GEBRAUCHSANWEISUNG GEBRAUCHSFERTIGE PLATTENMEDIEN PA-257430.04 Rev.: April 2013 VERWENDUNGSZWECK Teilweise selektives Medium zur Isolierung und Differenzierung von Enterobacteriaceae und verschiedenen anderen gramnegativen Stäbchen sowie zur Identifizierung von E. coli in Urinund anderen klinischen Proben. PRINCIPLES AND EXPLANATION OF THE PROCEDURE Mikrobiologische Methode. (Galle-Chrysoidin-Glyzerin-Agar mit MUG) ist ein partiell selektives Differenzierungsmedium, das ungefähr das gleiche Spektrum erfasst wie MacConkey Agar, das aber aufgrund mehrerer biochemischer Reaktionen die morphologische und farbliche Unterscheidung einer größeren Vielfalt von Kolonien gestattet. Peptone und Hefeextrakt sind Nährstoffe. Ochsengalle ist ein Selektivbestandteil, der grampositive Bakterien außer Enterokokken hemmt. Thiosulfat bildet mit Ammoniumeisencitrat das Indikatorsystem für die Schwefelwasserstoffbildung (Schwarzfärbung der Kolonien). Bromthymolblau ist ein ph-indikator. Bei Verwertung von Glycerol erfolgt Säurebildung (Gelbfärbung des Mediums); bei Verwertung von Harnstoff durch Urease erfolgt Alkalisierung (Grün- bis Blaugrünfärbung). Der Zusatz von MUG erlaubt bei Betrachtung unter UV Licht (360-370 nm) den Nachweis von ß-Glucuronidase, ein Enzym, das v.a. für Escherichia coli charakteristisch ist. REAGENTS Zusammensetzung* pro Liter destilliertem Wasser Peptone 12,0 g Hefeextrakt 5,0 g Natriumchlorid 5,0 g Ochsengalle 8,0 g Natriumthiosulfat 1,0 g Bromthymolblau 0,12 g Ammoniumeisen(III)-citrat 2,0 g Harnstoff 1,0 g Glycerol 20,0 ml Chrysoidin 12,5 mg 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid (= 0,1 g MUG) Agar 14,0 g ph 7,5 ± 0,3 *Nach Bedarf abgestimmt und/oder ergänzt auf die geforderten Testkriterien. VORSICHTSMASSNAHMEN. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. Agarplatten bei Anzeichen von mikrobieller Kontamination, Verfärbung, Austrocknung, Rissen oder sonstigen Anzeichen von Produktverfall nicht verwenden. Hinweise zur aseptischen Arbeitsweise, Biogefährdung und Entsorgung des Produkts sind der ALLGEMEINEN GEBRAUCHSANLEITUNG zu entnehmen. AUFBEWAHRUNG UND HALTBARKEIT Nach Erhalt Platten bis unmittelbar vor dem Gebrauch im Dunkeln bei 2 8 C in der Originalverpackung lagern. Einfrieren und Überhitzen vermeiden. Die Platten können bis zum PA-257430.04 Seite 1 von 5
Verfallsdatum (s. Kennzeichnung auf der Verpackung) inokuliert und entsprechend den empfohlenen Inkubationszeiten inkubiert werden. Platten aus bereits geöffneten Stapeln mit jeweils 10 Platten können bei Lagerung in einem sauberen Bereich bei 2 8 C bis zu einer Woche verwendet werden. QUALITÄTSSICHERUNG DURCH DEN ANWENDER Repräsentative Proben mit den nachfolgend aufgeführten Stämmen inokulieren (detaillierte Informationen siehe ALLGEMEINE GEBRAUCHSANLEITUNG). Platten bei 35-37 C in einer aeroben Atmosphäre inkubieren. Stämme Escherichia coli ATCC 25922 Citrobacter freundii ATCC 8090 Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella Typhimurium ATCC 13311 Shigella flexneri ATCC 12022 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Unbeimpft Wachstum Gelblich-grünliche, gelegentlich orange bis bräunliche Kolonien, Fluoreszenz unter UV (ß-Glucuronidase positiv); Medium grün Gelbe Kolonien, teilweise mit schwarzem Zentrum, Medium gelblich bis grün Gelblich-grüne Kolonien, meist mit schwarzem Zentrum; Schwärmen inhibiert oder stark reduziert; Medium grün Gelblich-grüne Kolonien, meist mit schwarzem Zentrum; Medium grün Grüne bis blaugrüne Kolonien; Medium grün Grüne bis blaugrüne Kolonien Medium dunkelgrün Kleine gelbe Kolonien; Medium gelb Klar, grün VERFAHREN Mitgeliefertes Arbeitsmaterial BD Bile Chrysoidin Glycerol Agar with MUG (90 mm Stacker-Platten). Mikrobiologisch kontrolliert. Nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial Zusätzliche Kulturmedien, Reagenzien und Laborgeräte nach Bedarf. Probenarten und Probenentnahme Dieses Medium kann für alle klinische und nichtklinische Materialien verwendet werden (siehe auch LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN). Bei Urinproben kann das Medium auch für quantitative Bestimmungen der Keimzahl von gramnegativen Bakterien verwendet werden. Für die Probenentnahme und den Transport der Proben gelten die üblichen Verfahren. Um alle im klinischen Material vorhandenen pathogenen Bakterien und evt. die Normalflora zu erfassen, muss die Probe gleichzeitig auf einem nichtselektiven Optimalmedium, z.b. BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood sowie evt. auf anderen Selektivmedien ausgestrichen werden. Testverfahren Das Medium wird fraktioniert beimpft. Bei Urin kann ein definiertes Volumen oder eine Verdünnung der Probe mittels Drigalskispatel über die gesamte Oberfläche verteilt werden. Die beimpften Platten werden 18-24 h lang bei 35 37 C aerob bebrütet. Ergebnisse Häufig isolierte Bakterienarten weisen auf BD Bile Chrysoidin Glycerol Agar with MUG die folgenden Wachstumscharakteristika auf: Organismus Wachstum E. coli Gelb bis gelbgrün; Fluoreszenz unter UV-Licht Citrobacter freundii Gelb, oft mit schwarzem Zentrum PA-257430.04 Seite 2 von 5
Proteus mirabilis Gelblich bis grüngelb, oft mit schwarzem Zentrum, Schwärmen reduziert oder gehemmt Salmonella spp. Gelb bis gelbgrün, oft mit schwarzem Zentrum oder gesamte Kolonie schwarz Klebsiella spp. Gelb Enterobacter spp. Gelb bis gelbgrün Shigella spp. Grün bis blaugrün, selten gelblich. Stämme von S. sonnei können unter UV-Licht fluoreszieren. Pseudomonas aeruginosa Dunkelgrün bis blaugrün Enterococcus spp. Klein, gelb Staphylococcus spp. Schwaches Wachstum oder vollständig gehemmt Die meisten Enterobacteriaceae bilden mittelgroße bis große Kolonien. Von den isolierten Stämmen müssen (mit Ausnahme von E. coli) weitere Tests zur vollständigen Identifizierung durchgeführt werden. LEISTUNGSMERKMALE UND VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN eignet sich zur Isolierung und vorläufigen Differenzierung von gramnegativen Stäbchen wie Enterobacteriaceae sowie verschiedenen Nonfermentern, z. B. Pseudomonas aeruginosa. Der Zusatz von MUG erlaubt bei Betrachtung der Platte nach Bebrütung unter UV-Licht ( = 360-370 nm) den Nachweis von Escherichia coli mittels Fluoreszenz der Kolonien. Seltene Stämme von E. coli sind jedoch MUG-negativ und fluoreszieren nicht. Shigella sonnei kann wie E. coli fluoreszierende Kolonien bilden. Auch Enterokokken können auf dem Medium wachsen. Staphylokokken werden meist gehemmt, können aber durchwachsen. Zur endgültigen Identifizierung anderer Isolate als E. coli müssen weitere biochemische und evt. serologische Tests durchgeführt werden. Manche Stämme von Hafnia alvei und Enterococcus spp. zeigen auf diesem Medium reduziertes Wachstum. In internen Studien wurde festgestellt, dass dies auch auf dem Mitbewerber-Medium der Fall ist und deshalb keine Schwäche des BD Bile Chrysoidin Glycerol Agar mit MUG ist. Leistungsüberprüfungen Bei der internen Validierung wurden mindestens 3 Chargen des Mediums mit Stämmen der nachfolgenden Spezies getestet: Acinetobacter anitratus Proteus mirabilis Acinetobacter lwoffi Proteus vulgaris Cedecea davisiae Providencia alcalifaciens Citrobacter freundii Pseudomonas aeruginosa Citrobacter koseri (diversus) Pseudomonas putida Enterobacter aerogenes Salmonella Arizonae Enterobacter cloacae Salmonella Enteritidis Enterobacter sakazakii Salmonella Typhimurium Escherichia coli Serratia marcescens Escherichia coli, lactose-negativ Shigella flexneri Hafnia alvei Shigella sonnei Klebsiella pneumoniae Yersinia enterocolitica Morganella morganii Enterococcus faecalis Pantoea agglomerans Staphylococcus aureus Alle gramnegativen Bakterien und Enterococcus faecalis zeigten Wachstum in den erwarteten Farben. Staphylococcus aureus wurde partiell oder vollständig gehemmt. Außerdem wurden zwei externe Leistungsüberprüfungen durchgeführt. In diesen wurde das von BD hergestellte Medium (=Testmedium) mit dem hauseigenen Galle-Chrysoidin-Glycerol-Agar PA-257430.04 Seite 3 von 5
mit MUG (=Referenzmedium; entweder selbst hergestellt oder von einem anderen Hersteller) verglichen. Die Isolate vom hauseigenen Medium wurden vollständig biochemisch identifiziert. In der ersten Studie wurden 157 klinische Materialien (104 Urine, 19 Wundabstriche, 12 Blutkulturen, 18 Bronchialsekrete, und je ein Eiter, Ohrabstrich, Abszess und Vaginalabstrich) untersucht. Es wurden 169 Stämme auf dem Testmedium und auf dem Referenzmedium isoliert (Tabelle 1). Die Isolierungen waren auf beiden Medien identisch oder vergleichbar. In keinem Fall wurden Stämme nur auf einem der beiden Medien gefunden. Bei den E. coli-stämmen wurden auf beiden Medien drei MUG-negative Stämme isoliert, die somit auch keine Fluoreszenz ergaben. In der zweiten Studie wurden 103 klinische Materialien (11 Trachealsekrete, 10 Sputen, 15 Bronchialsekrete oder lavagen, 32 Wundabstriche, 4 Ohrabstriche, 2 Punktate, 2 Hautabstriche und 27 Urine) auf dem Test- und dem Referenzmedium ausgestrichen. Auch in dieser Studie wurden alle Isolate auf beiden Medien nachgewiesen und ihr Erscheinungsbild war auf beiden identisch oder vergleichbar. Außerdem wurden 10 bekannt positive Proben auf dem Test- und dem Referenzmedium subkultiviert. Von den 103 klinischen Materialien erfolgte bei 55 Proben kein Wachstum auf dem Test- und dem Referenzmedium. Aus den positiven Proben wurden 75 Stämme isoliert (Tabelle 1). Damit ergibt sich beim Vergleich des Testmediums mit dem Referenzmedium bei beiden Studien kein Unterschied, weder in der Sensitivität noch im Erscheinungsbild der einzelnen Spezies (spezifische Daten sind archiviert). Tabelle 1: Auf dem Testmedium in zwei externen Leistungsüberprüfungen isolierte Arten Spezies Studie 1* Studie 2* Acinetobacter baumannii 0 1 Aspergillus niger 0 1 Citrobacter freundii 2 1 Citrobacter koseri 1 0 Enterobacter cloacae 9 0 Enterobacter cloacae 0 3 Enterococcus faecalis 0 3 Enterococcus faecium 0 4 Enterococcus sp. 1 7 Escherichia coli 97 21 Escherichia hermannii 1 0 Klebsiella oxytoca 3 3 Klebsiella pneumoniae 10 6 Morganella morganii 1 0 Proteus mirabilis 15 6 Proteus vulgaris 4 0 Providencia stuartii 0 1 Pseudomonas aeruginosa 17 13 Salmonella Enteritidis 0 1 Serratia fonticola 0 1 Serratia marcescens 4 0 Staphylococcus sp. 0 3 Staphylococcus, koagulase-negativ 1 0 Stenotrophomonas maltophilia 2 0 Vibrio cholerae 1 0 * Zahlen geben die Anzahl der Isolate an. LITERATUR 1. Ziesché, K. et al. (1985) Der Galle-Chrysoidin-Glycerol (GCG)-Nährboden in seiner Anwendung zur Diagnostik gramnegativer aerober Bakterien, besonders der Enterobacteriaceae. Zeitschr. Gesamte Hygiene 31: 516- PA-257430.04 Seite 4 von 5
LIEFERBARE PRODUKTE Art.-Nr. 257430 Gebrauchsfertige Plattenmedien, 120 Platten WEITERE INFORMATIONEN Weitere Informationen erhalten Sie bei Ihrer örtlichen BD-Vertretung. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-257430.04 Seite 5 von 5