H65TETH ex.# Diss. ETH No.: 12242 Expression of cytokines in infection with caprine arthritis encephalitis virus A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY, ZUERICH, SWITZERLAND for the degree of Doctor of Natural Science presented by Franziska Maria Lechner Dipl. Natw. ETH born March 16,1966 citizen of Winterthur, ZH, Switzerland Accepted on the recommendation of Prof. Dr. H. Hengartner, examiner Prof. Dr. E. Peterhans, co-examiner Prof. Dr. R. M. Zinkernagel, co-examiner 1997
1. Summary Caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) is a lentivirus related to the maedi visna virus and the feline (FIV), simian (SIV) and human (HIV) immunodeficiency viruses. CAEV is widespread in the goat population and transmitted via colostrum from mother to kid as well as horizontally. Infection of goats with CAEV does not cause immunodeficiency but leads to chronic inflammation of joints, lung, mammary gland and, in young animals, the brain. The progressive chronic inflammation is characterized by infiltrates of macrophages, T and B lymphocytes as well as increasing numbers of plasma cells. Because of its histopathological similarity, CAEV-induced arthritis serves as a model for human rheumatoid arthritis. Interestingly, in the joints of CAEV-infected goats, cells expressing viral RNA or proteins are not abundant until severe clinical arthritis has developed. The mechanisms maintaining the inflammation over years are poorly understood. We tested the hypothesis that dysregulation of cytokines may contribute to the pathogenesis of caprine arthritis. It is conceivable that CAEV directly alters the pattern of cytokine expression in the infected cell leading to enhanced cell recruitment and tissue inflammation. Macrophages, which are the major host cells in vivo, were infected in vitro with the molecular clone CAEV CO and cytokine expression was studied by RNA slot blot analysis. CAEV infection of macrophages led to enhanced expression of the two chemokines IL-8 and MCP-1 whereas the constitutive expression of TGF-pi was reduced compared to mock-infected control cells. Since the regulatory protein Tat of HIV was suggested to be involved in cytokine dysregulation as well as brain toxicity in HIV-infected patients, it was of interest to evaluate the role of CAEV Tat on the expression of cytokines. No statistically significant difference was found between cells infected with the wild type CAEV clone and cells infected with a CAEV clone lacking the tat gene, suggesting that Tat is not needed for the observed effects of CAEV on cytokine expression. Infection of macrophages also led to an altered pattern of cytokine expression in response to exogenous stimulation. For example, the stimulated expression of IL-12 p40, which is part of the regulatory cytokine IL-12 needed for the establishment of cell-mediated immunity, was severely reduced in CAEV-infected macrophages. These results show that CAEV directly modulates the expression of cytokines in the host cell and additionally primes for altered cytokine responses on exogenous stimulation which might affect the effector as well as accessory functions of these cells in vivo.
-5- In a second part of the study, an experimental model of CAEV-infection was set up. Goats were infected intravenously and intracarpally and various parameters such as viral load, joint swelling, seroconversion and histological appearance of the synovium were studied. Additionally, at different time points, the expression of viral RNA and cytokine mrna was examined in the carpal joints and draining lymph nodes by in situ hybridization. Twelve days post-infection, viral RNA was readily detected in synovial membranes but at later time-points, no or only very few cells expressing viral RNA were found in the joint even though the inflammation persisted. Viral RNA was again detected in goats with severe clinical arthritis. In analogy to human rheumatoid arthritis, the lymphocyte-derived cytokines IL-2 and IFNy were detected in a few cells only whereas MCP-1, IL-6 and TNFct were abundantly expressed both at early and late time points. IFNy always co-localized to areas containing viral RNA-expressing cells. mrna was found to be As mentioned above, infection of macrophages in vitro with CAEV led to increased expression of IL-8 and MCP- 1. No IL-8 transcripts were detected in caprine arthritis despite the presence in some cases of numerous virus-expressing cells. In contrast, MCP-1 mrna was consistently detected in regions containing virus-expressing cells, which suggests that this cytokine might be influenced by viral replication both in vitro and in vivo. A striking compartmentalization was found in the inflamed synovium at the level of cytokine expression. In certain regions of the synovium mononuclear cells failed to express detectable message for TNFa, IL-6 or MCP-1 whereas in other, histologically similar, regions the cells were found to express some or all of these cytokines, probably reflecting varying activation states of inflammatory cell aggregates. On the basis of the finding that INFy mrna and viral RNA were expressed in a restricted and co-localized fashion, we hypothesize that these areas may represent sites with an ongoing cell-mediated immune response against the virus. Plasma cell aggregates and lymphoid-like follicles may represent areas with an ongoing humoral immune response. Both types of response are found to coexist in the same arthritic joint. A consecutive shift from a predominantly cellular to a predominantly humoral imune response may occur in the synovium each time the virus becomes locally activated. The experimental short-term model of CAEV-infection described in this work could serve as a valuable tool for future studies on the role of cytokines as well as the immune response in the pathogenesis of caprine arthritis.
2. Zusammenfassung Das Caprine Arthritis Enzephalitis Virus (CAEV) gehort zum Genus Lentivirus der Retroviren. Zum gleichen Genus werden auch das Maedi Visna Virus (MW) und die Immunodefizienzviren der Katze (FIV), des Affen (SIV und des Menschen (HIV) gezshlt. Das CAE Virus ist weit verbreitet in der Ziegenpopulation und wird vor allem durch Kolostrum und Milch von der Mutter auf das Neugeborene tibertragen. Eine Infektion kann aber auch durch engen Kontakt mit infizierten Tieren zustande kommen. Im Gegensatz zu anderen Lentiviren verursacht CAEV keine Immunodefizienz, ftihrt aber zu einer persistierenden Infektion, die sich durch eine chronische Entziindung von Gelenken, Euter, Lunge und in selteneren Fallen des Hirns Sussern kann. Die Entzundungsherde zeigen Infiltrate von T- und B-Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen. Die Ziegenarthritis dient als Tiermodell fur Rheumatoide Arthritis (RA) des Menschen, da das histologische Erscheinungsbild der Ziegenarthritis demjenigen findet man vor dem Auftreten der klinischen Ziegenarthritis der RA sehr ahnlich ist. Interessanterweise nur sehr wenige infizierte Zellen im Gelenk. Deshalb wurde postuliert, dass immunpathologische Mechanismen bei der Entstehung der Ziegenarthritis eine Rolle spielen. Wir priiften die Hypothese, dass die CAEV-Infektion direkt oder indirekt zu einer Zytokindysregulation ftihrt und somit die Pathogenese beeinflusst. Zum Beispiel krjnnte CAEV die Zytokinexpression in der Wirtszelle modulieren, welches zu einer verstsrkten Entztindungsreaktion fuhren konnte. Makrophagen, die wichtigsten Wirtszellen in vivo, wurden in vitro mit einem molekularen CAEV Klon infiziert. Danach wurde die Expression von verschiedenen Zytokinen mittels RNA Slot Blot Analyse studiert Im Vergleich zu mock-infizierten Zellen zeigten infizierte Makrophagen eine erh6hte Expression erniedrigte Expression von TGF-pi. der Chemokine IL-8 und MCP-1 sowie eine Das HIV-codierte Regulatorprotein Tat kann, zumindest in vitro, die Zytokinexpression beeinflussen. Zudem ist dieses Protein moglicherweise beteiligt an der Pathogenese von Encephalopathien in AIDS Patienten. Wir untersuchten, ob ein CAEV Klon mit deletiertem tat Gen die Expression von Zytokinen in gleicher Weise beeinflusst wie das Wildtyp Virus. Zwischen den beiden Viren wurde kein statistisch signifikanter Unterschied gefunden, deshalb scheint das Tat Protein bei der beobachteten Zytokindysregulation in CAEVinfizierten Makrophagen keine Rolle zu spielen. CAEV-infizierte Makrophagen zeigten auch ein verandertes Zytokin-Expressionsmuster als Antwort auf exogene Stimulation.
Zum Beispiel war die stimulierte Expression von IL-12 p40 (eine Untereinheit des regulatorischen Zytokins IL-12, das fur eine zellvermittelte Immunantwort benotigt wird) drastisch reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass CAEV in vitro sowohl direkt, als auch indirekt (nach Stimulation) das Zytokin-Expressionsmuster seiner Wirtszelle moduliert, was die Funktion dieser Zellen sowie die Entstehung und Zellzusammensetzung von Entziindungsherden in vivo beeintrschtigen konnte. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein experimentelles Modell der CAEV-Infektion in Ziegen etabliert. Acht Tiere wurden intravenos und intracarpal mit CAEV infiziert. ZusStzlich wurden nattirlich infizierte Ziegen untersucht. Parameter wie Gelenkschwellung, Serokonversion, Virusmenge, histologische VerSnderungen und die Expression von Zytokinen und viraler RNA den Gelenken und Lymphknoten wurden untersucht. Obwohl die Gelenkentzttndung in experimentell infizierten Tieren kontinuierlich zunahm, konnte nach anfanglicher Virusvermehrung im spateren Verlauf der Krankheit mittels in situ Hybridisierung keine virale RNA mehr nachgewiesen werden. Nur in Gelenken von Tieren mit schwerer klinischer Arthritis wurden wieder infizierte Zellen gefunden. Aehnlich wie bei der Rheumatoiden Arthritis des Menschen exprimierten nur wenige Synovialzellen die Zytokine IL-2 oder IFNy, dagegen viele Zellen MCP-1, IL-6 und TNFa. Obwohl wir zeigen konnten, dass CAEV in vitro die Expression von IL-8 erhdht, konnte in vivo keine IL-8 mrna nachgewiesen werden. Dies war auch dann der Fall, wenn infizierte Zellen im Gelenk vorhanden waren. Hingegen wurde in Regionen, wo virale RNA detektiert wurde, immer auch MCP-1 mrna nachgewiesen. Dieses Zytokin wird deshalb mcjglicherweise sowohl in vitro als auch in vivo durch CAEV direkt induziert. Innerhalb der Synovialmembran ist die Expression von Zytokinen nicht uniform, sondern erfolgt je nach Kompartiment unterschiedlich. Wahrend in einigen mononukleare Infiltraten mrna von MCP-1, IL-6 und TNFa gefunden wurde, war in anderen, histologisch sehr ahnlichen, Infiltraten keines dieser Zytokine exprimiert. ZusStzlich wurde, unabhsngig von der Infektionsdauer, IFNy mrna hauptsachlich dort gefunden, wo auch virale RNA vorhanden war. Moglicherweise findet in diesen Regionen mit Coexpression von IFNy mrna und viraler RNA eine zellvermittelte antivirale Immunantwort statt. Im Gegensatz dazu findet wahrscheinlich in Regionen mit einem hohen Anteil an Plasmazellen und lymphoiden Follikeln eine humorale Immunantwort statt. Beide Typen von Immunantworten scheinen simultan, aber in verschiedenen Regionen des entziindeten Gelenkes, abzulaufen.
-8- Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ziegenarthritis nicht ohne weiteres als eine Thl- oder Th2-vermittelte Krankheiten bezeichnet werden kann. Wahrscheinlich wird, wenn das Virus neue Zellen infiziert oder in latent infizierten Zellen reaktiviert wird, zuerst lokal eine zellvermittelte (Thl oder ThO) und danach eine humorale (Th2) Immunantwort induziert. Dieser Mechanismus konnte die sukzessive Akkumulation von Plasmazellen im Gelenk erklaren. Das hier beschriebene Modell der experimentellen Infektion von Ziegen kann benutzt werden, um die Rolle der Immunantwort und der Zytokine in der Pathogenese der caprinen Arthritis im Detail zu studieren.