 1 wurde auf diese Ethanolzugabe verzichtet, da die absolute Ethanol-Menge höchstens 0,71 µl betragen hätte und technisch nicht durchführbar war. Die Endkonzentration an Ethanol der Gruppe 2 und Gruppe 3-Medien betrug 0,01%. Tabelle 27: Nominalkonzentrationen der Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D. Konzentrationsstufen Nominal-Konzentration Atrazin [µg/l] Nominal-Konzentration 2,4-D [µg/l] C 0 0 SC 0 0 I II III IV

130 Biotestentwicklung IV A B C Abbildung 44: Versuchsansatz der Gruppe 1-Makrophyten. A: Lemna gibba. B: Riccia fluitans. C: Salvinia natans. Die einzelnen Replikate der Testorganismen der Gruppe 1 wurden in 40 ml Bechergläsern mit 20 ml Medium eingesetzt (siehe Abbildung 44). Von dem Testorganismus Lemna gibba wurden je Becherglas 4 Fronds eingesetzt. Von Riccia fluitans wurden 0,05 g je Becherglas eingesetzt. Salvinia natans wurde mit einer Rasierklinge auf 4 Schwimmblätter und einer Anlage eines jungen Blattpaares gestutzt, bevor es eingesetzt wurde. Je Kontroll- und Versuchsreihe der Gruppe 1-Makrophyten wurden 5 Replikate zugeteilt. Die Sprossspitzen der Testorganismen der Gruppe 2 wurden mit einer Rasierklinge so gekappt, dass die Testpflanzen von Mentha aquatica 4 Nodien aufwiesen und die Testpflanzen von Myriophyllum aquaticum eine Sprosslänge von 5-6 cm aufwiesen. Diese Stecklinge wurden jeweils wie in Kapitel 4 beschrieben in mit 60 g modifiziertem OECD-Sediment befüllte 40 ml Bechergläser gesteckt, sodass das unterste Blattpaar bzw. der unterste Blattwirtel im Sediment vergraben war. Jeweils 3 der auf diese Weise gepflanzten Stecklinge wurden in ein mit 500 ml Medium befülltes 2 L Becherglas (hohe Passform; 12 cm Durchmesser) gestellt, sodass der untere Teil der Pflanze überflutet A B Abbildung 45: Versuchsansatz der Gruppe 2-Makrophyten. A: Mentha aquatica. B: Myriophyllum aquaticum. 109

131 Biotestentwicklung IV wurde, der obere Teil der Pflanze aber noch aus dem Medium heraus ragte (siehe Abbildung 45). Je Kontroll- und Versuchsreihe der Gruppe 2-Makrophyten wurden 3 Bechergläser á 3 Pflanzen zugewiesen, sodass sich jeweils 9 (Pseudo-)Replikate ergaben. Die Testorganismen der Gruppe 3-Makrophyten wurden ebenso wie bei der Gruppe 2 in mit 50 g modifiziertem OECD-Medium in 40 ml Bechergläser gepflanzt. Bei Vallisneria spiralis wurden die Wurzeln vorher mit einer Rasierklinge abgeschnitten und die Blätter auf eine Länge von 6 cm gestutzt. Bei Ceratophyllum demersum wurden nur Organismen ausgewählt, die eine Sprosslänge zwischen 7 und 16 cm aufwiesen. Die in das modifizierte OECD-Sediment gepflanzten Testorganismen wurden jeweils zu dritt in ein mit 1500 ml Medium befülltes 2 L Becherglas (hohe Passform; 12 cm Durchmesser) gestellt, sodass die Pflanzen der Gruppe 3 vollkommen untergetaucht waren. Die Bechergläser aller Versuchsansätze wurden mit einer perforierten Klarsichtfolie abgedeckt um Verdunstungsverluste möglichst gering zu halten. Eine zusammenfassende Übersicht über die Versuchsansätze der verschiedenen Gruppen gibt die Tabelle 28. Tabelle 28: Übersicht über die Versuchsansätze der verschiedenen Makrophyten-Gruppen. Gruppe Volumen Medium [ml] 1 (frei schwimmend) 20 2 (emers) (submers) 1500 Zusammensetzung Medium filt. Teichwasser/Steinberg- Medium (1:1) ention. Wasser/Steinberg- Medium (1:1) filt. Teichwasser/Steinberg- Medium (1:1) Sediment - mod. OECD-Sediment mod. OECD-Sediment LICHT & TEMPERATUR Die Vorkulturen und die Tests wurden bei einem 16 h:8 h Licht-/Dunkel-Rhythmus mit ca Lux und einer Temperatur von 23 +/- 2 C durchgeführt. Während des Versuchszeitraumes wurden die Bechergläser alle 2-3 Tage nach einem Rotationsprinzip umgesetzt MEDIUM Vorversuche (die in dieser Veröffentlichung nicht dargestellt werden) hatten ergeben, dass bis auf Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum alle anderen in dieser Studie eingesetzten Makrophyten schlechte Vitalität (geringes Wachstum, Chlorose, Nekrose) und/oder übermäßiges Aufkommen von Algen in reinem standardisiertem Nährmedium zeigten. Wurde das Nährmedium dagegen zu 50% mit filtriertem Teichwasser 110

132 Biotestentwicklung IV gemischt, traten diese unerwünschten Effekte nicht auf. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurden für die Makrophyten-Gruppen zwei unterschiedliche Medien gewählt. Das Medium der Gruppe 1- und der Gruppe 3-Makrophyten setzte sich zu 50% aus filtriertem Teichwasser und zu 50% aus Steinberg-Medium zusammen. Das Medium der Gruppe-2-Makrophyten bestand zu 50% aus entionisiertem Wasser und zu 50% aus Steinberg-Medium. Die Zusammensetzung des Steinberg-Mediums ist der Tabelle 16 aus Kapitel 4 zu entnehmen SEDIMENT Das für die Makrophyten-Gruppen 2 und 3 verwendete künstliche OECD-Sediment (modifiziert nach FEILER 2008) wurde wie in Kapitel 4 beschrieben angesetzt VERSUCHSDAUER Die Versuchsdauer betrug je Testreihe (ein Testorganismus á eine Modellsubstanz) 2 Wochen ANALYTIK Die Stammlösungen der Modellsubstanzen wurden mit einer HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Agilent 1200 analysiert. Die Analysen wurden extern vom Institut für Bodenkunde und Bodenerhaltung der Justus Liebig Universität Gießen durchgeführt. Details der Durchführung sind in der Tabelle 29 aufgelistet. Tabelle 29: Charakteristika der HPLC-Messungen. Atrazin 2,4-D Säule Zorbax Eclipse XDB-C18 Zorbax Eclipse XDB-C18 Temperatur der Säule 40 C 40 C Injektionsvolumen 60 µl 60 µl DAD Diode Array Detector G1315B Diode Array Detector G1315B Mobile Phase Wasser (62%), Acetonitril (35%), Phosphatpuffer (3%) Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase 1ml/min Phosphatpuffer (85% bzw. 65%), Acetonitril (15% bzw. 35%) - gradientabhängig 1ml/min 111

133 Biotestentwicklung IV MONITORING DER CHEMISCH-PHYSIKALISCHEN PARAMETER Die Parameter ph-wert, Sauerstoffgehalt, Leitfähigkeit und Temperatur wurden zu Beginn und zum Ende der Studie, wie in Kapitel 3 beschrieben, gemessen, wobei der Sauerstoffgehalt nur bei den submersen Arten Riccia fluitans, Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis gemessen wurde ERFASSUNG DER WACHSTUMSPARAMETER Die Wachstumsparameter wurden zu Beginn und am Ende der Studie erfasst. Die Tabelle 30 gibt einen Überblick, welche Wachstumsparameter bei welchem Testorganismus gemessen wurden. Die Ermittlung des Frischgewichts erfolgte wie in Kapitel 3 beschrieben mit einer Digitalwaage (Kern GS LMOM 1203) mit einer Genauigkeit von d=0,01 g, wobei auf 0,5 g gerundet wurde. Die Ermittlung der Sprosslänge und der Wurzellänge erfolgten mit einem Lineal mit einer Genauigkeit von 0,1 cm. Die Länge der Seitentriebe von Ceratophyllum demersum wurde zu der Länge des Hauptsprosses hinzuaddiert. Die Wurzellänge wurde über die längste Wurzel bestimmt. Bei Lemna gibba wurde als Wachstumsparameter die Anzahl der Fronds herangezogen. Tabelle 30: Übersicht über die angewendeten Wachstumsparameter bei den verschiedenen Testorganismen. Testorganismus Gewicht Sprosslänge Wurzellänge Anzahl Fronds Lemna gibba Riccia fluitans X Salvinia natans X Mentha aquatica X X X Myriophyllum aquaticum X X X Ceratophyllum demersum X X Vallisneria spiralis X X X X ERFASSUNG DER QUANTENAUSBEUTE DES PSII Die Quantenausbeute des PSII der Testorganismen wurde mit einer Mini-PAM der Firma Walz mit einer Leaf-Clip Extension (Leaf-Clip Holder 2030-B) gemessen. Hierzu wurden die Sedimentgläschen mit den Testorganismen mit einer Edelstahlzange vorsichtig aus dem Medium herausgeholt. Die Pflanzen wurden daraufhin mit einem Papiertuch trocken getupft. Die Makrophyten der Gruppe 1 wurden für die Fluoreszenz- Messungen in eine Prospekthülle (Durable DIN A4 Glasklar. No. 2672) gesteckt, um das Einspannen in den Leaf-Clip Holder zu ermöglichen (siehe Abbildung 46A). Die Fluoreszenz-Messungen an den Makrophyten der Gruppe 2 und Gruppe 3 wurden direkt 112

134 Biotestentwicklung IV an der Pflanze an der Sprossspitze bzw. den obersten Blättern durchgeführt (siehe Abbildung 46B). Die Quantenausbeute des PSII wird von der Mini-PAM ausgegeben und berechnet sich nach der Formel 5. Die Quantenausbeute des PSII wurde in jeder Versuchsreihe 2 Stunden nach Applikation und an den Tagen 2, 7 und 14 der jeweiligen Studie gemessen. Formel 5: Quantenausbeute = (Fm -F t )/Fm Quantenausbeute: Quantenausbeute des PSII Fm : maximale Fluoreszenz F t : steady-state Fluoreszenz A B Abbildung 46: (A) PAM-Messung an einem Gruppe 1-Makrophyten (Lemna gibba). (B) PAM-Messung an einem Gruppe 2-Makrophyten (Mentha aquatica) ERFASSUNG DES PHYTOPLANKTONS IM MEDIUM Jeweils am Ende einer Studie (Tag 14) der Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten wurde die Phytoplanktondichte der Medien per verzögerter Fluoreszenz, wie in Kapitel 3 beschrieben, analysiert. Das Volumen des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten war zu gering, um dort diese Methode anzuwenden DATEN-ANALYSE Die Datenaufbereitung und -analyse erfolgte über die Software Graphpad Prism 5.0 und MS Excel Für die Darstellung und Berechnung der Ergebnisse wurden die tatsächlichen, durch die HPLC-Messungen bestätigten, Konzentrationen herangezogen. Für alle Parameter wurden, wie in Kapitel 3 beschrieben, der Mittelwert (arithmetisches 113

135 Biotestentwicklung IV Mittel) und der Variationskoeffizient ermittelt (Formel 1 und Formel 2). Die Wachstumsraten der Parameter Sprosslänge, Frischgewicht und Anzahl der Fronds wurden wie in Kapitel 3 mit der Formel 3 berechnet, um einen Vergleich zu anderen Arbeiten zu ermöglichen (z.b. ARTS ET AL. 2008; CEDERGREEN ET AL. 2004; KNAUER ET AL. 2006; KNAUER ET AL. 2008). Die Wachstumsraten des Parameters Wurzellänge wurden mit der Formel 4 aus Kapitel 5 berechnet aufgrund der in Kapitel 5 beschriebenen Problematik, dass die Logarithmisierung von 0 nicht zulässig ist. Die Berechnung der Hemmung eines Parameters erfolgte über die Formel 6. ( x x SC Belastungstufe Formel 6: Hemmung Belastungstufe 100 xsc x SC : Mittelwert eines Parameters der SC-Reihe. x Belastungstufe: Mittelwert eines Parameters der entsprechenden Belastungsstufe. ) In einigen Fällen kann durch einen negativen 100 übersteigen. In diesen Fällen wird die Hemmung = 100 gesetzt. Für folgende Parameter wurde eine Hemmung berechnet: xbelastungs stufe-wert die Hemmung Belastungsstufe Wachstumsrate (Frischgewicht, Sprosslänge, Wurzellänge, Anzahl Fronds); Quantenausbeute (zu den verschiedenen Messzeitpunkten); Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums über den gesamten Versuchszeitraum; Zunahme des ph-wertes des Mediums über den gesamten Versuchszeitraum; Zunahme des O 2 -Gehaltes des Mediums über den gesamten Versuchszeitraum. Die EC50- und EC10-Berechnungen erfolgten über Regressionsanalysen (variable slope) mit Graphpad Prism 5.0. Hierfür wurde die Funktion der Software "log(agonist) vs. response -- Find ECanything" verwendet. Es werden nur EC-Werte angegeben, wenn die Grenzen des 95%-Konfidenzintervalls nicht größer oder kleiner sind, als der EC-Wert multipliziert mit dem Faktor Über One-way Analysis of Variance (ANOVA)-Analysen mit anschließendem Dunnett's Multiple Comparison Test wurden signifikante Unterschiede der belasteten Systeme zu der SC-Kontrollreihe ermittelt. Die niedrigste Konzentrationsstufe mit einer signifikanten, negativen Abweichung zur SC-Kontrollreihe wird als LOEC-Wert definiert. Die nächst kleinere Konzentrationsstufe wird entsprechend als NOEC-Wert definiert. 114

136 Biotestentwicklung IV 6.3 ERGEBNISSE ANALYTIK Atrazin Die tatsächlichen Konzentrationen von Atrazin im Medium der verschiedenen Testreihen, die sich durch die Analyse der Stammlösungen ergeben, sind in der Tabelle 31 aufgelistet. Die tatsächlichen Konzentrationen von Atrazin lagen bis auf bei der Versuchsreihe mit Myriophyllum aquaticum zwischen 79% (Riccia fluitans) und 91% (Vallisneria spiralis) der Nominalkonzentrationen. Bei dem Versuch mit Myriophyllum aquaticum entsprach die tatsächliche Konzentration nur 33% der Nominalkonzentration. Tabelle 31: Tatsächliche Atrazin-Konzentrationen im Medium der verschiedenen Testreihen in µg/l, berechnet nach der HPLC-Analyse der jeweiligen Stammlösungen. Nominal Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis C SC ,7 7,9 9,1 9 3,3 8,8 9, ,7 31,6 36, ,4 35,1 36, ,7 126,2 145, ,6 140,6 146, ,9 504,9 582,9 575,9 214,3 562,2 585,6 2,4-D (Analytik) Die tatsächlichen Konzentrationen von 2,4-D im Medium der verschiedenen Testreihen, die sich durch die Analyse der Stammlösungen ergeben, sind in der Tabelle 32 aufgelistet. Bis auf bei der Versuchsreihe mit Vallisneria spiralis lagen die tatsächlichen Konzentrationen von 2,4-D zwischen 96% (Lemna, Salvinia, Mentha) und 102% (Myriophyllum aquaticum) der Nominalkonzentrationen. Bei dem Versuch mit Vallisneria spiralis überstieg die tatsächliche Konzentration die Nominalkonzentration aufgrund eines methodischen Fehlers etwa um den Faktor 9. Tabelle 32: Tatsächliche 2,4-D-Konzentrationen im Medium der verschiedenen Testreihen in µg/l, berechnet nach der HPLC-Analyse der jeweiligen Stammlösungen. Nominal Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis C SC ,6 75,1 76,6 76,6 81,2 77,2 718, ,5 300,4 306,5 306,5 324,9 308,9 2874, ,9 1201,4 1225,9 1225,9 1299,5 1235, , ,7 4805,7 4903,7 4903,7 5197,8 4943, ,6 115

137 % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit Biotestentwicklung IV LEITFÄHIGKEIT DES MEDIUMS Atrazin Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der chemisch-physikalischen Parameter der Atrazin-Versuche sind dem Anhang zu entnehmen. Die Mittelwerte der prozentualen Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der unterschiedlichen Makrophytengruppen werden in den Abbildungen dargestellt. Bei Lemna gibba und Salvinia natans treten signifikante Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle jeweils bei der III. und IV. Belastungsstufe auf, sodass sich LOEC-Werte von 138,7 µg/l (Lemna) bzw. 145,7 µg/l (Salvinia) ergeben. Bei Riccia fluitans treten signifikante Unterschiede schon eine Konzentrationsstufe niedriger auf, sodass sich hier ein LOEC-Wert von 31,6 µg/l ergibt. Bei allen 3 Testorganismen kommt es über den Versuchszeitraum bei der III. und IV. Belastungsstufe zu einer Zunahme der Leitfähigkeit (negative Abnahme). Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans NOEC: 34,7 µg/l LOEC: 138,7 µg/l * *** *** NOEC: 7,9 µg/l LOEC: 31,6 µg/l *** *** NOEC: 36,4 µg/l LOEC: 145,7 µg/l *** *** -10 C SC 8,7 µg/l 34,7 µg/l 138,7 µg/l 554,9 µg/l -20 C SC 7,9 µg/l 31,6 µg/l 126,2 µg/l 504,9 µg/l -20 C SC 9,1 µg/l 36,4 µg/l 145,7 µg/l 582,9 µg/l Abbildung 47: Mittelwerte der %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Bei dem Test mit Mentha aquatica traten hier bei allen Belastungsstufen signifikante Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle auf, während sich bei Myriophyllum aquaticum erst signifikante Unterschiede ab der III. Belastungsstufe von 53,6 µg/l zeigten. Insgesamt wiesen alle Testansätze aus der Gruppe 2 über den Versuchszeitraum eine Erhöhung der Leitfähigkeit der Medien auf. Die Tests der Gruppe 3-Makrophyten zeigten beide signifikante Unterschiede in der Abnahme der Leitfähigkeit der Medien bei der III. und IV. Belastungsstufe bei 140,5 µg/l (Ceratophyllum) bzw. 146,4 µg/l (Vallisneria). 116

138 % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit Biotestentwicklung IV Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum 0-20 * * * ** 0-20 NOEC: 13,4 µg/l LOEC: 53,6 µg/l -40 NOEC: < 9,0 µg/l LOEC: 9,0 µg/l -40 * *** -60 C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l -60 C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l Abbildung 48: Mittelwerte der %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 2-Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis NOEC: 36,6 µg/l LOEC: 146,4 µg/l NOEC: 35,1 µg/l LOEC: 140,6 µg/l *** *** *** *** -10 C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l 140,6 µg/l 562,2 µg/l -10 C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l Abbildung 49: Mittelwerte der %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 3-Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Ergebnisse der Berechnungen der Effektkonzentrationen EC50 und EC10 nach der Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums sind in der Tabelle 33 dargestellt. Bei den Versuchen mit Lemna, Myriophyllum und Vallisneria ließen die Werte der Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums keine EC-Berechnung zu. Die niedrigsten EC50-Werte wurden nach diesem Parameter von Mentha (3,3 µg/l) und Salvinia (4,3 µg/l) erreicht, gefolgt von Riccia (13,8 µg/l) und Ceratophyllum (171,9 µg/l). Dabei ist das 95%- Konfidenzintervall von Riccia mit 13,7 µg/l bis 13,9 µg/l sehr eng, während die Konfidenzintervalle bei den anderen oben genannten EC50-Werten deutlich weiter ausfallen. Dieser Sachverhalt findet sich auch bei den EC10-Werten wieder. 117

139 % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit Biotestentwicklung IV Tabelle 33: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums. nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna nc - nc - Riccia 13,8 13,70-13,92 6,8 6,75-6,87 Salvinia 4,3 0,23-62,19 nc - Mentha 3,3 0,05-227,1 nc - Myriophyllum nc - 7,2 0,4-120,5 Ceratophyllum 171,9 66,3-445,4 7,8 0,8-81,08 Vallisneria nc - nc - 2,4-D (Leitfähigkeit des Mediums) Die Ergebnisse der Leitfähigkeitsmessungen jeweils zu Versuchsbeginn und zum Versuchsende einer 2,4-D-Testreihe sind im Anhang zusammengefasst. Aus technischen Gründen konnten für die Testreihe mit Myriophyllum aquaticum am Tag 14 keine chemisch-physikalischen Parameter gemessen werden. Entsprechend können für diese Testreihe bei diesen Parametern keine Änderungen berechnet und Effekte aufgedeckt werden. Die Mittelwerte der prozentualen Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums sind für die unterschiedlichen Makrophytengruppen in der Abbildung 50 und Abbildung 51 dargestellt. Nur bei der Testreihe mit Mentha aquatica kam es zu einer signifikant niedrigeren Abnahme der Leitfähigkeit im Medium in den Systemen, die 2,4-D enthielten, gegenüber der SC-Reihe. Hier konnte über den Dunnet s Multiple Comparison Test ein LOEC von 1225,9 µg/l festgestellt werden. Bei den Testreihen mit den anderen Makrophyten konnten keine signifikant niedrigeren Leitfähigkeitsabnahmen im Medium in den mit 2,4-D belasteten Systemen festgestellt werden. Bei Lemna gibba kam es sogar in den beiden höchsten Belastungsstufen zu signifikant höheren Abnahmen der Leitfähigkeit gegenüber der Lösungsmittelkontrolle und auch bei Salvinia natans war Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l *** NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l * NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l -10 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l -10 C SC 75,1 µg/l 300,4 µg/l 1201,4 µg/l 4805,7 µg/l 0 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Abbildung 50: Mittelwerte der %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

140 % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit % Abnahme der Leitfähigkeit Biotestentwicklung IV Mentha aquatica Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis NOEC: > 4943,1 µg/l LOEC: > 4943,1 µg/l 30 NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l ** * NOEC: 306,5 µg/l LOEC: 1225,9 µg/l 0 * 0-60 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l -10 C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l -10 C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Abbildung 51: Mittelwerte der %-Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums der Gruppe 2- und Gruppe 3- Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. hier die prozentuale Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums etwas höher. Nur bei Ceratophyllum demersum lagen die Werte der prozentualen Abnahme der Leitfähigkeit des Mediums in der höchsten Belastungsstufe von 4943,1 µg/l deutlich, aber nicht signifikant niedriger als bei der Lösungsmittelkontrolle. Eine EC-Berechnung über den Parameter Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums führte entsprechend auch nur bei Ceratophyllum zu einem Ergebnis (siehe Tabelle 34). Der EC50 von Ceratophyllum bezüglich 2,4-D liegt nach diesem Parameter bei 1209 µg/l bei einem relativ weiten 95%-Konfidenzintervall von 241, µg/l. Tabelle 34: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Abnahme Leitfähigkeit des Mediums. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna nc - nc - Riccia nc - nc - Salvinia nc - nc - Mentha nc - nc - Myriophyllum Ceratophyllum 1209,0 241, ,4 5, Vallisneria nc - nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx PH-WERT DES MEDIUMS Atrazin Die Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten sind in der Abbildung 52 dargestellt. Bei Lemna gibba ist die ph-wert-zunahme des Mediums über den Versuchszeitraum ab der III. Belastungsstufe signifikant geringer als die der Lösungsmittelkontrolle (LOEC: 138,7 µg/l). Bei den Tests mit Riccia fluitans und 119

141 Delta ph Delta ph Delta ph Delta ph Delta ph Biotestentwicklung IV Salvinia natans ist die ph-wert-zunahme des Mediums ab der II. Belastungsstufe signifikant geringer, sodass sich LOEC-Werte von 31,6 µg/l (Riccia) bzw. 36,4 µg/l (Salvinia) ergeben. Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans NOEC: 34,7 µg/l LOEC: 138,7 µg/l C SC 8,7 µg/l 34,7 µg/l *** 138,7 µg/l *** 554,9 µg/l NOEC: 7,9 µg/l LOEC: 31,6 µg/l C SC 7,9 µg/l *** 31,6 µg/l *** 126,2 µg/l *** 504,9 µg/l C NOEC: 9,1 µg/l LOEC: 36,4 µg/l SC 9,1 µg/l ** 36,4 µg/l *** 145,7 µg/l *** 582,9 µg/l Abbildung 52: Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 2-Makrophyten sind in der Abbildung 53 dargestellt. Die Zunahme des ph-wertes ist bei dem Test mit Mentha aquatica in allen belasteten Systemen signifikant geringer als bei der Lösungsmittelkontrolle, sodass sich der NOEC-Wert unter der geringsten Konzentration von 9 µg/l befindet. Bei Myriophyllum aquaticum hingegen weisen alle belasteten Systeme eine leicht höhere ph-wert-zunahme des Mediums auf, die bei 13,4 µg/l sogar signifikant ist. Die Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 3-Makrophyten sind in der Abbildung 54 wiedergegeben. Bei beiden Tests mit den submersen Pflanzen ergeben sich aufgrund geringerer ph-wert-zunahmen des Mediums während des Versuchszeitraumes LOEC-Werte der III. Belastungsstufe (Ceratophyllum: 140,6 µg/l bzw. Vallisneria: 146,4 µg/l). Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum 3 2 NOEC: < 9,0 µg/l LOEC: 9,0 µg/l 3 2 * 1 * ** * ** 1 NOEC: > 214,3 µg/l LOEC: > 214,3 µg/l 0-1 C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l 0-1 C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l Abbildung 53: Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 2-Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

142 Delta ph Delta ph Biotestentwicklung IV Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis NOEC: 35,1 µg/l LOEC: 140,6 µg/l C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l *** *** 140,6 µg/l 562,2 µg/l NOEC: 36,6 µg/l LOEC: 146,4 µg/l C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l *** *** 146,4 µg/l 585,6 µg/l Abbildung 54: Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 3-Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Ergebnisse der Berechnungen der Effektkonzentrationen EC50 und EC10 nach der Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums sind in der Tabelle 35 aufgelistet. Für die Testreihen mit Mentha, Myriophyllum und Vallisneria konnten für diesen Parameter keine EC- Werte berechnet werden. Der niedrigste EC50-Wert (bei gleichzeitig engstem 95%- Konfidenzintervall) wurde in dem Versuch für den Parameter Hemmung Zunahme des ph- Wertes des Mediums mit Ceratophyllum erreicht (125,3 µg/l). Die EC50-Werte von Salvinia (323,7 µg/l), Riccia (432,8 µg/l) und Lemna (607,3 µg/l) sind bis zu fast dem fünffachen höher. Bezüglich der EC10-Werte reagieren die Riccia- und Salvinia-Testsysteme sensitiver auf Atrazin mit EC10-Werten von 16,5 µg/l (Riccia) bzw. 18 µg/l (Salvinia) gegenüber 44,8 µg/l (Ceratophyllum). Tabelle 35: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna 607,3 87, ,4 1, Riccia 432,8 130, ,5 1,5-178,3 Salvinia 323,7 215,6-486,0 18,0 7,2-44,9 Mentha nc - nc - Myriophyllum nc - nc - Ceratophyllum 125,3 90,91-172,8 44,8 16,81-119,5 Vallisneria nc - nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 2,4-D (ph-wert des Mediums) Die Mittelwerte der ph-wert-zunahme im Medium der verschiedenen Makrophytengruppen sind für die 2,4-D-Versuche in Abbildung 55 und Abbildung 56 dargestellt. Nur bei Riccia fluitans und Ceratophyllum demersum ist die ph-wert- 121

143 Delta ph Delta ph Delta ph Delta ph Delta ph Delta ph Biotestentwicklung IV Erhöhung des Mediums über den Versuchszeitraum jeweils bei der höchsten Belastungsstufe signifikant niedriger als bei der Lösungsmittelkontrolle. Während bei Salvinia natans bezüglich der ph-wert-veränderungen im Medium nur minimale Unterschiede ohne einen Trend zwischen den unterschiedlichen Belastungsstufen und den Kontrollen C und SC auftraten, kam es bei Lemna, Mentha und Vallisneria zu einer erhöhten ph-wert-zunahme im Medium bei der jeweils höchsten Belastungsstufe. Insbesondere bei Lemna ist ein eindeutiger Trend erkennbar zu höheren ph-wert- Änderungen bei höheren Konzentrationen von 2,4-D. Eine EC-Berechnung über den Parameter Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums ist zwar im Fall von Riccia und Ceratophyllum möglich, liefert aber nur Werte mit weiten Konfidenzintervallen (siehe Tabelle 37). Für die anderen Testreihen ist über diesen Parameter keine EC-Berechnung möglich. Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans 3 3 NOEC: 1201,4 µg/l LOEC: 4805,7 µg/l 3 NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 2 * ** *** *** 2 *** 2 1 NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 0 C SC 75,1 µg/l 300,4 µg/l 1201,4 µg/l 4805,7 µg/l 0 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Abbildung 55: Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Mentha aquatica Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis 3 ** 3 NOEC: 1235,8 µg/l LOEC: 4943,1 µg/l 3 ** NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 1 * 1 NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l 0 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 0 C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l 0 C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Abbildung 56: Mittelwerte der ph-wert-zunahme des Mediums der Gruppe 2- und 3-Makrophyten (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

144 Biotestentwicklung IV Tabelle 36: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung Zunahme des ph-wertes des Mediums. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna nc - nc - Riccia 14242,0 635, , Salvinia nc - nc - Mentha nc - nc - Myriophyllum Ceratophyllum 9950, ,1 42, Vallisneria nc - nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx O 2 -GEHALT DES MEDIUMS Atrazin Die Mittelwerte der prozentualen Erhöhung des Sauerstoffgehaltes des Mediums der 3 untergetauchten Makrophyten Riccia fluitans, Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis sind in der Abbildung 57 dargestellt. Bei allen 3 Tests wiesen ab der III. Belastungsstufe die Medien signifikant geringere Sauerstoffzunahmen als die Lösungsmittelkontrolle auf (LOEC von Riccia: 126,2 µg/l; von Ceratophyllum: 140,6 µg/l; von Vallisneria: 146,4 µg/l). Während die Medien der Kontrollen über den Versuchszeitraum eine Sauerstofferhöhung im Bereich von 100% erfuhren, lagen diese bei der III. Belastungsstufe mit unter 50% deutlich niedriger. Die Belastungsstufe IV führte sogar im Fall von Ceratophyllum und Vallisneria zu einer Abnahme des Sauerstoffgehaltes im Medium über den Versuchszeitraum. Eine Berechnung der Effektkonzentrationen EC50 und EC10 über die Hemmung %- Erhöhung des O2-Gehaltes des Mediums war nur bei Riccia und Ceratophyllum möglich. Hier ergaben sich bei Riccia ein EC50 von 86,9 µg/l und ein EC10 von 12 µg/l. Riccia fluitans Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis %-Erhöhung O C SC 7,9 µg/l 31,6 µg/l NOEC: 31,6 µg/l LOEC: 126,2 µg/l *** 126,2 µg/l *** 504,9 µg/l %-Erhöhung O C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l NOEC: 35,1 µg/l LOEC: 140,6 µg/l *** 140,6 µg/l *** 562,2 µg/l %-Erhöhung O NOEC: 36,6 µg/l LOEC: 146,4 µg/l C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l *** 146,4 µg/l *** 585,6 µg/l Abbildung 57: Mittelwerte der %-Erhöhung des O 2 -Gehaltes des Mediums der Makrophyten Riccia fluitans (n=5), Ceratophyllum demersum (n=3) und Vallisneria spiralis (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

145 Biotestentwicklung IV Bei Ceratophyllum wurde ein EC50 von 134,3 µg/l und ein EC10 von 54 µg/l berechnet (siehe Tabelle 37). Tabelle 37: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Erhöhung des O2-Gehaltes des Mediums. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Riccia 86,9 41,5-181,9 12,0 2,2-63,5 Ceratophyllum 134, ,1 54,0 9,61-303,1 Vallisneria nc - nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 2,4-D (O 2 -Gehalt des Mediums) Die prozentuale Erhöhung des Sauerstoffgehaltes im Medium war bei Riccia ab der III. Belastungsstufe signifikant niedriger als bei der Lösungsmittelkontrolle. Bei der höchsten Belastungsstufe von 4805,7 µg/l kam es sogar zu einer Verringerung des Sauerstoffgehaltes im Medium bei Riccia über den Versuchszeitraum (siehe Abbildung 58). Bei der Testreihe mit Ceratophyllum kam es bis auf C bei allen Belastungsstufen und der Lösungsmittelkontrolle zu einer Verminderung des Sauerstoffgehaltes im Medium über den Versuchszeitraum, die mit zunehmender Konzentration an 2,4-D ausgeprägter ausfiel. So führen die signifikanten Unterschiede in der Sauerstoffgehalterhöhung des Mediums bei Riccia zu einem LOEC von 1201,4 µg/l und bei Ceratophyllum zu einem LOEC von 4943,1 µg/l. Bei Vallisneria ist keine Korrelation von 2,4-D-Konzentration und Änderung der Sauerstoffgehaltes im Medium über den Versuchszeitraum zu erkennen. Auch hier liegt der Mittelwert von C wieder deutlich höher als bei SC. Riccia fluitans Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis %-Erhöhung O C SC 75,1 µg/l 300,4 µg/l NOEC: 300,4 µg/l LOEC: 1201,4 µg/l * 1201,4 µg/l *** 4805,7 µg/l %-Erhöhung O C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l NOEC: 1235,8 µg/l LOEC: 4943,1 µg/l 1235,8 µg/l ** 4943,1 µg/l %-Erhöhung O C * SC 718,7 µg/l NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Abbildung 58: Mittelwerte der %-Erhöhung des O 2 -Gehaltes des Mediums der Makrophyten Riccia fluitans (n=5), Ceratophyllum demersum (n=3) und Vallisneria spiralis (n=3) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

146 Wachstumsrate Anzahl Fronds Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Frischgewicht Biotestentwicklung IV Die Tabelle 38 listet die 2,4-D EC-Werte für den Parameter Hemmung %-Erhöhung des O2- Gehaltes des Mediums auf. Der EC50-Wert von Riccia liegt mit 826,7 µg/l etwas unter dem von Ceratophyllum mit 1177 µg/l, während für Vallisneria kein EC50 berechnet werden konnte. Die EC10 Werte liegen bei 113,5 µg/l (Riccia) und 460,5 µg/l (Ceratophyllum). Tabelle 38: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung %-Erhöhung des O2-Gehaltes des Mediums. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Riccia 826,7 394, ,5 21,40-602,5 Ceratophyllum 1177,0 937, ,5 204, Vallisneria nc - nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx WACHSTUMSPARAMETER Atrazin Die Ergebnisse der Wachstumsparameter sind detailliert im Anhang zu finden. Die Abbildung 59 stellt die Mittelwerte mit ihren Standardabweichungen der Wachstumsraten der Gruppe 1-Makrophyten dar. Bei Lemna gibba ist die Wachstumsrate bezüglich Anzahl Fronds ab der III. Belastungsstufe signifikant geringer als bei der Lösungsmittelkontrolle, sodass sich hier ein LOEC-Wert von 138,7 µg/l ergibt. Auch bei Riccia fluitans und Salvinia natans ist die Zunahme des Frischgewichts ab der III. Belastungsstufe signifikant geringer. Die IV. Belastungsstufe führt bei diesen beiden Testorganismen sogar zu einer Verringerung des Frischgewichts durch Absterben von Pflanzengewebe NOEC: 34,7 µg/l LOEC: 138,7 µg/l Lemna gibba 0.15 NOEC: 31,6 µg/l LOEC: 126,2 µg/l Riccia fluitans 0.10 NOEC: 36,4 µg/l LOEC: 145,7 µg/l Salvinia natans 0.10 ** *** ** *** *** *** C SC 8,7 µg/l 34,7 µg/l 138,7 µg/l 554,9 µg/l C SC 7,9 µg/l 31,6 µg/l 126,2 µg/l 504,9 µg/l C SC 9,1 µg/l 36,4 µg/l 145,7 µg/l 582,9 µg/l Abbildung 59: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Anzahl Fronds (Lemna) bzw. Frischgewicht (Riccia & Salvinia) [d -1 ] der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

147 Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Biotestentwicklung IV Die Wachstumsraten der Parameter Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge der Gruppe 2-Makrophyten werden in der Abbildung 60 dargestellt. Bei Mentha aquatica reagiert der Endpunkt Frischgewicht mit einem LOEC-Wert von 144 µg/l von den Wachstumsparametern am sensitivsten. Bei Myriophyllum aquaticum dagegen stellt sich der Endpunkt Sprosslänge als am sensitivsten heraus. Hier zeigt sich schon bei der II. Belastungsstufe von 13,4 µg/l ein signifikant geringeres Wachstum als bei der Lösungsmittelkontrolle. Allerdings zeigte bei diesem Test auch die Kontrollreihe C ein signifikant niedrigeres Wachstum als die SC-Reihe. Sowohl bei Mentha aquatica als auch bei Myriophyllum aquaticum konnten keine negativen Effekte in den getesteten Konzentrationen auf das Wurzelwachstum festgestellt werden Mentha aquatica NOEC: 36,0 µg/l LOEC: 144,0 µg/l 0.15 Mentha aquatica NOEC: 144,0 µg/l LOEC: 575,9 µg/l 1.0 Mentha aquatica NOEC: > 575,9 µg/l LOEC: > 575,9 µg/l * *** ** * C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l 0.00 C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l 0.0 C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l Myriophyllum aquaticum Myriophyllum aquaticum Myriophyllum aquaticum NOEC: 13,4 µg/l LOEC: 53,6 µg/l * NOEC: 3,3 µg/l LOEC: 13,4 µg/l * *** *** * 1.0 NOEC: > 214,3 µg/l LOEC: > 214,3 µg/l C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l 0.00 C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l 0.0 C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l Abbildung 60: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge [d -1 ] und Wurzellänge [cm*d -1 ] der Gruppe 2-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Wachstumsraten der Parameter Frischgewicht, Sprosslänge und bei Vallisneria auch Wurzellänge der Gruppe 3-Makrophyten werden in der Abbildung 62 dargestellt. Bei Ceratophyllum konnten in den getesteten Konzentrationen keine negativen Effekte durch die Wachstumsparameter Frischgewicht und Sprosslänge aufgedeckt werden. Im Gegenteil: Betrachtet man die Wachstumsrate der Sprosslänge, ist das stärkste Wachstum bei der höchsten Belastungsstufe von 562,2 µg/l zu finden. In dieser Belastungsstufe wies Ceratophyllum eine deutliche Internodienstreckung gegenüber den Kontrollen auf (siehe Abbildung 61A und B). Außerdem bildeten einige Ceratophyllum- 126

148 Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Biotestentwicklung IV Pflanzen in dieser Konzentrationsstufe deutlich mehr Seitentriebe (siehe Abbildung 61C) und das Gewebe war brüchiger. Bei Vallisneria spiralis konnten keine negativen Effekte über den Wachstums-Parameter Sprosslänge festgestellt werden. Bezüglich des Frischgewichts konnte ein signifikant vermindertes Wachstum ab der II. Belastungsstufe festgestellt werden, wobei allerdings auch die Kontrollreihe C ein signifikant geringeres Wachstum als die SC-Reihe aufwies. Als der sensitivste Wachstumsparameter bei Vallisneria erwies sich die Wurzellänge, die schon bei der geringsten Konzentrationsstufe von 9,2 µg/l ein signifikant geringeres Wachstum als bei der Lösungsmittelkontrolle aufwies. A B C Abbildung 61: Ceratophyllum am Ende des Tests (Tag 14). A: Lösungsmittelkontrolle. B: Internodienstreckung bei 562,2 µg/l Atrazin. C: vermehrte Seitensprossbildung bei 562,2 µg/l Atrazin Ceratophyllum demersum NOEC: > 562,2 µg/l LOEC: > 562,2 µg/l 0.15 Ceratophyllum demersum * NOEC: > 562,2 µg/l LOEC: > 562,2 µg/l C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l 140,6 µg/l 562,2 µg/l 0.00 C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l 140,6 µg/l 562,2 µg/l 0.10 Vallisneria spiralis NOEC: 9,2 µg/l LOEC: 36,6 µg/l Vallisneria spiralis 0.15 NOEC: > 585,6 µg/l LOEC: > 585,6 µg/l Vallisneria spiralis 1.0 NOEC: < 9,2 µg/l LOEC: 9,2 µg/l ** * *** *** ** * *** C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l 0.00 C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l 0.0 C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l Abbildung 62: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge [d -1 ] und Wurzellänge [cm*d -1 ] (nur Vallisneria) der Gruppe 3-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

149 Biotestentwicklung IV Die Ergebnisse der Wachstumsparameter ließen bei den meisten Versuchsreihen nur über den Parameter Hemmung Frischgewicht und bei Lemna Hemmung Fronds die Berechnung von Effektkonzentrationen zu (die in der Tabelle 39 aufgelistet sind). Nur bei Myriophyllum aquaticum konnte auch über den Parameter Hemmung Wurzellänge der EC10 errechnet werden (3,2 µg/l), allerdings mit einem weiten 95%-Konfidenzintervall (0,03µg/L bis 324,9 µg/l). Die Verteilung der Werte für die Pflanzen bzw. Parameter, für die keine EC-Werte berechnet werden können, entsprechen nicht dem sigmodialen Verlauf einer klassischen Dosis-Wirkungs-Beziehung. Der EC50-Wert von Lemna bezüglich Hemmung Fronds liegt bei 221,8 µg/l und damit unter dem EC50-Wert von Mentha bezüglich Hemmung Frischgewicht von 642,7 µg/l. Riccia und Vallisneria weisen dagegen bei diesem Parameter einen etwa vierfach geringeren EC50 als Lemna auf (62,7 µg/l bzw. 50 µg/l) und Salvinia mit 16,6 µg/l sogar einen 13fach geringeren. Tabelle 39: Atrazin EC50- und EC10-Werte: Hemmung Wachstum. FG: Frischgewicht; WL: Wurzellänge. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna (Fronds) 221,8 131,3-374,7 85,8 37,5-196,3 Riccia (FG) 62,7 32,45-121,3 12,2 2,96-50,50 Salvinia (FG) 16,6 1,71-161,7 1,4 0, Mentha (FG) 642,7 333, ,1 15,1-172,8 Myriophyllum (WL) nc - 3,2 0,03-324,9 Ceratophyllum nc - nc - Vallisneria (FG) 50,0 21,15-118,4 8,1 1,17-56,23 nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 2,4-D (Wachstumsparameter) Die Ergebnisse der Wachstumsparameter Anzahl Fronds und Frischgewicht der Gruppe 1-Makrophyten für die 2,4-D-Versuche werden in der Abbildung 63 dargestellt. Bei Lemna zeigt sich eine Dosis-Wirkungs-Beziehung mit signifikant niedrigerem Wachstum ab der III. Belastungsstufe ( LOEC: 1225,9 µg/l). Bei Riccia zeigt sich keine Korrelation zwischen 2,4-D Konzentration und Wachstum. Auch bei Salvinia ist kein Trend zu erkennen. Hier weisen die Pflanzen der I. Belastungsstufe ein signifikant niedrigeres Wachstum gegenüber den Pflanzen der Lösungsmittelkontrolle auf ( LOEC: 76,6 µg/l), während die Pflanzen höherer Konzentrationsstufen ein ähnlich hohes Wachstum wie SC aufweisen. 128

150 Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Wachstumsrate Anzahl Fronds Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Frischgewicht Biotestentwicklung IV Lemna gibba Riccia fluitans Salvinia natans 0.15 NOEC: 306,5 µg/l LOEC: 1225,9 µg/l 0.15 NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l 0.15 NOEC: < 76,6 µg/l LOEC: 76,6 µg/l 0.10 * ** * 0.05 * 0.00 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 0.00 C SC 75,1 µg/l 300,4 µg/l 1201,4 µg/l 4805,7 µg/l 0.00 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Abbildung 63: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Anzahl Fronds (Lemna), Frischgewicht (Riccia & Salvinia) [d -1 ] der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Ergebnisse der verschiedenen Wachstumsparameter der Gruppe 2-Makrophyten werden in der Abbildung 64 dargestellt. Bei Mentha aquatica lassen sich bei allen drei Parametern Frischgewicht, Sprosslänge und Wurzellänge eine deutliche Dosis- Wirkungs-Beziehung erkennen. Während bei den Parametern Frischgewicht und Sprosslänge ein signifikant schwächeres Wachstum ab der II. Belastungsstufe zu verzeichnen ist ( LOEC: 306,5 µg/l), reagiert bei 2,4-D der Parameter Wurzellänge mit einem LOEC von 1225,9 µg/l etwas weniger sensitiv. Bei Myriophyllum aquaticum ist Mentha aquatica Mentha aquatica Mentha aquatica NOEC: 76,6 µg/l LOEC: 306,5 µg/l *** *** *** NOEC: 76,6 µg/l LOEC: 306,5 µg/l *** *** *** NOEC: 306,5 µg/l LOEC: 1225,9 µg/l * *** 0.00 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 0.00 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 0.0 C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Myriophyllum aquaticum Myriophyllum aquaticum Myriophyllum aquaticum NOEC: 81,2 µg/l LOEC: 342,9 µg/l * *** *** NOEC: 324,9 µg/l LOEC: 1299,5 µg/l *** *** NOEC: 1299,5 µg/l LOEC: 5197,8 µg/l *** 0.00 C SC 81,2 µg/l 324,9 µg/l 1299,5 µg/l 5197,8 µg/l 0.00 C SC 81,2 µg/l 324,9 µg/l 1299,5 µg/l 5197,8 µg/l 0.0 C SC 81,2 µg/l 324,9 µg/l 1299,5 µg/l 5197,8 µg/l Abbildung 64: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge [d -1 ] und Wurzellänge [cm*d -1 ] der Gruppe 2-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

151 Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Wachstumsrate Wurzellänge Wachstumsrate Frischgewicht Wachstumsrate Sprosslänge Biotestentwicklung IV zumindest bei den Parametern Frischgewicht und Sprosslänge eine Dosis-Wirkungs- Beziehung zu erkennen, wenn auch weniger deutlich als bei Mentha aquatica. Hier ergeben sich LOEC-Werte von 342,9 µg/l (Frischgewicht) und 1299,5 µg/l (Sprosslänge). Bezüglich Wurzellänge zeigen sich keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Kontrollreihen C und SC und den belasteten Systemen bis zur III. Belastungsstufe. Die Wachstumsrate der Wurzellänge der IV. Belastungsstufe des Myriophyllum- Versuches ist allerdings deutlich geringer ( LOEC: 5197,8 µg/l). Bei der Betrachtung der Wachstumsraten von Ceratophyllum demersum in Abbildung 65 ist bis zur II. Belastungsstufe ein leichtes Ansteigen der Wachstumsraten zu verzeichnen. Während mit großer Varianz die Wachstumsraten der III. Belastungsstufe schon deutlich (aber nicht signifikant) sinken, liegt die mittlere Wachstumsrate beider Parameter Frischgewicht und Sprosslänge im negativen Bereich, was einen Zerfall der Pflanzen kennzeichnet. Morphologische Effekte von 2,4-D auf Ceratophyllum waren aber schon ab der I. Belastungsstufe zu beobachten, die sich u.a. in Internodienstreckungen ausdrückten. Ab der II. Belastungsstufe kam es zu einer erheblichen Steigerung der Brüchigkeit der Pflanzen, die ab der III. Belastungsstufe von dem Auftreten von Deformationen begleitet wurde. In der IV. Belastungsstufe führte der Einfluss von 2,4-D zu völligen Zerfall der Pflanzen. Diese Phänomene wie Brüchigkeit, Deformationen und Zerfall werden nicht oder nur ungenügend durch die Wachstumsparameter wiedergegeben und sollen daher durch die Fotoserie der Abbildung 66 festgehalten werden. Ceratophyllum demersum Ceratophyllum demersum *** *** NOEC: 1235,8 µg/l LOEC: 4943,1 µg/l NOEC1235,8 µg/l LOEC: 4943,1 µg/l C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l Vallisneria spiralis Vallisneria spiralis Vallisneria spiralis 0.15 NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l 0.15 NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l NOEC: 718,7 µg/l LOEC: 2874,8 µg/l *** * *** ** 0.00 C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l 0.00 C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l 0.0 C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Abbildung 65: Mittelwerte und Standardabweichung der Wachstumsraten Frischgewicht, Sprosslänge [d -1 ] und Wurzellänge [cm*d -1 ] (nur Vallisneria) der Gruppe 3-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (2,4- D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

152 Biotestentwicklung IV C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l Abbildung 66: Ceratophyllum demersum am Ende des 2,4-D-Versuches (Konzentrationsangaben beziehen sich auf 2,4-D). Bei Vallisneria konnten keine negativen Effekte auf die Wachstumsparameter Frischgewicht und Sprosslänge durch 2,4-D festgestellt werden. Beim Parameter Wurzellänge zeigte sich dagegen eine deutliche Dosis-Wirkungs-Beziehung mit einem signifikant niedrigeren Wachstum ab der II. Belastungsstufe ( LOEC: 2874,8 µg/l). Die Ergebnisse der EC-Berechnungen über die verschiedenen Hemmung Wachstum -Werte sind in Tabelle 40 zusammengefasst. Der niedrigste EC50-Wert bei den verschiedenen Testreihen mit unterschiedlichen Makrophyten findet sich bei Mentha aquatica mit 668,2 µg/l und wird über den Parameter Sprosslänge errechnet. Die zweit sensitivste Wasserpflanze der hier getesteten Arten ist Myriophyllum aquaticum mit einem EC50- Wert von 1949 µg/l, der auf dem Parameter Frischgewicht basiert. Bei Vallisneria spiralis kann nur über den Parameter Wurzellänge ein EC50 berechnet werden, der bei 3971 µg/l liegt. Lemna ist mit einem EC50 von µg/l bezüglich 2,4-D der unsensitivste Testorganismus, für den eine EC-Berechnung möglich war. Die EC10- Werte unterscheiden sich zwischen den unterschiedlichen Testorganismen weniger stark voneinander und liegen zwischen 64,75 µg/l bei Mentha (WL) und 365,1 µg/l bei Lemna. Für Riccia, Salvinia und Ceratophyllum konnten keine EC-Werte berechnet werden. 131

153 Biotestentwicklung IV Tabelle 40: 2,4-D EC50- und EC10-Werte: Hemmung Wachstum. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. Testorganismus EC50 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] EC10 [µg/l] 95% Konfidenzintervall [µg/l] Lemna (Fronds) , ,1 20, Riccia (FG) nc - nc - Salvinia (FG) nc - nc - Mentha (FG) , ,2 0, Mentha (SL) 668,2 204, ,9 7, Mentha (WL) , ,8 3, Myriophyllum (FG) , ,1 77, Myriophyllum (SL) ,2 135, Ceratophyllum nc - nc - Vallisneria (WL) , nc - nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx QUANTENAUSBEUTE DES PSII Atrazin Die Ergebnisse der Quantenausbeute-Messungen per Mini-PAM über den Versuchszeitraum sind für die Gruppe 1-Makrophyten in der Abbildung 67 graphisch dargestellt. Schon 2 Stunden nach Applikation weisen ab der II. Belastungsstufe aufwärts alle drei frei schwimmenden Makrophyten einen signifikant niedrigeren Quantenausbeute-Wert auf als bei der Lösungsmittelkontrolle. Bei Lemna gibba und Salvinia natans treten die deutlichsten Effekte am 2. Tag nach Applikation auf, aber auch an Tag 7 und Tag 14 ist keine merkliche Wiedererholung bezüglich der Photosyntheseleistung zu verzeichnen. Am Tag 2 weisen diese beiden Pflanzen in der niedrigsten Belastungsstufe 8,7 µg/l (Lemna) bzw. 9,1 µg/l (Salvinia) schon einen signifikant geringeren Quantenausbeute- Wert auf, als die der Lösungsmittelkontrolle-Reihe. Bei Riccia fluitans sind 2 Stunden nach Applikation und am Tag 2 deutliche Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu erkennen. Am Tag 7 weisen auch die Kontrollreihen (C und SC) bei dem Versuch mit Riccia relativ niedrige Quantenausbeute -Werte auf, sodass sich signifikante Unterschiede erst ab der III. Belastungsstufe zeigen. Am Tag 14 hat bezüglich der Quantenausbeute bei Riccia eine Wiedererholung in allen Belastungsstufen stattgefunden. Die Quantenausbeute- Werte der belasteten Pflanzen sind sogar alle leicht höher als die der Kontrollen (C und SC). Die Ergebnisse der Quantenausbeute-Messungen über den Versuchszeitraum für die Gruppe 2-Makrophyten sind in der Abbildung 68 dargestellt. Bei Mentha aquatica zeigen sich 2 Stunden nach Applikation noch keine Effekte auf die photochemische Energieübertragung des Photosystems II. Am 2. Tag nach Applikation kommt es bei Mentha aquatica zu signifikanten Unterschieden ab der III. Belastungsstufe (144 µg/l), die am Tag 7 noch etwas deutlicher ausgeprägt sind. Am Tag 14 bleibt die Quantenausbeute 132

154 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV von Mentha in der höchsten Belastungsstufe (575,9 µg/l) mit einem durchschnittlichen Wert von 0,268 auf niedrigem Niveau gegenüber durchschnittlich 0,689 bei der Lösungsmittelkontrolle. Dagegen steigt die Quantenausbeute in der III. Belastungsstufe (144 µg/l) am Tag 14 mit einem durchschnittlichen Wert von 0,625 wieder fast auf das Niveau der Kontrollen. Bei Myriophyllum aquaticum gibt es nur am Tag 2 in der höchsten Belastungsstufe (214,3 µg/l) eine leichte, aber signifikante Herabsetzung der Quantenausbeute, während sich zu allen anderen Messzeitpunkten und in den anderen Belastungsstufen die Quantenausbeute kaum von dem der Kontrollen unterscheidet. Lemna gibba *** *** *** * *** *** *** * *** *** *** ** *** *** *** C SC 8,7 µg/l 34,7 µg/l 138,7 µg/l 554,9 µg/l Stunden NOEC: 8,7 µg/l LOEC: 34,7 µg/l 2 Tage NOEC: < 8,7 µg/l LOEC: 8,7 µg/l 7 Tage NOEC: < 8,7 µg/l LOEC: 8,7 µg/l 14 Tage NOEC: < 8,7 µg/l LOEC: 8,7 µg/l Riccia fluitans *** *** *** *** *** *** *** *** C SC 7,9 µg/l 31,6 µg/l 126,2 µg/l 504,9 µg/l Stunden NOEC: 7,9 µg/l LOEC: 31,6 µg/l 2 Tage NOEC: 7,9µg/L LOEC: 31,6 µg/l 7 Tage NOEC: 31,6 µg/l LOEC: 126,2 µg/l 14 Tage NOEC: > 504,9 µg/l LOEC: > 504,9 µg/l Salvinia natans *** *** *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** C SC 9,1 µg/l 36,4 µg/l 145,7 µg/l 582,9 µg/l Stunden NOEC: 9,1 µg/l LOEC: 36,4 µg/l 2 Tage NOEC: < 9,1 µg/l LOEC: 9,1 µg/l 7 Tage NOEC: 9,1 µg/l LOEC: 36,4 µg/l 14 Tage NOEC: 9,1 µg/l LOEC: 36,4 µg/l Abbildung 67: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 1-Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

155 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV Mentha aquatica *** *** *** *** *** C SC 9,0 µg/l 36,0 µg/l 144,0 µg/l 575,9 µg/l Stunden NOEC: > 575,9 µg/l LOEC: > 575,9 µg/l 2 Tage NOEC: 36,0 µg/l LOEC: 144,0 µg/l 7 Tage NOEC: 36,0 µg/l LOEC: 144,0 µg/l 14 Tage NOEC: 144 µg/l LOEC: 575,9 µg/l Myriophyllum aquaticum *** C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l 2 Stunden NOEC: > 214,3 µg/l LOEC: > 214,3 µg/l 2 Tage NOEC: 53,6 µg/l LOEC: 214,3 µg/l 7 Tage NOEC: > 214,3 µg/l LOEC: > 214,3 µg/l 14 Tage NOEC: > 214,3 µg/l LOEC: > 214,3 µg/l Abbildung 68: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Ergebnisse der Quantenausbeute-Messungen über den Versuchszeitraum für die Gruppe 3-Makrophyten sind in der Abbildung 69 dargestellt. Beide submerse Makrophyten weisen schon 2 Stunden nach der Applikation von Atrazin in allen Belastungsstufen signifikant niedrigere Quantenausbeute-Werte auf als in der Lösungsmittelkontrolle. Bei beiden Pflanzen ist der Effekt am Tag 2 am ausgeprägtesten. Während bei Ceratophyllum über den Versuchszeitraum ab Tag 2 eine kaum merkliche Erholung der Quantenausbeute der belasteten Pflanzen zu verzeichnen ist, erhöhten sich am Tag 14 die Quantenausbeute-Werte von Vallisneria in den belasteten Systemen wieder deutlich, blieben aber signifikant unter denen der Lösungsmittelkontrolle. Der LOEC liegt bei Vallisneria zu allen Messzeitpunkten bei 9,2 µg/l, bei Ceratophyllum von 2 Stunden bis 7 Tage nach Applikation bei 8,8 µg/l und bei Tag 14 bei 35,1 µg/l. 134

156 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV Ceratophyllum demersum * * *** *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l 140,6 µg/l 562,2 µg/l Stunden NOEC: < 8,8 µg/l LOEC: 8,8 µg/l 2 Tage NOEC: < 8,8 µg/l LOEC: 8,8 µg/l 7 Tage NOEC: < 8,8 µg/l LOEC: 8,8 µg/l 14 Tage NOEC: < 8,8 µg/l LOEC: 8,8 µg/l Vallisneria spiralis ** ** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l Stunden NOEC: < 9,2 µg/l LOEC: 9,2 µg/l 2 Tage NOEC: < 9,2 µg/l LOEC: 9,2 µg/l 7 Tage NOEC: < 9,2 µg/l LOEC: 9,2 µg/l 14 Tage NOEC: < 9,2 µg/l LOEC: 9,2 µg/l Abbildung 69: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (Atrazin). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Tabelle 41 gibt die Effektkonzentrationen mit ihren 95%-Konfidenzintervallen der Gruppe 1-Makrophyten zu den unterschiedlichen Messzeitpunkten wieder, die sich aufgrund der Hemmung (Formel 6) der photochemischen Energieübertragung des Photosystems II errechnet. In den folgenden Tabellen 42 und 43 werden entsprechende Ergebnisse für die Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten dargestellt. In Tabelle 41 bis Tabelle 43 werden jeweils die niedrigsten Werte einer Effektkonzentration eines Testorganismus im Versuchszeitraum rot markiert. Es zeigt sich, dass die niedrigsten EC- Werte am häufigsten am Tag 2 erreicht werden. Salvinia ist mit einem EC50-Wert von 65,5 µg/l (Tag 2) bezüglich des Parameters Hemmung Quantenausbeute am sensitivsten in der Gruppe 1, gefolgt von Lemna mit 84,5 µg/l (Tag 2) und Riccia mit 228,5 µg/l (Tag 2). Werden die EC10-Werte betrachtet, ergibt sich ein gegenteiliges Bild: Hier weist Riccia mit 7,4 µg/l (2 Stunden) den niedrigsten EC10-Wert auf, gefolgt von Lemna mit 8,2 µg/l (Tag 14) und Salvinia mit 9,7 µg/l (Tag 2). 135

157 Lemna Riccia Salvinia Mentha Myriophyllum Biotestentwicklung IV Tabelle 41: Atrazin EC50- und EC10 Werte mit ihren 95%-Konfidenzintervallen in Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 1-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten. µg/l bezüglich 2 h 2 d 7 d 14 d EC50 194,3 84,5 207,3 96,7 95% Konfidenzintervall 126,3-299,0 55,6-128,4 155,7-275,9 61,7-151,6 EC10 22,2 11,6 11,1 8,2 95% Konfidenzintervall 8,2-59,9 4,5-29,8 5,7-22,1 2,8-23,7 EC50 282,7 228,5 355,1 nc 95% Konfidenzintervall EC10 7,4 7,9 53,2 nc 95% Konfidenzintervall 0,4-153,4 1,5-41,2 1, EC50 125,0 65,5 108,7 112,5 95% Konfidenzintervall 89,8-173,9 54,4-79,0 97,5-121,3 61,2-206,5 EC10 26,5 9,7 12,7 17,5 95% Konfidenzintervall 12,5-56,6 6,4-14,8 9,9-16,3 4,5-69,0 nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. In der Gruppe 2 ist Mentha bezüglich des Parameters Hemmung Quantenausbeute mit einem EC50 von 335,1 µg/l (Tag 7) deutlich sensitiver als Myriophyllum mit einem EC50- Wert von 917,4 µg/l (Tag 2). Auch der EC10 von Mentha liegt mit 44,5 µg/l (Tag 7) deutlich niedriger als der EC10 von Myriophyllum mit 199,6 µg/l (Tag 2). In der Gruppe 3 ist Vallisneria mit einem EC50 von 35,1 µg/l (Tag 2) bezüglich Hemmung Quantenausbeute am sensitivsten von allen 7 getesteten Makrophyten. Der niedrigste EC50-Wert von Ceratophyllum liegt mit 374,5 µg/l (Tag 2) mehr als 10-mal höher. Beide Gruppe 3-Pflanzen weisen bezüglich Hemmung Quantenausbeute am Tag 14 einen EC10 von 2,0 µg/l auf, der ebenfalls der niedrigste EC10-Wert bei diesem Parameter bei allen getesteten Wasserpflanzen ist. Tabelle 42: Atrazin EC50- und EC10-Werte mit ihren 95%-Konfidenzintervallen in µg/l bezüglich Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten. 2 h 2 d 7 d 14 d EC50 nc 417,9 335,1 457,5 95% Konfidenzintervall - 279,0-625,9 239,7-468,3 395,3-529,5 EC10 nc 55,9 44,5 151,3 95% Konfidenzintervall - 22,4-139,8 20,7-95,5 99,8-229,2 EC50 nc 917,4 nc nc 95% Konfidenzintervall - 18, EC10 nc 199,6 561,0 nc 95% Konfidenzintervall - 108,7-366,6 4, nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 136

158 Ceratophyllum Vallisneria Biotestentwicklung IV Tabelle 43: Atrazin EC50- und EC10-Werte mit ihren 95%-Konfidenzintervallen in µg/l bezüglich Hemmung Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten. 2 h 2 d 7 d 14 d EC50 509,6 374,5 4373,0 1306,0 95% Konfidenzintervall 12, , , , EC10 nc 4,5 nc 2,0 95% Konfidenzintervall - 0,1-163,4-0,01-480,3 EC50 77,1 35,1 47,8 nc 95% Konfidenzintervall 44,6-133,4 20,7-59,4 22,2-102,8 - EC10 8,8 3,0 2,9 2,0 95% Konfidenzintervall 2,5-30,9 0,8-11,4 0,4-21,5 0,4-9,0 nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 2,4-D (Quantenausbeute des PS II) Über Messungen der photochemischen Energieübertragung des Photosystems II konnte bei den Gruppe 1-Makrophyten Lemna, Riccia und Salvinia zu keinem Zeitpunkt während der Versuche eine negative Abweichung belasteter Systeme zu den Kontrollreihen festgestellt werden (Abbildung 70). Bei Riccia fluitans zeigte sich am Tag 14 eine umgekehrte Dosis-Wirkungs-Beziehung mit zunehmender Quantenausbeute bei zunehmender Konzentration an 2,4-D im Medium. Bei den beiden Gruppe 2-Makrophyten Mentha und Myriophyllum konnte am Tag 14 ein Abfallen der Quantenausbeute in den belasteten Systemen festgestellt werden (Abbildung 71). Bei Mentha ist am Tag 14 eine deutliche Dosis-Wirkungs-Beziehung zu erkennen und signifikant niedrigere Quantenausbeute-Werte gegenüber der Lösungsmittelkontrolle treten schon ab der II. Belastungsstufe auf ( LOEC: 306,5 µg/l). Bei Myriophyllum sind auch am Tag 14 keine auffälligen Unterschiede der Belastungsstufen I - III zu den Kontrollreihen zu verzeichnen. Lediglich die mittlere Quantenausbeute der Pflanzen der höchsten Belastungsstufe fällt signifikant ab ( LOEC: 5197,8 µg/l). 137

159 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV Lemna gibba C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Stunden NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 2 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 7 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 14 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l Riccia fluitans ** *** * C SC 75,1 µg/l 300,4 µg/l 1201,4 µg/l 4805,7 µg/l Stunden NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l 2 Tage NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l 7 Tage NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l 14 Tage NOEC: > 4805,7 µg/l LOEC: > 4805,7 µg/l Salvinia natans C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l Stunden NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 2 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 7 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 14 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l Abbildung 70: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 1- Makrophyten (n=5) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,

160 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV Mentha aquatica ** *** *** C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l 2 Stunden NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 2 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 7 Tage NOEC: > 4903,7 µg/l LOEC: > 4903,7 µg/l 14 Tage NOEC: 76,6 µg/l LOEC: 306,5 µg/l Myriophyllum aquaticum *** C SC 81,2 µg/l 324,9 µg/l 1299,5 µg/l 5197,8 µg/l 2 Stunden NOEC: > 5197,8 µg/l LOEC: > 5197,8 µg/l 2 Tage NOEC: > 5197,8 µg/l LOEC: > 5197,8 µg/l 7 Tage NOEC: > 5197,8 µg/l LOEC: > 5197,8 µg/l 14 Tage NOEC: 1299,5 µg/l LOEC: 5197,8 µg/l Abbildung 71: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 2-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Die Quantenausbeute-Ergebnisse der Gruppe 3-Makrophyten sind in Abbildung 72 dargestellt. Bei der Versuchsreihe mit Vallisneria spiralis konnten am Tag 7 aus technischen Gründen keine Messungen durchgeführt werden. Ähnlich wie bei Riccia fluitans führte bei Ceratophyllum demersum eine erhöhte 2,4-D Konzentration tendenziell zu einer leichten Erhöhung der Quantenausbeute-Werte. Am Tag 2 und am Tag 7 sind die Quantenausbeute-Werte der Pflanzen aus der Belastungsstufe IV signifikant höher als die der Lösungsmittelkontrolle. Vallisneria spiralis verzeichnet am Tag 2 eine leichte Absenkung der Quantenausbeute in den Belastungsstufen II und IV, die signifikant ist und so zu einem LOEC von 2874,8 µg/l führt. Eine EC-Berechnung war bis auf bei Mentha aquatica bei allen anderen Makrophyten nicht möglich. Der niedrigste EC50 von Mentha aquatica wurde am Tag 14 erreicht und liegt bei µg/l bei einem 95%-Konfidenzintervall von µg/l. Der EC10 von Mentha aquatica liegt an diesem Tag bei 1129 µg/l (95%-Konfidenzintervall: 502, µg/l). 139

161 Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Quantenausbeute (Fm`-F)/Fm Biotestentwicklung IV * * Ceratophyllum demersum C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l Stunden NOEC: > 4943,1 µg/l LOEC: > 4943,1 µg/l 2 Tage NOEC: > 4943,1 µg/l LOEC: > 4943,1 µg/l 7 Tage NOEC: > 4943,1 µg/l LOEC: > 4943,1 µg/l 14 Tage NOEC: > 4943,1 µg/l LOEC: > 4943,1 µg/l Vallisneria spiralis * * C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Stunden NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l 2 days NOEC: 718,7 µg/l LOEC: 2874,8 µg/l 14 Tage NOEC: > 45997,6 µg/l LOEC: > 45997,6 µg/l Abbildung 72: Mittelwerte und Standardabweichungen der Quantenausbeute der Gruppe 3-Makrophyten (n=9) und NOEC/LOEC-Werte (2,4-D). Signifikanter Unterschied nach Dunnett's Multiple Comparison Test: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0, PHYTOPLANKTON Atrazin Der durchschnittliche Chlorophyll a-gehalt in den Medien der Versuche mit den Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten ist mit der jeweiligen Standardabweichung in der Abbildung 73 dargestellt. Die Werte finden sich zudem im Anhang. Bei dem Versuch mit Mentha aquatica wiesen die Medien der Kontrollen mit durchschnittlich 55,6 µg/l (C) und 40,9 µg/l (SC) Chlorophyll a am Versuchsende eine deutlich höhere Algendichte als in den Medien der belasteten Systeme auf. Diese nahm von durchschnittlich 14,4 µg/l Chlorophyll a in der I. Belastungsstufe (9 µg/l Atrazin) bis zu 0,2 µg/l Chlorophyll a in der IV. Belastungsstufe (575,9 µg/l Atrazin) kontinuierlich ab. Auch bei Myriophyllum nahm der Chlorophyll a-gehalt in den Medien konzentrationsabhängig ab. Allerdings wiesen hier auch die Medien der Kontroll-Gruppen mit 4,7 µg/l (C) bzw. 9,8 µg/l (SC) wesentlich weniger Chlorophyll a auf als die Medien der Kontroll- Gruppen beim Mentha-Versuch. Während bei dem Versuch mit Ceratophyllum die Algendichte in den Medien der Kontrollen mit 5,8 µg/l (C) bzw. 4,9 µg/l (SC) Chlorophyll a ähnlich gering war wie bei 140

162 chlorophyll a [µg/l] Biotestentwicklung IV dem Myriophyllum-Versuch, kam es in der I. und II. Belastungsstufe (9 µg/l bzw. 36 µg/l Atrazin) zu einer höheren Algendichte als in den Kontrollen. Auch bei dem Vallisneria-Versuch war die Algendichte in den Medien in der II. Belastungsstufe deutlich höher als die der Kontrollen. Die Medien der III. und IV. Belastungsstufe wiesen auch in den Ceratophyllum- und Vallisneria-Versuchen eine sehr geringe Algendichte auf Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis C SC 9 µg/l 36 µg/l 144 µg/l 575,9 µg/l C SC 3,3 µg/l 13,4 µg/l 53,6 µg/l 214,3 µg/l C SC 8,8 µg/l 35,1 µg/l 140,6 µg/l 562,2 µg/l C SC 9,2 µg/l 36,6 µg/l 146,4 µg/l 585,6 µg/l Abbildung 73: Mittelwerte und Standardabweichungen des Chlorophyll a-gehaltes im Medium (n=3) der Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten am Tag 14 der Atrazin Versuche. 2,4-D (Phytoplankton) Die Ergebnisse der Messungen der Phytoplanktondichte in den Medien der 2,4-D- Versuchsreihen der Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten am Tag 14 sind in der Abbildung 74 dargestellt und werden zusätzlich im Anhang zusammengefasst. Die niedrigsten Phytoplanktondichten wurden insgesamt in der Versuchsreihe mit Ceratophyllum demersum gemessen. Hier lagen im Mittel alle Chlorophyll a-werte unter 10 µg/l. Bei Mentha aquatica lag am Versuchsende der Chlorophyll a-gehalt des Mediums im Mittel bei der Lösungsmittelkontrolle bei etwa 20 µg/l. Bei den beiden niedrigen Belastungsstufen I und II lag der Chlorophyll a-gehalt des Mediums etwas darunter, bei den beiden höheren Belastungsstufen III und IV etwas darüber. Sowohl bei den Versuchen mit Myriophyllum aquaticum als auch mit Vallisneria spiralis zeigte der Chlorophyll a- Gehalt des Mediums größere Schwankungen zwischen den unterschiedlichen Konzentrationsstufen und den Kontrollen, ohne dass jedoch ein Trend erkennbar gewesen wäre. 141

163 chlorophyll a [µg/l] Biotestentwicklung IV Mentha aquatica Myriophyllum aquaticum Ceratophyllum demersum Vallisneria spiralis C SC 76,6 µg/l 306,5 µg/l 1225,9 µg/l 4903,7 µg/l C SC 81,2 µg/l 324,9 µg/l 1299,5 µg/l 5197,8 µg/l C SC 77,2 µg/l 308,9 µg/l 1235,8 µg/l 4943,1 µg/l C SC 718,7 µg/l 2874,8 µg/l 11499,4 µg/l 45997,6 µg/l Abbildung 74: Mittelwerte und Standardabweichungen des Chlorophyll a-gehaltes im Medium (n=3) der Gruppe 2- und Gruppe 3-Makrophyten am Tag 14 der 2,4-D Versuche. 6.4 DISKUSSION ANALYTIK Da es sowohl bei den Versuchen mit Atrazin als auch mit 2,4-D zu Schwankungen in den tatsächlichen Konzentrationen der unterschiedlichen Stammlösungen kam, wurden die tatsächlichen Konzentrationen für eine weitere Auswertung und Interpretation der Ergebnisse herangezogen. Bis auf bei 2 Ausnahmen (Myriophyllum/Atrazin und Vallisneria/2,4-D) wurden die Nominalkonzentrationen mit 79% bis 91% bei Atrazin und 96% bis 102% bei 2,4-D jedoch annähernd erreicht LEITFÄHIGKEIT DES MEDIUMS Die Leitfähigkeit des Mediums wird durch Wasserpflanzen v.a. über 3 Prozesse beeinflusst: 1. Verringerung der Leitfähigkeit aufgrund von Nährstoffaufnahme durch die Pflanzen; 2. Erhöhung der Leitfähigkeit durch aktive Abgabe von Ionen (siehe Kapitel Aquatische Photosynthese) und organischen Verbindungen durch die Pflanze (siehe Kapitel Ökologische Funktion von Makrophyten); 142

164 Biotestentwicklung IV 3. Erhöhung der Leitfähigkeit durch Elektrolytaustritt aus den Zellen aufgrund von Membranschädigungen (siehe DÜRHOLT ET AL. 1995; EICH ET AL. 2000; KOCH ET AL. 1995). Somit zeigt eine verringerte Leitfähigkeitsabnahme in den herbizidbelasteten Medien gegenüber den Medien der Kontroll-Gruppen eine verringerte Nährstoffaufnahme durch die Pflanzen an. Eine Erhöhung der Leitfähigkeit des Mediums in der Testreihe ohne Sediment (Gruppe 1-Makrophyten), wie sie in den hohen Konzentrationsstufen bei Atrazin auftrat, lässt vermuten, dass hier der Elektrolytaustritt aus den geschädigten Pflanzenzellen überwiegt. Da die Testsysteme mit den Gruppe 2- und 3-Makrophyten Sediment als zusätzliche Komponente enthielten, welches mit unverdünntem Steinberg- Medium hergestellt wurde, ist hier ein Nachdiffundieren von Nährstoffen aus dem Sediment in das weniger nährstoffreiche Medium zu erwarten. Entsprechend kam es bei Mentha und Myriophyllum auch in den unbelasteten Systemen zu einer Leitfähigkeitszunahme der Medien. Der Vergleich zu den submersen Pflanzen, die in unbelasteten Systemen trotz Nachdiffundieren von Nährstoffen aus dem Sediment eine deutliche Abnahme der Leitfähigkeit im Medium bewirkt haben, legt die Vermutung nahe, dass die Nährstoffversorgung von Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum in ihrer emersen Form überwiegend aus dem Sediment über die Wurzeln stattfindet. Eine direkte Aufnahme aus dem Medium über die Blätter scheint hier von untergeordneter Bedeutung zu sein. Während bei allen Atrazin Einzelspeziestests deutliche Dosis-Wirkungs-Beziehungen bezüglich der Abnahme der Leitfähigkeit im Medium auftraten, konnte bei dem 2,4-D- Versuch über diesen Parameter außer bei Mentha aquatica kein Effekt nachgewiesen werden PH-WERT DES MEDIUMS Änderungen des ph-wertes des Mediums sind ein Ausdruck für Metabolismus in einem Ökosystem (KERSTING & VAN DEN BRINK 1997) bzw. der Organismen in einem Becherglas. Respiration und Photosynthese wirken sich direkt auf den CO 2 -Haushalt des Mediums aus und beeinflussen so den ph-wert des Mediums (siehe Kapitel 1.6.3). Während ein hoher Anstieg des ph-wertes im Medium in der Lichtphase auf eine hohe Photosyntheseaktivität der photoautotrophen Organismen in dem Medium schließen lässt, sinkt die Fähigkeit zur ph-wert-erhöhung der Wasserpflanzen mit dem Ausmaß der Photosynthesehemmung. Das Einbringen des Photosynthesehemmers Simazine in aquatische mit Makrophyten besetzten Mesokosmen führte z.b. in einer Studie von 143

165 Biotestentwicklung IV VERVLIET-SCHEEBAUM (2006) zu dosisabhängigen ph-wert-änderungen über den Versuchszeitraum von mehreren Wochen. Werden die ph-wert-änderungen der Medien der hier vorgestellten Einzelspeziestests herangezogen, können bei Atrazin deutliche Effekte auf den Metabolismus nachgewiesen werden. Bis auf den Test mit Myriophyllum aquaticum zeigen alle anderen Tests eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung bezüglich der ph-wert-änderungen. Bei dem Test mit Mentha aquatica sind sogar die Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle schon ab der niedrigsten Belastungsstufe von 9 µg/l signifikant. Bei dem Auxin-Herbizid 2,4-D hingegen kann nur bei den Tests mit Riccia fluitans und Ceratophyllum demersum eine verminderte ph-wert-erhöhung festgestellt werden O 2 -GEHALT DES MEDIUMS Wie der ph-wert ist auch der Sauerstoffgehalt des Mediums ein Summenparameter für metabolische Prozesse im Medium (KERSTING & VAN DEN BRINK 1997). Da Änderungen des Sauerstoffgehaltes des Mediums wie beim ph-wert primär durch die Prozesse Respiration, Photosynthese und atmosphärischer Gasaustausch bewirkt werden, korrelieren diese beiden Parameter in aquatischen Ökosystemen i.d.r. stark miteinander. Entsprechend korrelieren auch die Ergebnisse der beiden Parameter bei den Tests, bei denen auch der O 2 -Gehalt des Mediums gemessen wurde WACHSTUMSPARAMETER Das Wachstum von Pflanzen ist ein Summenparameter, der ein komplexes Netzwerk aus Prozessen integriert. Aus ökotoxikologischer Sicht ist der Endpunkt Wachstum eine Black Box, die keine Rückschlüsse auf die verantwortlichen Prozesse erlaubt, die eine Schädigung der Pflanzen hervorrufen. Wachstumsendpunkte sind i.d.r. die einzigen Kriterien, die für die Beurteilung einer Substanz auf ihr Risikopotential gegenüber Wasserpflanzen herangezogen werden (z.b. ARTS ET AL. 2008; BELGERS ET AL. 2007; CEDERGREEN & STREIBIG 2005; CEDERGREEN ET AL. 2004; COYNER ET AL. 2001; DAVIES ET AL. 2003; FAIRCHILD ET AL. 1998; KNAUER ET AL. 2006; MALTBY ET AL. 2010; OECD 2002). Der Erkenntnisgewinn aus diesen Ergebnissen ist unumstritten, aber dennoch muss die Interpretation von Wachstumsparametern in einigen Fällen differenziert erfolgen, wie die Ergebnisse der hier vorgestellten Tests zeigen. So konnten z.b. bei Ceratophyllum demersum weder für Atrazin noch für 2,4-D Effektkonzentrationen über Wachstumsendpunkte berechnet werden, obwohl beide Substanzen deutliche Effekte auf diese Art bewirkten, wie die Fotos aus Abbildung 61 und Abbildung 66 zeigen. Im 2,4-D-Versuch stiegen bei Ceratophyllum demersum die Wachstumsraten der I. und II. 144

166 Biotestentwicklung IV Belastungsstufe an, während die der III. und IV. deutlich gegenüber den Kontrollreihen (C und SC) abfielen. Aufgrund dieses als Hormesis bekannten Effekts, der bereits von BELGERS ET AL. (2007) im Zusammenhang mit 2,4-D beschrieben wurde, konnte keine Dosis-Wirkungs-Kurve gefittet werden, die die Berechnung eines EC50 zuließe. Bei den meisten Tests konnten jedoch mindestens bei einem Wachstumsparameter Dosis- Wirkungs-Beziehungen aufgezeigt werden, die die Berechnung von Effektkonzentrationen ermöglichten. Bis auf bei Riccia fluitans konnten bei allen getesteten Makrophyten LOEC-Werte über Wachstumsendpunkte für beide Testsubstanzen berechnet werden. Der niedrige LOEC- Wert von Salvinia natans von 76,6 µg/l 2,4-D ist jedoch kritisch zu betrachten, da die höheren Belastungsstufen keine signifikanten Unterschiede zur Lösungsmittelkontrolle aufweisen und auch die Kontrollreihe C ein deutlich geringeres Wachstum als die SC- Reihe aufweist. Ein Vergleich der I. Belastungsstufe (76,6 µg/l) mit der Kontrollreihe C würde keine signifikanten Unterschiede ergeben. Bei dem 2,4-D-Versuch mit Vallisneria spiralis ist die durchschnittliche Wurzellänge bei der Kontrolle ohne Lösungsvermittler (C) signifikant höher als die der SC-Kontrolle und aller belasteten Systeme. Möglicherweise ist dieser Unterschied auf eine Hemmung durch den Lösungsvermittler Ethanol zurückzuführen. In einer Studie von EL JAY (1996) werden schädigende Effekte auf Algen durch Ethanol bei einer Konzentration von 0,05% beobachtet. Die in dem Test verwendete Konzentration von 0,01%, die den Empfehlungen der US Environmental Protection Agency (EPA 1975) entspricht, liegt allerdings um das 5fache unter dieser Konzentration, sodass das Wurzelwachstum von Vallisneria spiralis sehr sensitiv auf Ethanol reagiert QUANTENAUSBEUTE DES PSII Die Atrazin-Ergebnisse der Quantenausbeute-Messungen zeigen, dass bei allen Arten mit Ausnahme der beiden emersen Wasserpflanzen Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum ein Leistungsabfall des Photosystems II in Abhängigkeit von der Dosis schon nach 2 Stunden nach Applikation zu verzeichnen ist. Bei den beiden emersen Pflanzen treten hier Effekte erst ab dem 2. Tag nach Applikation auf. Demnach hat die Aufnahme des Wirkstoffes gegenüber den anderen Pflanzen zeitverzögert stattgefunden. Statt einer raschen Aufnahme aus dem Medium über die Blätter erfolgte die Aufnahme vermutlich v.a. aus dem Sediment über die Wurzeln, in welches der Wirkstoff erst hinein diffundieren musste. Diese Hypothese deckt sich mit der oben formulierten Hypothese, die aus den Leitfähigkeits-Ergebnissen des Mediums abgeleitet wurde, dass bei diesen beiden Pflanzen die (Nähr-) Stoffaufnahme v.a. über die Wurzeln und nicht über die (submersen) Blätter stattfindet. 145

167 Biotestentwicklung IV Je nach Art verläuft die Toxikokinetik von Atrazin unterschiedlich. Während die Photosyntheseleistung des Photosystems II über den Versuchszeitraum von 14 Tagen nach Eintritt des durch Atrazin ausgelösten Effekts bei einigen Arten mehr oder weniger unverändert blieb (Lemna, Salvinia, Mentha, Ceratophyllum), erfuhren andere Arten (Riccia, Myriophyllum, Vallisneria) eine deutliche Wiedererholung zum Versuchsende. Entsprechend kann sich der Zeitpunkt der Messung stark auf die Berechnung der Effektkonzentrationen auswirken, die auf die Quantenausbeute begründen. Bei 2,4-D konnten nur bei Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum am Tag 14 ein leichtes, aber signifikantes Abfallen der Quantenausbeute verzeichnet werden. Auch bei Vallisneria spiralis treten in 2 Belastungsstufen leicht geringere Quantenausbeute- Werte auf, die aber nicht in einem Dosis-Wirkungs-Verhältnis stehen. Die sich daraus ableitenden LOEC-/ NOEC-Werte müssen entsprechend als kritisch betrachtet werden. Bei Ceratophyllum demersum, der Testpflanze, die optisch am stärksten von 2,4-D geschädigt wurde, und bei Riccia fluitans findet sogar eine dosisabhängige Erhöhung der Quantenausbeute statt. Diese muss nicht zwangsläufig auch eine gesteigerte Photosyntheseleistung anzeigen. Unter bestimmten Stresssituationen wie Trockenheit oder Kälte kann sich das Verhältnis von Kohlenstofffixierung und Elektronentransport verändern, indem noch andere Elektronen-Senken als die CO 2 -Assimilation, möglicherweise O 2, hinzukommen (FREYER ET AL. 1998). In diesem Fall müssten mehr Elektronen die Elektronentransportkette durchlaufen, um die gleiche Menge CO 2 zu fixieren als bei ungestressten Pflanzen PHYTOPLANKTON Eine geringe Algenentwicklung in Einzelspeziestests mit Makrophyten ist unabdingbar um valide, aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Algen interagieren mit Makrophyten und können über Konkurrenz und Allelopathie zu verminderter Vitalität und/oder vermindertem Wachstum von Makrophyten führen (siehe z.b. OZIMEK ET AL. 1991; SZABÓ ET AL. 1998). Durch den Metabolismus der Algen werden zudem die physikalischchemischen Parameter des Wassers beeinflusst, sodass je nach Algendichte die Interpretation dieser Parameter kritisch zu betrachten ist. Die Ergebnisse der Algendichtenanalysen zeigen, dass der Phytoplanktongehalt am Ende eines Versuches je nach Testorganismus variieren kann. Die Phytoplanktondichte im Medium von Ceratophyllum demersum war bei den Tests mit beiden Testsubstanzen in allen Kontrollreihen und Belastungsstufen mit unter 20 µg/l verhältnismäßig gering und ist vermutlich u.a. auf die effektive Wirkung allelopathischer Substanzen bei dieser Art zurückzuführen (siehe GROSS ET AL. 2003). Im Medium von Vallisneria spiralis dagegen war die Phytoplanktonentwicklung während des Versuchszeitraumes von

168 Biotestentwicklung IV Tagen deutlich höher. Hier wurden Chlorophyll a-konzentrationen von bis zu 70 µg/l erreicht. Auffällig ist, dass bei den Atrazin-Versuchen unabhängig von der Testpflanze die beiden höchsten Belastungsstufen mit unter 5 µg/l oft sogar unter 1 µg/l Chlorophyll a eine sehr geringe Algendichte aufwiesen. Die in den Testsystemen vorkommenden Algen scheinen ab etwa 140 µg/l Atrazin in ihrem Wachstum stark gehemmt. Bei dem Test mit Mentha aquatica wies das Algenwachstum gegenüber den Kontrollreihen schon bei 9 µg/l Atrazin weniger als 50% auf. Die hohe Sensitivität von Algen gegenüber Atrazin deckt sich weitgehend mit den Werten aus der Literatur. FAIRCHILD ET AL. (1998) hat in einer Vergleichsstudie EC50- Werte für verschiedene Algenspezies zwischen 94 µg/l (Chlorella) und 176 µg/l (Chlamydomonas) ermittelt (wenn die Ergebnisse von Anabeana mit einem EC50 größer 3000 µg/l außen vorgelassen werden). Der EC50 von Selenastrum capricornutum und Anabaena flos-aquae liegt nach einem 7tägigen single-species Test bei 214 µg/l (S. capricornutum) bzw. 766 µg/l (A. flos-aquae) (ABOU-WALY ET AL. 1991). SEGUIN ET AL. (2001) geben für Chlorella vulgaris einen EC50-Wert von 4,3 µg/l an, während die am wenigsten sensitive Algenart dieser Studie (Nitszchia sp.) mit 412 µg/l einen fast 100fach höheren EC50 aufweist. Gegenüber 2,4-D zeigten die Chlorophyll a-gehalte in den Medien keine Dosis- Wirkungs-Beziehungen. Sogar bei der hohen Konzentration von 46 mg/l 2,4-D bei dem Vallisneria spiralis Test konnte kein verändertes Algenwachstum festgestellt werden. Die geringe Sensitivität von Algen gegenüber 2,4-D ist bekannt. In der Literatur liegen die 2,4-D-EC50-Werte von Algen zwischen 3,88 mg/l (Navicula pelliculosa) und 156 mg/l (Anabaena flos-aquae) (USDA 2006) GESAMTBEWERTUNG Je nach Endpunkt variiert die Sensitivität eines Testorganismus` erheblich. In der Tabelle 44 werden für die verschiedenen Testorganismen die EC50-Werte für Atrazin, in der Tabelle 46 für 2,4-D zusammengefasst, die aus den unterschiedlichen Endpunkten hervorgehen. Die Tabelle 45 gibt analog die LOEC-Werte für Atrazin bzw. die Tabelle 47 die LOEC-Werte für 2,4-D wieder. Unter der Spalte Wachstum wird jeweils der sensitivste Endpunkt für einen Testorganismus und bei der Quantenausbeute der Tag mit dem niedrigsten Wert ausgewählt. Der Endpunkt, der insgesamt bei einem Testorganismus am sensitivsten ist, ist rot gekennzeichnet. Für die 3 Testorganismen Riccia fluitans, Salvinia natans und Mentha aquatica werden die niedrigsten EC50-Werte bei Atrazin über die Änderung der Leitfähigkeit des Mediums erreicht. Gerade bei Mentha aquatica lag die Algendichte bei den unbelasteten Replikaten mit durchschnittlich 147

169 Biotestentwicklung IV 40 µg/l Chlorophyll a verhältnismäßig hoch und die der belasteten Systeme in Abhängigkeit von der Konzentration von Atrazin sehr niedrig. Die niedrigen Effektkonzentrationen, ein EC50-Wert von 3,3 µg/l bzw. ein LOEC-Wert von 9 µg/l, die sich bei Mentha über die Leitfähigkeitsänderungen des Mediums ergeben, scheinen daher stark von dem Faktor Algen geprägt zu sein. Tabelle 44: Übersicht über die EC50-Werte in µg/l Atrazin der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils zusätzlich der Messzeitpunkt angegeben, der am frühsten den niedrigsten Wert aufweist. Der jeweils sensitivste Parameter ist rot gekennzeichnet. FG: Frischgewicht. Leitf. ph O 2 Wachstum Quantenausbeute Lemna nc 607,3 221,8 (Fronds) 84,5 (2d) Riccia 13,8 432,8 86,9 62,7 (FG) 228,5 (2d) Salvinia 4,3 323,7 16,6 (FG) 65,5 (7d) Mentha 3,3 nc 642,7 (FG) 335,1 (2d) Myriophyllum nc nc nc 917,4 (2d) Ceratophyllum 171,9 125,3 134,3 nc 374,5 (2d) Vallisneria nc nc nc 50,0 (FG) 35,1 (2d) nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. Tabelle 45: Übersicht über die LOEC-Werte in µg/l Atrazin der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils zusätzlich der Messzeitpunkt angegeben, der am frühsten den niedrigsten Wert aufweist. Der jeweils sensitivste Parameter ist rot gekennzeichnet. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. Leitf. ph O 2 Wachstum Quantenausbeute Lemna 138,7 138,7 138,7 (Fronds) 8,7 (2d) Riccia 31,6 31,6 126,2 126,2 (FG) 31,6 (2h) Salvinia 145,7 36,4 145,7 (FG) 9,1 (2d) Mentha 9,0 9,0 144,0 (FG) 144,0 (2d) Myriophyllum 53,6 nc 13,4 (SL) 214,3 (2d) Ceratophyllum 140,6 140,6 140,6 nc 8,8 (2d) Vallisneria 146,4 146,4 146,4 9,2 (WL) 9,2 (2d) nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. 148

170 Biotestentwicklung IV Tabelle 46: Übersicht über die EC50-Werte in µg/l 2,4-D der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils zusätzlich der Messzeitpunkt angegeben, der am frühsten den niedrigsten Wert aufweist. Der jeweils sensitivste Parameter ist rot gekennzeichnet. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. Leitf. ph O 2 Wachstum Quantenausbeute Lemna nc nc (Fronds) nc Riccia nc 14242,0 826,7 nc nc Salvinia nc nc nc nc Mentha nc nc 668,2 (SL) (d14) Myriophyllum nc nc 1949 (FG) nc Ceratophyllum 1209,0 9950,0 1177,0 nc nc Vallisneria nc nc nc 3971 (WL) nc nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. Tabelle 47: Übersicht über die LOEC-Werte in µg/l 2,4-D der verschiedenen Endpunkte bei den unterschiedlichen Makrophyten. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils zusätzlich der Messzeitpunkt angegeben, der am frühsten den niedrigsten Wert aufweist. Der jeweils sensitivste Parameter ist rot gekennzeichnet. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. Leitf. ph O 2 Wachstum Quantenausbeute Lemna nc nc 1225,9 (Fronds) nc Riccia nc 4805,7 1201,4 nc nc Salvinia nc nc 76,6 (FG) nc Mentha 1225,9 nc 306,5 (FG, SL) 306,5 (d14) Myriophyllum nc nc 342,9 (FG) 5197,8 (d14) Ceratophyllum nc 4943,1 4943,1 4943,1 (FG, SL) nc Vallisneria nc nc nc 2874,8 (WL) 2874,8 (d2) nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. Gleiches gilt entsprechend auch für die anderen beiden physikalisch-chemischen Parameter ph-wert und Sauerstoffgehalt, auch wenn bei diesen Ergebnissen der Zusammenhang weniger offensichtlich ist. Da bei dem 2,4-D-Versuch die Algendichte im Medium von Ceratophyllum demersum unabhängig von der Höhe der Belastung niedrig war, konnte hier der Einfluss der Algen auf die physikalisch-chemischen Parameter nur gering sein. Die hier ermittelten EC50- und LOEC-Werte können mit relativ hoher Sicherheit als von Algen unbeeinflusst gelten. Inwieweit die Ergebnisse der Endpunkte Leitfähigkeit, ph-wert und O 2 -Gehalt in Einzelspeziestests mit Makrophyten für eine Risikobewertung einer Substanz herangezogen werden können, hängt demnach entscheidend von der Anwesenheit und Abundanz von Algen im Medium ab. Der 2,4-D-Versuch mit Ceratophyllum demersum zeigt den Nutzen physikalischchemischer Parameter als zusätzliche Endpunkte. Weder über Wachstumsparameter, noch über PAM-Messungen konnten EC50-Werte berechnet werden. Der EC50 bezüglich O 2 -Gehalts des Mediums liegt mit 1177 µg/l fast um das 4fache unter dem 149

171 Biotestentwicklung IV LOEC-Wert von 4943,1 µg/l, der aus den Ergebnissen der Parametern Frischgewicht und Sprosslänge resultiert. Der Vergleich von Wachstums-Endpunkten und der Quantenausbeute bei den Atrazin- Versuchen zeigt, dass diese beiden Parameter nicht zwangsläufig korrelieren, aber sich bezüglich der Effektkonzentrationen in der gleichen Größenordnung bewegen. Während bei Riccia fluitans und Salvinia natans Wachstumsendpunkte sensitiver waren, führten bei den anderen Pflanzen die Quantenausbeute-Messungen zu sensitiveren Ergebnissen. Bei dem Photosynthesehemmer Atrazin konnte über die Quantenausbeute für jeden Testorganismus ein EC50 ermittelt werden, während die Wachstumsendpunkte nur bei 5 von 7 Testorganismen eine Berechnung von EC50-Werten ermöglichten. Bei dem Auxin-Herbizid 2,4-D hingegen konnten nur bei einer von 7 Pflanzen über die Quantenausbeute, aber bei 4 von 7 Pflanzen über Wachstumsendpunkte ein EC50 berechnet werden. Bei einer reinen Betrachtung der Wachstumsendpunkte ergibt sich für Atrazin folgendes Ranking bezüglich der Sensitivität der Testorganismen: Salvinia natans (EC50: 16,6 µg/l) < Vallisneria spiralis (EC50: 50,0 µg/l) < Riccia fluitans (EC50: 62,7 µg/l) < Lemna gibba (EC50: 221,8 µg/l) < Mentha aquatica (EC50: 642,7 µg/l) < Myriophyllum aquaticum/ceratophyllum demersum (EC50: nc). Werden sowohl Wachstumsendpunkte als auch die Quantenausbeute-Messungen bei einem Sensitivitätsranking berücksichtigt, ergibt sich folgende Reihenfolge, die auch Werte für Ceratophyllum demersum und Myriophyllum aquaticum berücksichtigt: Salvinia natans (EC50: 16,6 µg/l) < Vallisneria spiralis (EC50: 35,1 µg/l) < Riccia fluitans (EC50: 62,7 µg/l) < Lemna gibba (EC50: 84,5 µg/l) < Mentha aquatica (EC50: 335,1 µg/l) < Ceratophyllum demersum (EC50: 374,5 µg/l) < Myriophyllum aquaticum (EC50: 917,4 µg/l). Die Atrazin-EC50-Werte von Makrophyten liegen in der Literatur in der gleichen Größenordnung. In einer Studie von FAIRCHILD ET AL. (1998) variieren die EC50-Werte je nach Testorganismus zwischen 22 µg/l (Ceratophyllum demersum) und 132 µg/l (Myriophyllum heterophyllum). KIRBY & SHEAHAN (1994) geben für Lemna minor einen EC50 von 56 µg/l an, während in einer Studie von FAIRCHILD ET AL. (1997) der EC50 von Lemna minor bei 153 µg/l liegt. Ein Sensitivitätsranking der Testorganismen bezüglich 2,4-D ist von den Quantenausbeute-Ergebnissen unabhängig. Für die folgende Reihenfolge wurden nur Wachstumsendpunkte herangezogen, da keine niedrigeren Quantenausbeute-EC50-Werte existieren. 150

172 Biotestentwicklung IV Mentha aquatica (EC50: 668,2 µg/l) < Myriophyllum aquaticum (EC50: 1949 µg/l) Vallisneria spiralis (EC50: 3971 µg/l) < Lemna gibba (EC50: µg/l) < Riccia fluitans/salvinia natans/ceratophyllum demersum (EC50: nc). Wird davon ausgegangen, dass 2,4-D in den getesteten Konzentrationen keine oder vernachlässigbar geringe Auswirkungen auf Algen hat (siehe oben), sollten die Ergebnisse der EC50-Berechnungen nach den physikalisch-chemischen Parametern unbeeinflusst von diesen sein. Werden diese Ergebnisse in das Ranking integriert, ergibt sich folgende Reihenfolge: Mentha aquatica (EC50: 668,2 µg/l) < Riccia fluitans (EC50: 826,7 µg/l) < Ceratophyllum demersum (EC50: 1177 µg/l) < Myriophyllum aquaticum (EC50: 1949 µg/l) Vallisneria spiralis (EC50: 3971 µg/l) < Lemna gibba (EC50: µg/l) < Salvinia natans (EC50: nc). Die in dieser Studie ermittelten EC50-Werte liegen etwas höher als in bereits veröffentlichten Studien. In einer Studie von BELGERS ET AL. (2007) mit 9 verschiedenen Makrophyten weist die sensitivste Art Ranunculus aquatilis bezüglich Wurzellänge einen EC50 von 92 µg/l auf. Für die meisten Arten wurden in dieser Studie (BELGERS ET AL. 2007) je nach Endpunkt EC50-Werte von einigen hundert bis wenigen tausend µg/l angegeben. Allerdings konnte auch in der oben genannten Studie für Ceratophyllum demersum kein EC50 berechnet werden. In einer Studie von FAIRCHILD ET AL. (1997) wird ein EC50 für Lemna minor von über 100 mg/l 2,4-D angegeben. Die niedrigsten LOEC-Werte bezüglich 2,4-D der vorliegenden Arbeit weisen Mentha aquatica mit 306,5 µg/l und Myriophyllum aquaticum mit 342,9 µg/l auf (wenn man den zweifelhaften LOEC-Wert von Salvinia natans nicht mit einbezieht). In einer Mesokosmosstudie von FORSYTH ET AL. (1997) führte eine 2,4-D-Konzentration von 100 µg/l schon zu Schädigungen bei den Makrophyten Potamogeton pectinatus und Myriophyllum sibiricum. Auch hier liegen die Literaturwerte wieder etwas unter den in dieser Arbeit ermittelten Effektkonzentrationen. Allerdings zeigt der Vergleich von EC10- und LOEC/NOEC-Werten in den Tabellen 48 und 49, dass auch unterhalb des NOEC-Wertes durchaus Effekte auftreten können. Bei Atrazin ist der EC10 von Salvinia natans bezüglich Wachstum 26fach geringer als der entsprechende NOEC. Diese gewisse statistisch begründete Unschärfe bei der LOEC/NOEC-Bestimmung sollte generell bei der Bewertung ökotoxikologischer Tests berücksichtigt werden (siehe ISNARD ET AL. 2001). Obwohl in der Vergangenheit das Konzept der NOEC- Bestimmung scharf kritisiert wurde (CHAPMAN & CALDWELL 1996; HOEKSTRA & EWIJK 1993; LASKOWSKI 1995), weist es auch Vorteile auf (siehe SHIEH ET AL. 2001). Gerade wenn kein sigmodialer Dosis-Wirkungs-Verlauf, wie z.b. bei den 2,4-D-Versuchen mit 151

173 Biotestentwicklung IV Ceratophyllum demersum und Vallisneria spiralis, besteht, können Effektkonzentrationen über den LOEC/NOEC angegeben werden, während eine EC50- bzw. EC10- Berechnung nicht möglich ist (siehe Tabelle 49). Tabelle 48: Vergleich der EC10- und LOEC/NOEC-Werte der Atrazin-Versuche bezüglich der Endpunkte Wachstum und Quantenausbeute. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils der Wert des Messzeitpunktes angegeben, der den niedrigsten Wert aufweist. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. EC10 [µg/l] Wachstum LOEC [µg/l] NOEC [µg/l] EC10 [µg/l] Quantenausbeute LOEC [µg/l] NOEC [µg/l] Lemna 85,8 (Fronds) 138,7 (Fronds) 34,7 (Fronds) 8,2 8,7 < 8,7 Riccia 12,2 (FG) 126,2 (FG) 31,6 (FG) 7,4 31,6 7,9 Salvinia 1,4 (FG) 145,7 (FG) 36,4 (FG) 9,7 9,1 < 9,1 Mentha 51,1 (FG) 144 (FG) 36,0 (FG) 44, Myriophyllum 3,2 (WL) 13,4 (SL) 3,3 (SL) 199,6 214,3 53,6 Ceratophyllum nc nc nc 2,0 8,8 < 8,8 Vallisneria 8,1 (FG) 9,2 (WL) < 9,2 (WL) 2,0 9,2 < 9,2 nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx. Tabelle 49: Vergleich der EC10- und LOEC/NOEC-Werte der 2,4-D-Versuche bezüglich der Endpunkte Wachstum und Quantenausbeute. Beim Endpunkt Wachstum wird jeweils der sensitivste Parameter herangezogen. Beim Endpunkt Quantenausbeute wird jeweils der Wert des Messzeitpunktes angegeben, der den niedrigsten Wert aufweist. FG: Frischgewicht; SL: Sprosslänge; WL: Wurzellänge. EC10 [µg/l] Wachstum LOEC [µg/l] NOEC [µg/l] EC10 [µg/l] Quantenausbeute LOEC [µg/l] NOEC [µg/l] Lemna 365,1 (Fronds) 1225,9 (Fronds) 306,5 (Fronds) nc nc nc Riccia nc nc nc nc nc nc Salvinia nc 76,6 (FG) 2 < 76,6 (FG) 2 nc nc nc Mentha 64,8 (WL) 306,5 (FG, SL) 76,6 (FG, SL) ,5 76,6 Myriophyllum 347,1 (FG) 342,9 (FG) 81,2 (FG) nc 5197,8 1299,5 Ceratophyllum nc 4943,1 (FG, SL) 1235,8 (FG, SL) nc nc nc Vallisneria nc 2874,8 (WL) 718,7 (WL) nc 2874,8 718,7 nc: nicht berechenbar oder Grenze-Konfidenzintervall > 1000*ECx METHODENKRITIK Die Verwendung von Medium, das sich zu gleichen Teilen aus filtriertem Teichwasser und Steinberg-Medium zusammensetzt, war ein Kompromiss aus Standardisierbarkeit und Durchführbarkeit der Tests mit den eingesetzten Makrophytenarten. Da die insgesamt 14 Einzelspeziestests zu unterschiedlichen Zeiten im Jahr durchgeführt wurden, variierte das verwendete Teichwasser entsprechend bezüglich Nährstoffgehalt und anderer chemischer und biologischer Eigenschaften. Wie für Mentha aquatica und Myrio- 2 dieser Wert ist kritisch zu betrachten - siehe Diskussion oben 152

174 Biotestentwicklung IV phyllum aquaticum wäre auch für die anderen Testorganismen ein standardisiertes Medium anzustreben, um eine bessere Reproduzierbarkeit der Tests zu ermöglichen. Hierzu müssen für die verschiedenen Wasserpflanzen weitere Tests mit verschiedenen Nährmedien bzw. Nährstoffzusammensetzungen erfolgen. Ein zweiter Kritikpunkt betrifft die Methode der PAM-Messungen bei den Wasserpflanzen. Die PAM-Messungen zur Ermittlung der Quantenausbeute wurden an den Testorganismen durchgeführt, nachdem die Pflanzen aus dem Medium genommen wurden. Diese erforderliche Maßnahme führt zu einer kurzen Störung des Tests, da der Testorganismus einerseits für die Dauer von etwa 1 Minute nicht in dem belasteten Medium ist, andererseits als Wasserpflanze für diesen Zeitraum sich im artfremden Medium Luft befindet. Eine weitere Störung erfährt der Organismus durch die Messung mit der leaf clip extension der Mini-PAM, da je nach Geschick des Anwenders leichte Quetschungen des Blattes/der Pflanze durch diese nicht ausgeschlossen werden können. Auch wenn diese aufgezeigten Störungen möglicherweise nur geringen Einfluss auf die Ergebnisse haben, wäre hier eine berührungsfreie Methode zur Erfassung der Photosyntheseleistung von Vorteil (siehe Kapitel 7) FAZIT Diese Studie zur Evaluierung der Quantenausbeute als zusätzlicher Endpunkt bei Biotests mit submersen und emersen Makrophyten und Etablierung eines Chlorophyll- Fluoreszenz-Biomarkers konnte sowohl die Notwendigkeit verschiedener Makrophyten für die Risikobewertung von Herbiziden (siehe VERVLIET-SCHEEBAUM ET AL. 2006) bestätigen als auch den Nutzen zusätzlicher physiologischer Endpunkte aufzeigen. Anhand der beiden Modellsubstanzen Atrazin und 2,4-D wird deutlich, wie unterschiedlich die Sensitivität von Arten gegenüber verschiedenen Stoffen ist. Erst über das Testen von mehreren Testorganismen ist es möglich, sehr sensitiv auf eine Substanz reagierende Pflanzen zu identifizieren. Während es bei 2,4-D zu erwarten war, dass der Standardtestorganismus Lemna unsensitiver als dikotyle Spezies reagieren würde (siehe BELGERS ET AL. 2007, BROCK ET AL. 2000), sollte eigentlich für Atrazin das Risiko mit Lemna ausreichend erfasst werden. Aber auch hier wurde mit Salvinia natans eine 5fach 3 sensitivere Makrophytenart als Lemna ermittelt. Insgesamt haben sich alle 7 verwendeten Makrophyten als geeignet für die Durchführung von Biotests erwiesen. Mit den beiden dikotylen, im Sediment wurzelnden Makrophyten Mentha aquatica und Myriophyllum aquaticum wurden erfolgreich Biotests unter vollständig standardisierten Bedingungen durchgeführt, wobei Mentha aquatica bezüglich Atrazin und 2,4-D in 3 bzw. 13fach sensitiver, wenn nur Wachstumsparameter berücksichtigt werden 153

175 Biotestentwicklung IV beiden Fällen die sensitivere Art war. Bezüglich des EC50 ist Mentha aquatica 42fach sensitiver gegenüber 2,4-D als Lemna gibba. Nur bei Ceratophyllum demersum konnten von den Modellsubstanzen hervorgerufene Effekte nur unzureichend über Wachstumsparameter erfasst werden, obwohl Ceratophyllum von Atrazin und 2,4-D auch offensichtlich bei geringeren Konzentrationen geschädigt wurde, wie Chlorosen und Sprossdeformationen anzeigten. Die Messungen der Quantenausbeute erwiesen sich als unkompliziert und führten v.a. bei dem Photosynthesehemmer Atrazin zu informativen Ergebnissen. Dabei wiesen die Messwerte innerhalb einer Belastungsstufe wesentlich geringere Unterschiede auf als die Wachstumsparameter. Während über Wachstumsendpunkte nur bei 5 von 7 Makrophyten Atrazin-EC50-Werte berechnet werden konnten, war dies über die Quantenausbeute für alle 7 Testorganismen möglich. Bei 3 von 5 Testorganismen liegen die EC50- Werte, die über die Quantenausbeute berechnet wurden, unter denen, die über Wachstumsparameter berechnet wurden. Ein Makrophytenbiomarker, welcher die effektive Quantenausbeute der photochemischen Energieübertragung als zusätzlichen Endpunkt nutzt, kann bei photoinhibierenden Substanzen nicht nur den Effekt statistisch sicherer (da geringere Varianzen) messen als Wachstumsparameter, sondern, wie die Ergebnisse dieser Studie gezeigt haben, auch zusätzlich die Toxikokinetik abbilden. Da bei den meisten Arten schon nach 2 Stunden nach Applikation eine deutliche Hemmung der Quantenausbeute ab der II. Belastungsstufe festzustellen war, ließe sich ein derartiger Biomarker auch als effektive Methode einsetzten, um photoinhibierende Eigenschaften von Substanzen in Vortests ohne großen (Zeit-)Aufwand zu identifizieren und gegebenenfalls zu quantifizieren. Während Wachstumsendpunkte als Summenparameter keine Aussagen über die physiologische Art des Effekts erlauben, werden aber auch Schädigungen der Pflanzen erfasst, die nicht auf Photoinhibition beruhen. Hier stößt ein Quantenausbeute-Biomarker an seine Grenzen, wie die Versuche mit 2,4-D gezeigt haben. Bei dem Verdacht auf photoinhibierende Eigenschaften würde ein Quantenausbeute- Biomarker dagegen, wie es in dieser Arbeit vorgestellt wurde, für die Risikobewertung eines Stoffes einen erheblichen Informationsgewinn darstellen. Auch über die physikalisch-chemischen Parameter des Mediums Leitfähigkeit, ph-wert und O 2 -Gehalt können Effekte auf physiologische Prozesse, v.a. die Photosynthese, erfasst werden. Die vorliegende Studie zeigt, dass Photoinhibition (durch Atrazin ausgelöst) über diese Parameter sehr sensitiv quantifiziert werden kann. Allerdings zeigt die Studie auch, dass bei diesen Parametern eine Gefahr der Beeinflussung der Ergebnisse durch Algen besteht. Wenn Algenwachstum verhindert oder gering gehalten werden kann, könnte auf diesen Parametern beruhend ein weiteres effektives Bioassay etabliert werden (siehe DÜRHOLT ET AL. 1995; EICH ET AL. 2000; KOCH ET AL. 1995; RITZENTHALER 2006; VERVLIET-SCHEEBAUM ET AL. 2008). 154

176 Biotestentwicklung V 7 BIOTESTENTWICKLUNG V: DELTA ph BIOASSAY FÜR SUBMERSE MAKROPHYTEN 7.1 ZIELSETZUNG Durch die Photosynthese aquatischer Pflanzen wird dem Medium CO 2 entzogen. Ein Verbrauch an CO 2 verringert gleichzeitig die Konzentration von Kohlensäure, welche mit CO 2 in einem Gleichgewicht steht (siehe Kapitel aquatische Photosynthese). Somit führt eine Verringerung des CO 2 -Gehaltes im Medium zu einer Erhöhung des ph-wertes (PRINS & ELZENGA 1989). Umgekehrt führt die Freisetzung von CO 2 durch die Atmung der Pflanzen (und natürlich auch anderer Organismen) unter Wasser zu einem Absenken des ph-wertes. Daher sind Änderungen des ph-wertes in einem Gewässer Ausdruck metabolischer Prozesse und wurden bereits als sensitiver Indikator für ökotoxikologische Studien herangezogen (KERSTING & VAN DEN BRINK 1997; KERSTING & VAN WIJNGAARDEN 1999). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Bioassay für Makrophyten entwickelt, welcher auf diesem Prinzip der ph-wert-änderungen des Mediums als Indikator für metabolische Prozesse basiert. Mit dem Delta ph-bioassay lassen sich schnell und berührungslos Effekte von Substanzen auf Makrophyten erfassen, die den Metabolismus, v.a. die Photosynthese der Pflanzen beeinträchtigen. Ein eigens für dieses Bioassay entwickeltes Delta ph-mess-system ermöglicht kontinuierliche Messungen des ph-wertes mehrerer Testsysteme über einen längeren Zeitraum. Werden Testsysteme mit Makrophyten einem künstlichen Hell-/Dunkel-Rhythmus ausgesetzt, kann so der Verlauf des ph-wertes im Medium erfasst werden. Dabei werden photosynthetisch leistungsfähige Pflanzen den ph-wert des Mediums stärker verändern als in der Photosynthese eingeschränkte Pflanzen. In diesem Teil der Arbeit soll das Delta ph-bioassay als einfache und effektive Methode zur Risikobewertung von Umweltchemikalien vorgestellt werden und anhand eines Beispiels mit der Modellsubstanz Atrazin seine Anwendbarkeit in der Risikobewertung von Umweltchemikalien belegt werden. 7.2 MATERIAL & METHODEN DELTA PH-MESS-SYSTEM Für diese Arbeit wurde von Dr. Volkmar Gerhardt von der Universität Regensburg Fachbereich Physik ein Delta ph-mess-system entwickelt (siehe Abbildung 75), welches über 3 Sonden kontinuierlich ph-werte mit einer Genauigkeit bis zur 4. Nachkommastelle misst. Ein Messwert setzt sich, je nach Einstellung, aus dem Mittelwert 155

177 Biotestentwicklung V Abbildung 75: Delta ph Mess-System. 1: Delta ph-messeinheit; 2: PC; 3: ph-sonden; 4: Lichtmesser. von 100, 500 oder 2000 Einzelmessungen (im folgenden Intervall genannt) zusammen. Die Werte werden auf einen PC übertragen, von dem aus das Gerät über eine speziell entwickelte Software (Bildschirmkopie der Software in Abbildung 76) gesteuert wird. Der PC übernimmt damit gleichzeitig die Funktion eines Dataloggers und einer Steuereinheit. Zusätzlich verfügt das Gerät über ein Lichtmessgerät, das nach jedem Messzyklus (d.h. nachdem jede Sonde ein Intervall gemessen hat) die Lichtstärke in Watt pro m 2 misst. Somit kann über mehrere Tage (bis Wochen) kontinuierlich der ph-wert der Medien von bis zu 3 Testgefäßen und die Lichtstärke aufgenommen werden. Abbildung 76: Bildschirmkopie der Software für das Delta ph-mess-system. 156

178 Biotestentwicklung V TESTORGANISMEN Für diesen Versuch wurde Ceratophyllum demersum eingesetzt. Die Vorkultur der Testorganismen fand in einem 60 L Aquarium im Labor in natürlichem Teichwasser mit einem Licht/Dunkel-Rhythmus von 16 h/8 h statt VERSUCHSAUFBAU Um zu belegen, dass mit dem Delta ph-mess-system qualitativ Photosynthese von Wasserpflanzen erfasst werden kann, wurde folgendes Versuchsdesign gewählt: In drei 400 ml-bechergläser (hohe Passform; 7 cm Durchmesser) wurden jeweils 350 ml gefiltertes Teichwasser aus dem Vorkulturaquarium gefüllt. Da die Bechergläser während des Versuches auf Magnetrührer gestellt werden sollten, um eine Homogenisierung des Mediums zu gewährleisten, wurde den Bechergläsern jeweils ein Rührfisch zugegeben. Anschließend wurde ein Gitter aus Edelstahl in das Becherglas etwa 1 cm über dem Becherglasboden eingehängt, damit der Rührfisch nicht in Kontakt mit den Testorganismen kommen konnte (siehe Abbildung 77). Zwei der Bechergläser wurden während des Versuches nach 48 h mit einer definierten Menge an Atrazin versetzt, um eine photoinhibierende Belastungssituation zu erzeugen. In eines dieser mit Atrazin zu belastenden Bechergläser (nachfolgend A genannt) und in das unbelastet bleibende Becherglas (nachfolgend C genannt) wurden zuvor jeweils 1-2 Exemplare von Ceratophyllum demersum eingesetzt. Diese wurden so gewählt, dass die beiden Bechergläser A und C möglichst vergleichbare Exemplare aufwiesen. Hierzu wurden 10 Ceratophyllum-Pflanzen aus dem Vorkultivierungsaquarium entnommen und nach vorsichtigem Abtupfen gewogen. Die beiden bezüglich Frischgewicht ähnlichsten Pflanzen bzw. Pflanzenkombinationen wurden für die Versuche ausgewählt (siehe Kapitel 7.2.4). In das dritte (ebenfalls mit Atrazin) zu belastende Becherglas (nachfolgend M genannt) wurde keine Testpflanze eingesetzt. Dieses diente als Referenz. Nach Einsetzen der Testpflanzen wurden die drei Bechergläser und der Lichtmesser im gleichen Abstand von 11 cm zu einer 24 W Energiesparlampe Duluxstar der Firma Osram auf einem Magnetrührer in einer Dunkelkammer aufgestellt. In jedes Becherglas wurde eine ph-sonde des Delta-pH Mess-Systems in gleicher Höhe angebracht, um den ph-wert des Mediums über den Versuchszeitraum kontinuierlich zu messen. In der Dunkelkammer wurde über eine Zeitschaltuhr ein Licht/Dunkel-Rhythmus von 12 h/12 h eingestellt. Die Lichtphasen werden nachfolgend als L-Phasen, die Dunkelphasen entsprechend als D-Phasen benannt. Der so beschriebene Versuch wurde mit drei verschiedenen Belastungsstufen von 100 µg/l, 200 µg/l und 300 µg/l Atrazin wiederholt. Die Applikation der entsprechenden Menge an Atrazin-Stammlösung, die 157

179 Biotestentwicklung V Abbildung 77: Schematischer Überblick des Versuchsaufbau mit dem Delta ph-mess-system. C: unbelastetes Medium mit Ceratophyllum; A: mit Atrazin belastetes Medium mit Ceratophyllum; M: mit Atrazin belastetes Medium ohne Makrophyte. mit entionisiertem Wasser und Ethanol als Lösungsvermittler (0,01%) unter 72 h Rühren hergestellt wurde, erfolgte jeweils zu Beginn der zweiten L-Phase (also 24 h nach Versuchsbeginn). In das C-Becherglas wurden zu diesem Zeitpunkt die entsprechende Menge an entionisiertem Wasser und entsprechende Menge an Ethanol zugefügt BIOMASSE DER TESTORGANISMEN Das jeweilige Frischgewicht der eingesetzten Ceratophyllum-Testpflanzen in den unterschiedlichen Versuchen ist der Tabelle 50 zu entnehmen. Tabelle 50: Biomasse der eingesetzten Ceratophyllum-Testpflanzen zu Versuchsbeginn. 100 µg/l 200 µg/l 300 µg/l C 2,19 g 1,29 g + 1,94 g = 3,23 g 2,12 g + 1,39 g = 3,51 g A 2,49 g 1,37 g + 2,12 g = 3,49 g 2,10 g + 1,66 g = 3,76 g 158