Funktionelle Organisation des Zellkerns: DNA-Methylierung in Drosophila 01.-04.03.04 Joachim Marhold, Regine Garcia Boy, Natascha Kunert, Cora Mund, Frank Lyko Programm 01.03.04: Präparation genomischer DNA aus Drosophila-Embryos Agarose-Gel Seminar: Drosophila-Entwicklung 02.03.04: slot blot Seminar: Epigenetik 03.03.04: Embryos fixieren Inkubation mit prim. Antikörper Seminar: DNA-Methylierung 04.03.04: Inkubation mit sek. Antikörper Einbetten der Präparate Abschlußbesprechung 05.03.04: Analyse der Präparate am konfokalen Mikroskop (H. Spring) 1
1. Präparation genomischer DNA aus Drosophila-Embryonen Intakte genomische DNA wird durch enzymatischen Verdau isolierter Zellkerne gewonnen. Die DNA wird anschließend durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt. RNA wird durch RNAse-Verdau entfernt. Zur Vorbereitung werden die Embryonen durch PBST mit Hilfe eines Pinsels von den Apfelsaftagarplatten abgelöst. Abgelöste Embryonen mit PBS in Sieb geben. Die Embryonen werden im Sieb mit 50 ml PBST gewaschen. Abschließend wird das Filter mit 1 ml PBS abgespült und die Embryonen dabei in den Homogenisator überführt. -Embryonen durch 10 Schübe mit dem Homogenisator auf Eis homogenisieren -Homogenisat in ein Reaktionsgefäß abgießen und 10 min auf Eis stehen lassen -800 µl des Überstands VORSICHTIG mit der Pipette von oben nach unten abziehen und in ein frisches Reaktionsgefäß geben -Reaktionsgefäß 5 min bei 8000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugieren -Überstand vollständig abnehmen und verwerfen, Pellet in 440 µl Lysepuffer resuspendieren -10 µl Proteinase K (5 mg/ml) zugeben, vortexen -50 µl 10 % SDS zugeben, vortexen -1 h Inkubation bei 37 C im Schüttelinkubator -Zugabe von 500 µl Phenol -1 min zentrifugieren bei 13.000 rpm -Überstand VORSICHTIG abnehmen, in ein frisches Reaktionsgefäß geben -Zugabe von 500 µl Phenol/Chloroform (1:1) -1 min zentrifugieren bei 13.000 rpm -Überstand abnehmen, in ein frisches Reaktionsgefäß geben -Zugabe von 500 µl Chloroform -1 min zentrifugieren bei 13.000 rpm -Überstand abnehmen, in ein frisches Reaktionsgefäß geben -Zugabe von 15 µl 5 M NaCl -Zugabe von 1 ml 100 % Ethanol -Reaktionsgefäß vorsichtig schwenken, dabei fällt die DNA aus -DNA mit einer sauberen Pinzette aufnehmen und in ein frisches Reaktionsgefäß überführen -DNA trocknen (5 min bei Raumtemperatur) und in 30 µl TE Puffer lösen -15 min bei 37 C inkubieren -25 µl der DNA-Lösung in ein frisches Reaktionsgefäß überführen, 5 µl in einem frischen, beschrifteten Reaktionsgefäß im Kühlschrank aufbewahren (PROBE 1) 2
-5 µl RNAse zu den 25 µl DNA-Lösung zugeben -1 h bei 37 C inkubieren -3 µl 3 M Kaliumacetat zugeben -75 µl 100 % Ethanol zugeben -5 min zentrifugieren bei 13.000 rpm -Überstand vorsichtig mit der Pipette abnehmen -zum Pellet 500 µl 70 % Ethanol geben, vortexen -Reaktionsgefäß 3 min bei 13.000 rpm zentrifugieren -Überstand mit der Pipette abnehmen -Reaktionsgefäß 3 min bei 13.000 rpm zentrifugieren -Flüssigkeit vollständig mit der 20 µl-pipette abnehmen -Pellet in 20 µl TE-Puffer lösen -15 min bei 37 C inkubieren -beschriftetes Reaktionsgefäß im Kühlschrank aufbewahren (PROBE 2) Lysepuffer 10 mm Tris-HCl ph 7,5 60 mm NaCl 10 mm EDTA 2. Elektrophoretische Auftrennung von DNA im Agarose-Gel Die präparierte genomische DNA wird durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Dabei werden DNA-Moleküle gemäß ihrer Größe aufgetrennt (Molekularsiebeffekt). Die DNA wird durch den Interkalationsfarbstoff Ethidiumbromid mittels UV-Licht sichtbar gemacht. -0,5 g Agarose wird durch Kochen in 100 ml TAE gelöst. -Nach 10 min Abkühlen unter gelegentlichem Schwenken wird der Agaroselösung 5 µl Ethidiumbromid zugegeben -Die Agaroselösung mit Ethidiumbromid wird in einen abgedichteten Gelschlitten (mit Kamm) gegossen -Nach Verfestigung des Gels (ca. 30 min) wird die Abdichtung entfernt, der Schlitten in die Gelapparatur eingesetzt und das Gel mit TAE überschichtet. Anschließend wird der Kamm gezogen -6 µl Molekulargewichtsmarker auf das Gel auftragen, danach PROBE 1 und 5 µl von PROBE 2 jeweils mit 1 µl 6x Probenpuffer versetzen und ebenfalls auf das Gel 3
auftragen -Die Auftrennung erfolgt über 45 min bei 60 V Spannung, danach Gel unter UV-Licht betrachten (Foto) und Konzentration abschätzen (Betreuer fragen) TAE 40 mm Tris-Acetat ph 7.8 1 mm EDTA 3. Immunologischer Nachweis von DNA-Methylierung durch slot blot Die Methylierungsgrad der präparierten genomischen DNA wird durch Antikörperfärbung untersucht. Dazu wird ein Antikörper verwendet, der spezifisch gegen 5-methyl-Cytosin gerichtet ist. Als Kontrollen werden DNA-Präparationen aus Kalbsthymus und Hefe mit untersucht. Denaturieren der DNA Probe:?? µl (1 µg) H 2 O: ad 52 µl 1 M NaOH: 40 µl 0.5 M EDTA: 8 µl Bei 99 C 10 min lang im Thermomixer schütteln. Danach Zugabe von 100 µl kalter 2M Ammoniumacetatlösung zur Neutralisierung Slot Blot -Nitrocellulosemembran nach Vorlage zurechtschneiden, 3 x Filterpapier zurechtschneiden. Alles in 6x SSC befeuchten. Alle nicht benötigten Slots mit Tesafilm abkleben. Slot Blot Apparatur zusammenbauen (3x Filter, Membran), Schrauben festziehen, Vakuum anlegen, Schrauben nochmals nachziehen. -Benötigte Slots mit je 500 µl 1xTE waschen (aufpipettieren, mit Vakuum durchsaugen). Proben auftragen und durchsaugen, Slots mit 500 µl 2x SSC waschen. -Membran aus der Apparatur ausbauen und in 2x SSC kurz waschen, anschließend an der Luft trocknen lassen. In UV-Stratalinker crosslinken (Einstellung Auto ). -100 ml einer 5% igen Milchpulver in TBST-Lösung herstellen, 10 ml abnehmen und aufheben(für Inkubation mit primärem Antikörper, Membran in restlicher Milchpulverlösung 1 Stunde lang blocken. 4
Inkubation mit primärem Antikörper: 10 µl anti-5-methyl-cytosin (Host: rabbit) in 10 ml Milchpulverlösung (Verdünnung: 1:1000). Membran in Prospekthülle legen, Hülle an drei Seiten zuschweißen, Antikörperlösung zugeben, glattstreichen bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Vierte Seite zuschweißen, Hülle entweder 1 Stunde lang bei RT schaukeln oder über Nacht im Kühlschrank. Inkubation mit sekundärem Antikörper -Membran aus Prospekthülle herausschneiden, 3x 20 min mit TBST waschen. Herstellung von 40 ml 5%iger Milchpulver/TBST-Lösung. -Zugabe des sekundären Antikörpers: 4 µl peroxidase-conjugated Affini-Pure Goat Anti- Rabbit IgG H&L in 40 ml Milchpulver/TBST (Verdünnung 1:10.000) -30 min bei RT schaukeln. 3x 5 min in TBST waschen, dann Membran abtropfen lassen. ECL-Reaktion -1 ml Detergent 1 und 1 ml Detergent 2 gut mischen, Membran damit beträufeln (möglichst so, daß Membran vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist). 1 min inkubieren, auf Papiertuch trocknen, in Prospekthülle legen -In Dunkelkammer Film 1-5 min auf Membran in Hülle legen, fixieren und entwickeln. TBST 8,8 g NaCl 10 ml Tris-HCl ph 7,8 500 µl Tween-20 Aqua bidest. ad 1000 ml 4. Nachweis von DNA-Methylierung durch Immunfluoreszenzfärbung von Embryonen Die Methylierung der genomischen Drosophila-DNA soll nun durch Immunfärbung von Embryonen direkt nachgewiesen werden. Dazu wird eine Doppel-Immunfärbung mit Antikörpern gegen 5-methyl-Cytosi und DNA durchgeführt. Anschließend werden die Präparate mikroskopisch analysiert. 5
1. Die Embryonen (ca. 5g) werden über Nacht (ca. 0-18h) auf Eiablageplatten gesammelt. 2. Anschließend werden die Embryonen mit Hilfe eines Systems verschiedener Siebe mit Wasser gewaschen und gesammelt. Es muss hier darauf geachtet werden, möglichst keine Hefe von der Platte zu waschen, da diese später nicht mehr zu entfernen ist. 3. Mit einem Pinsel werden die Embryonen in ein spezielles Greiner- (15 ml) Röhrchen überführt, in dessen Verschluss ein Sieb eingelassen ist. 4. Die Dechorionisierung erfolgt durch Zugabe für ca. 2 min einer 1:1 mit Wasser verdünnten Chlorbleiche. Es wird anschließend sofort mit viel Wasser gespült, bis die Embryonen beginnen an der Wand des Greiner-Röhrchens festzukleben. Hierzu wird mit Hilfe einer Wasserspritzflasche zügig Wasser durch das Sieb im Verschluss in das Röhrchen mit den Embryonen gespritzt und mit Hilfe einer Saugstrahlpumpe sofort wieder heraus gesaugt. Die Spülung wird solange fortgesetzt bis der Chlorgeruch verschwunden ist. 5. Nun wird eine Mischung aus 6 ml Heptan und 6 ml 4 % Paraformaldehyd zugegeben und die Embryonen für 15 min im Röhrchen auf einem Überkopfschüttler inkubiert. 6. Anschließend wird die untere Phase der Mischung mit einer Pasteurpipette vorsichtig entfernt. 7. Es wird 6 ml der Fixierlösung 2 (siehe unten) zugegeben und wieder für 15 min auf dem Überkopfschüttler inkubiert. 8. Es erfolgt ein dreimaliges Waschen mit 1x PBS für je 5 min. 9. Nach Zugabe von 6 ml -20 C gekühlten Methanols werden die Embryonen für 3 min gründlich gevortext. 10. Die Embryonen, welche zu Boden sinken, werden für die weitere Präparation verwendet. 11. Die obere Phase wird komplett entfernt. 12. Es wird nochmals Methanol zugegeben und die Embryonen für 1 h auf Eis inkubiert. 13. Anschließend wird das Methanol entfernt und 100 % Ethanol zugegeben. (Die Embryonen können so bei -20 C aufbewahrt werden). 14. Die Embryonen werden über eine Ethanol : TPBS Reihe rehydriert: (je 5 min 70 % Ethanol : TPBS (1xPBS+0,5 % Triton X-100); 50 % Ethanol : TPBS; 30 % Ethanol : TPBS; 100 % TPBS). 15. Es schliessen sich zwei Waschritte je 5 min mit 1x PBS an. 16. Die Embryonen werden für 2 h in 2 N HCl/PBS auf dem Überkopfschüttler inkubiert (die DNA wird hierdurch depuriniert, so daß der Antikörper binden kann). 17. Es schliessen sich drei Waschritte je 5 min mit 1x PBS an. 18. Anschließend werden die Embryonen in Block-Puffer (25 % normal goat serum in PBST [1x PBS, 0,1 % Tween 20]) für 1 h, RT inkubiert. 6
19. Die Embryonen werden mit dem primären Antikörper (1: 200) über Nacht bei 4 C in Inkubationspuffer (3 % normal goat serum, 3 % BSA in PBST) inkubiert. 20. Es wird anschließend dreimal mit Inkubationspuffer, je 20 min, RT, gewaschen. 21. Anschließend wird der sekundäre Antikörper in Inkubationspuffer für 2 h, RT, Dunkelheit, zugegeben. 22. Es schliessen sich die folgenden Waschschritte an: ein mal 5 min, RT, in PBST und zweimal 5 min in 1x PBS. 23. Die Embryonen werden in Vectashield oder slow antifade (Protokoll beachten) abschließend auf einem Objektträger präpariert und mit einem Deckglas versehen. Das Deckglas wird mit Nagellack versiegelt. Diese Präparate sind nur kurze Zeit im Dunkeln bei 4 C haltbar. 24. Die Präparate werden mit Hilfe eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops in verschieden Ebenen gescannt und analysiert. Fixierlösung 2 4% Paraformaldehyd 0,1% TritonX-100 0,1% Natriumdesoxycholat 7