Diss. ETH No. 20080 Turbulent Flow Online Extraction Coupled to LC-MS: Applications for Identification and Quantification of Drugs and their Metabolites A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Daniel Michael Müller MSc, ETH Zurich born November 24, 1984 citizen of Zürich (ZH) and Basel (BS), Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Karl-Heinz Altmann, examiner Prof. Dr. Katharina M. Rentsch, co-examiner Prof. Dr. Arnold von Eckardstein, co-examiner Prof. Dr. Renato Zenobi, co-examiner 2012
Summary In recent years, automation of processes became more and more important in LC-MS analysis in clinical laboratories. There are two important reasons for this development: (a), optimization of the processes, and (b), improvement of patient safety because of the reduced risk of human errors. In LC-MS analysis of biological samples, sample preparation is usually the most time-consuming step, even though it is much less complicated than for GC-MS. Therefore, automation for LC-MS processes should be started by automation of the extraction. For the most efficient automation, an online coupling of the extraction process to the LC-MS system should be able. Turbulent flow chromatography, a recently developed online extraction technique, fulfilled this prerequisite. Compared to online-coupled solid phase extraction, a technique that is used more frequently in therapeutic drug monitoring (TDM) and the clinical and forensic toxicological field, the system needs less maintenance and is less prone to mechanical failures, which makes it very attractive. The first aim of this project was the development and validation of a method using online extraction with turbulent flow chromatography for the TDM of two frequently used immunosuppressants, everolimus and sirolimus. With the automation, the throughput of the method was increased significantly compared to an existing method. On the contrary, the complexity of the method was decreased, increasing also the total robustness of the method. As second main part of the project, an automated toxicological screening system using online extraction with turbulent flow chromatography was developed and thoroughly validated, including method comparisons using real patient samples. The screening system was adequate for the toxiclogical screening of urine, serum and heparinized plasma samples, circumventing extensive manual sample preparation steps due to the online extraction. Using only 600 µl of urine or 100 µl of heparinized plasma or serum, the system was able to detect more than 700 substances, including metabolites. For a specific identification, MS 2 and MS 3 spectra as well as the retention time were taken as identification criteria. In serum and heparinized plasma, about 80 % of the substances, for which a therapeutic range could be found in the literature, could be identified with a limit of identification below the lower limit of the therapeutic range. The turn-around time until the reporting of the results was about 2 hours for urine samples and 45 min for serum or heparinized plasma samples after arrival of the samples in the laboratory. This was substantially faster than for the previously used GC-MS method. To answer the question, which matrix should be selected for toxicological screening purposes, 6
a patient sample comparison between urine and heparinized plasma samples was performed. In the sample pairs having different compounds identified in the two matrices, it could clearly be demonstrated that plasma better reflected the current exposure to drugs whereas urine has a longer detection window and therefore allowed the detection of compounds being no more present in the systemic circulation. The metabolism of new designer drugs entering the black market in fast pace is often unknown. However, knowledge of the metabolites is important in order to make the designer drugs detectable in toxicological screening approaches, or to study the contributions of the metabolites to the pharmacological or toxic effects of the parent compound. Therefore, an automated online metabolism method using human liver microsomes was developed. It was compared to an established offline approach and shown to give very comparable findings. Furthermore, as an example, the metabolism of 11 cathinones, a new type of designer drugs, was studied. In conclusion, two analytical methods, one for TDM of everolimus and sirolimus, and the other for a fully automated toxicological screening procedure for over 700 compounds, have been developed and fully validated. Both methods proved to be robust, increased the throughput of samples and optimized the respective workflows. Heparinized plasma should be used as matrix for a toxicological screening in acute situations, whereas urine is superior in the detection of compounds being no more present in the systemic circulation. The online metabolism method allowed an easy approach to study the metabolism of drugs or drugs of abuse using human liver microsomes. 7
Zusammenfassung Prozessautomatisierung wurde im medizinischen Labor in den letzten Jahren immer wichtiger und hat auch vor der LC-MS nicht Halt gemacht. Dafür gibt es zwei Hauptgründe: Einerseits können Prozesse dank Automatisierung optimiert werden. Andererseits kann die Patientensicherheit erhöht werden, da Fehler, die durch die manuelle Probenhandhabung entstehen können, eliminiert werden. Der zeitaufwändigste Schritt bei der Analyse von biologischen Proben mittels LC-MS, wenn auch nicht ganz so aufwändig wie bei GC-MS, ist die Probenvorbereitung. Deshalb ist eine Automatisierung der Extraktion am vielversprechendsten. Für eine möglichst effiziente Automatisierung sollte die Extraktion online an das LC-MS System gekoppelt werden können, was bei der Chromatographie mit turbulenter Strömung als Extraktionstechnik möglich ist. Verglichen mit online-gekoppelter Festphasenextraktion, einer Technik, die für Therapeutic Drug Monitoring (TDM) und klinisch- sowie forensischtoxikologische Abklärungen häufiger eingesetzt wird, ist Chromatographie mit turbulenter Strömung weniger wartungsintensiv und auch weniger anfällig für mechanische Fehlfunktionen, was das System sehr attraktiv macht. Für diese Arbeit sollte als erstes Ziel eine TDM-Methode für zwei häufig gebrauchte Immunsuppressiva, Everolimus und Sirolimus, entwickelt und validiert werden, welche als Online- Extraktion auf Chromatographie mit turbulenter Strömung basierte. Verglichen mit der alten Methode konnte der Probendurchsatz dank der Automatisierung massiv erhöht werden; ausserdem konnte die Komplexität der Methode verringert werden, was zu einer Verbesserung der Robustheit der Methode führte. Als zweites Hauptziel dieser Arbeit sollte eine automatisierte und auf Online-Extraktion mittels Chromatographie mit turbulenter Strömung basierende toxikologische Screening- Methode entwickelt und detailliert validiert werden, was auch Methodenvergleiche mit Patientenproben beinhaltete. Die Eignung der Screening-Methode für Urin, Serum und Heparinplasma konnte gezeigt werden, und aufgrund der Online-Extraktion konnte auf eine aufwändige manuelle Probenvorbereitung verzichtet werden. Mit der Methode konnten in nur 600 µl Urin oder 100 µl Serum oder Heparinplasma mehr als 700 verschiedene Medikamente, Drogen und deren Metaboliten nachgewiesen werden. Für eine spezifische Identifikation der Substanzen wurden sowohl MS 2 - und MS 3 -Spektren als auch die Retentionszeiten verwendet. In Serum und Heparinplasma lag die Identifizierungsgrenze für ca. 80 % der Substanzen, für welche ein therapeutischer Bereich in der Literatur gefunden werden konnte, 8
unterhalb des therapeutischen Bereiches. Die Zeit zwischen Probeneingang im Labor und Befundung konnte auf ca. 2 Stunden für Urin und ca. 45 Minuten für Serum oder Heparinplasma gesenkt werden, was sehr viel schneller als die vorher benutzte GC-MS Methode war. Um die Frage zu beantworten, welche Matrix für toxikologische Suchanalytik benutzt werden sollte, wurde ein Patientenprobenvergleich zwischen Urin und Heparinplasma durchgeführt. In denjenigen Probenpaaren, in denen in den zwei Matrices unterschiedliche Substanzen identifiziert werden konnten, konnte klar gezeigt werden, dass Plasma besser Aufschluss über die gegenwärtige Exposition gegenüber Medikamenten und Drogen gab, wohingegen Urin längere Detektionsfenster aufwies und deshalb die Identifikation von Substanzen erlaubte, die sich nicht mehr in der systemischen Zirkulation befanden. Der Metabolismus von neuen Designer-Drogen, welche in immer schnellerem Takt auf den Schwarzmarkt geworfen werden, ist häufig unbekannt. Forschung über den Metabolismus dieser Substanzen ist allerdings wichtig. Einerseits wird der Nachweis von Metaboliten der entsprechenden Substanzen in der toxikologischen Suchanalytik ermöglicht, andererseits kann bei bekanntem Metabolismus eine allfällige pharmakologische Aktivität oder ein allflälliger Beitrag des Metaboliten zur Toxizität der Muttersubstanz erforscht werden. Für Metabolismus-Studien mit humanen Lebermikrosomen wurde deshalb eine automatische Online-Methode entwickelt, welche mit einer etablierten Offline-Methode verglichen wurde. Die Resultate zeigten eine sehr gute Übereinstimmung. Als Beispiel wurde der Metabolismus von 11 Cathinonen, einer neuen Klasse von Designer-Drogen, untersucht. Zusammenfassend wurden zwei analytische Methoden entwickelt und validiert einerseits eine TDM-Methode für Everolimus und Sirolimus und andererseits eine vollautomatische toxikologische Screeningmethode für mehr als 700 Substanzen. Für beide Methoden konnte gezeigt werden, dass sie robust sind, den Probendurchsatz erhöhen und die jeweiligen Arbeitsprozesse optimieren konnten. Für toxikologische Suchanalytik in akuten Fällen sollte Heparinplasma verwendet werden, wohingegen Urin für den Nachweis von Substanzen, die nicht mehr in der systemischen Zirkulation präsent sind, verwendet werden sollte. Die online Metabolismus-Methode erlaubte es, Metabolismus-Studien von Medikamenten oder Drogen mit humanen Leberzellmikrosomen schnell und einfach durchzuführen. 9