Arbeitsanleitung/Manual HPLC Kit Zur Bestimmung von in EDTA-Vollblut e HPLC Kit For the determination of e in EDTA-blood Gültig ab/valid from 02.03.2010 KC 1800 100 Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D 64625 Bensheim Tel.: ++49 6251 70190-0 Fax: ++ 49 6251 849430 e.mail: Info@immundiagnostik.com www.immundiagnostik.com
INHALTSVERZEICHNIS SEITE 1. VERWENDUNGSZWECK 3 2. EINLEITUNG 3 3. TESTPRINZIP 3 4. INHALT DER TESTPACKUNG 5 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL 5 6. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN 6 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN 6 8. PROBENVORBEREITUNG 7 9. TESTDURCHFÜHRUNG 7 HINWEISE 7 ARBEITSSCHEMA 8 CHROMATOGRAPHISCHE BEDINGUNGEN 9 10. BEHANDLUNG DER TRENNSÄULE 9 11. AUSWERTUNG 10 BERECHNUNG MUSTERCHROMATOGRAMM 10 11 12. EINSCHRÄNKUNGEN 12 13. QUALITÄTSKONTROLLE 12 NORMBEREICH KONTROLLEN 12 12 14. TESTCHARAKTERISTIKA 12 PRÄZISION UND REPRODUZIERBARKEIT 12 LINEARITÄT 13 NACHWEISGRENZE 13 15. ENTSORGUNG 13 16. MAßNAHMEN BEI STÖRUNGEN 13 17. LITERATUR 15 18. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST 15 1
1. INTENDED USE 17 2. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST 17 3. PRINCIPLE OF THE TEST 17 4. MATERIAL SUPPLIED 19 5. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 19 6. PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS 20 7. PRECAUTIONS 20 8. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION 20 9. ASSAY PROCEDURE 21 PROCEDURAL NOTES 21 SAMPLE AND STANDARD PREPARATION 22 CHROMATOGRAPHIC CONDITIONS 23 10. TREATMENT OF THE COLUMN 23 11. RESULTS 23 CALCULATION TYPICAL CHROMATOGRAM 23 24 12. LIMITATIONS 25 13. QUALITY CONTROL 25 EXPECTED VALUES CONTROLS 25 25 14. PERFORMANCE CHARACTERISTICS 26 PRECISION AND REPRODUCIBILITY 26 LINEARITY 26 DETECTION LIMIT 26 15. DISPOSAL 26 16. TROUBLESHOOTING 27 17. REFERENCES 28 18. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE 28 2
1. VERWENDUNGSZWECK Die HPLC-Applikation ist für die Bestimmung von aus EDTA-Vollblut geeignet. Nur zur in vitro Diagnostik. 2. EINLEITUNG (GSH) ist ein in biologischen Geweben ubiquitär vorkommendes Tripeptid, das Zellen vor oxidativen Prozessen schützt. Daneben übernimmt es wichtige Funktionen in verschiedenen Stoffwechselwegen, bei Aktivierung und Inhibition von Enzymen und Transportproteinen, sowie beim Transport von Aminosäuren. Vor allem trägt es zur Stabilisierung von Protein- und Nichtprotein- Sulfhydrylgruppen und zur Aufrechterhaltung eines reduzierenden intrazellulären Milieus bei. Veränderungen im status sind an der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen beteiligt : Reperfusionsschäden, Leberschäden, Tumoren, Diabetes mellitus, Katarakt, entzündlichen Erkrankungen, chronischem Lymphödem und Strahlenschäden. Auch Schäden durch Umweltnoxen, Zigarettenrauch, Arzneimittelnebenwirkungen und Alterungsprozesse können mit veränderten GSH- Spiegeln einhergehen. Der weitaus größte Teil des Gesamtglutathions liegt als reduziertes vor (in EDTA-Vollblut ca. 90 %), nur ein kleiner Teil in der oxidierten Form (GSSG). Das deutlich zugunsten von GSH ausgerichtete Gleichgewicht wird durch die NADPH-abhängige reduktase garantiert. Bei oxidativem Stress wird GSH für verschiedene Reaktionen des primären und sekundären antioxidativen Schutzes verbraucht. 3. TESTPRINZIP Die Bestimmung des s erfolgt auf 2 verschiedenen Weisen nach Zugabe einer Verdünnungslösung zur Probe. Zur Messung des reduzierten GSH wird einem Aliquot der verdünnten Probe ein Reaktionspuffer und Derivatisierungslösung zugegeben. Nach Mischen 3
und zwanzigminütiger Inkubation schließt sich ein Fällungsschritt zur Abtrennung höhermolekularer Bestandteile an. Das andere Probenaliquot wird analog aufgearbeitet, nur das anstelle des Reaktionspuffers eine Reduktionslösung und ein interner Standard zupipettiert werden. Dadurch findet eine Überführung des oxidierten s (GSSG) in reduziertes GSH statt, so daß in diesem Schritt das gesamte vorhandene erfaßt wird. In der Derivatisierungsreaktion wird das in ein fluoreszierendes Produkt umgesetzt. Die Trennung mittels HPLC erfolgt in einem isokratischen Verfahren bei 30 C auf einer "reversed phase" Säule in zwei Läufen hintereinander. Die Chromatogramme werden mit einem Fluoreszensdetektor aufgenommen. Die Trennung benötigt ca. 10 Minuten für einen Lauf. Die Quantifizierung erfolgt über den mitgelieferten EDTA Vollblut-Kalibrator und die Berechnung der Ergebnisse wird über die "interne Standard-Methode" anhand der Integration der Peakfläche durchgeführt. Die Messung des reduzierten s erfolgt ohne internen Standard, da ansonsten Mischsulfide gebildet werden. Durch Subtraktion GSH gesamt - GSH reduziert kann der Anteil an oxidiertem berechnet werden. Hinweis: Bitte berücksichtigen Sie, dass die ermittelte Differenz noch durch zwei dividiert werden muss, da oxidiertes bei der Reduktion in zwei GSH gespalten wird Zusammenfassung Der hier vorliegende Komplettkit zur Bestimmung des s ermöglicht eine einfache, schnelle und präzise quantitative Bestimmung. Dieser Komplettkit enthält gebrauchsfertig alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien für die Aufbereitung der Proben und die analytische HPLC- Trennung. Wie auch bei vielen anderen Parametern liegt der Vorteil der HPLC-Analytik in der gleichzeitigen Abarbeitung vieler Analyten in einem Test. Die HPLC- System-Komplettlösung ermöglicht auch Laboratorien, die bislang noch keine Erfahrung mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie haben, diese Technik schnell und problemlos für klinisch-chemische Routinezwecke einzusetzen. Für die Kalibrierung des Testsystems ist meist eine Einpunkt- Kalibrierung ausreichend, im Gegensatz zu Immunoassays von bis zu 6 4
Kalibratoren pro Testansatz. Eine Automatisierung der Probenaufgabe und der Auswertung ist möglich, sodaß auch größere Probenzahlen fast unbeaufsichtigt abgearbeitet werden können. (Bei kurzen Serienlängen ist die Einpunktkalibrierung sehr viel wirtschaftlicher gegenüber der 6-Punkt- Kalibrierung bei Immuno-Assays). 4. INHALT DER TESTPACKUNG Artikel Nr. Inhalt Kit Komponenten Menge KC1800LM MOPHA Laufmittel 1000 ml KC1800KA CAL Kalibrator (lyoph. 0,25 ml; Konzentration siehe Etikett) 8 Fläschchen KC1800IS INT STD Interner Standard 6 ml KC1800RE RECSOL Rekonstitutionslösung 5 ml KC1800RB REABUF Reaktionspuffer 27 ml KC1800VL DIL Verdünnungslösung 25 ml KC1800RL REDSOL Reduktionslösung (lyoph. 1,2 ml) 1 Fläschchen KC1800DL DER Derivatisierungslösung 12 ml KC1800FR PREC Fällungsreagenz 12 ml KC1800KO CTRL 1 CTRL 2 Kontrolle 1 und 2 (lyoph. 250 µl; Konzentration, siehe Produktspezifikation) 2 x 3 Fläschchen Die HPLC Trennsäule (KC 1800RP) kann separat bei Immundiagnostik bestellt werden. Neben den kompletten Kits können auch alle Komponenten einzeln bestellt werden. Bitte fordern Sie unsere Einzelkomponentenpreisliste an. 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL 1,5 ml Reaktionsgefäße (z.b. Eppendorf) Zentrifuge Wasserbad div. Pipetten HPLC Gerät mit Fluoreszens-Detektor reversed phase C 18 -Säule 5
6. VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Der Kalibrator (CAL) wird in 0,25 ml der mitgelieferten Rekonstitutionslösung (RECSOL) resuspendiert. Nicht verbrauchte Reste sind zu entsorgen, da erneutes Einfrieren den Kalibrator teilweise zerstört. Der Gehalt an ändert sich geringfügig von Charge zu Charge, der genaue Gehalt ist auf dem Etikett angegeben. Die Kontrollen (CTRL1, CTRL2) werden in 0,25 ml Rekonstitutionslösung (RECSOL) gelöst. Der genaue Gehalt ist der Produktspezifikation zu entnehmen. Die lyophilisierte Reduktionslösung (REDSOL) wird mit 1,2 ml Rekonstitutionslösung (RECSOL) versetzt und ist dann bei 2-8 C 3 Monate haltbar. Die Testreagenzien sind bei 2-8 C, der Kalibrator (CAL), der Interne Standard (INT STD) und die Kontrollen (CTRL) bei -20 C bis zum Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar. 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Kalibrator (CAL) und Kontrollen (CTRL1, CTRL2) sind auf Vollblut aufgebaut. Sie sind auf HIV und Hepatitis B getestet und für negativ befundet worden. Jedoch sollten die Testkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Das Fällungsreagenz (PREC) besteht aus Säure und muss mit Vorsicht behandelt werden. Sie verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muss die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden. Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden. 6
8. PROBENVORBEREITUNG Als Probe eignet sich EDTA-Vollblut, welches aus venösem Nüchternblut gewonnen wird. Da sehr oxidationsempfindlich ist, muss die Probe gekühlt versendet werden. Die Haltbarkeit der Probe beträgt bei 2-8 C 2 Tage, bei 20 C 14 Tage. Bei längerer Lagerung nimmt der Anteil des oxidierten zu. Das wird aus den Erythrozyten freigesetzt indem die Proben vor der Aufbereitung eingefroren werden. 9. TESTDURCHFÜHRUNG Hinweise Qualitätskontrollen sollten immer mitgemessen werden. Inkubationszeit, Temperatur und Pipettiervolumina sind vom Hersteller festgelegt. Jegliche Abweichung der Testvorschrift, die nicht mit dem Hersteller koordiniert wurde, kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Immundiagnostik übernimmt keine Haftung. Der Assay ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung abzuarbeiten. 7
Arbeitsschema In 1,5 ml Reaktionsgefäße (z.b. Eppendorf) werden pipettiert: 100 µl Patientenprobe, Kalibrator (CAL) oder Kontrolle (CTRL1, CTRL2) + 200 µl Verdünnungslösung (DIL) Mischen Gesamt- 50 µl der verdünnten Probe + 100 µl Interner Standard (INT STD) + 20 µl Reduktionslösung (REDSOL) + 100 µl Derivatisierungslösung (DER) Reduziertes 50 µl der verdünnten Probe + 100 µl Reaktionspuffer (REABUF) + 100 µl Derivatisierungslösung (DER) Gut mischen, 20 Minuten bei 60 C reagieren lassen 100 µl Fällungsreagenz (PREC) zugeben, gut mischen 10 Minuten bei 2-8 C stehen lassen und anschließend für 10 min bei 10.000 g zentrifugieren 200 µl Reaktionspuffer (REABUF) in Autosampler-Vials vorlegen und 200 µl Überstand zugeben, gut mischen 20 µl in das HPLC-System injizieren 8
Chromatographische Bedingungen Säulenmaterial: MZ Inertsil ODS-2; 5 µm MZ PerfectBond ODS-2; 5 µm Bischoff Prontosil Eurobond; 5 µm Säulendimension: 125 mm x 4 mm Fluss: 0,75 1,0 ml/min Detektion: Fluoreszensdetektion Exzitation: 385 nm Emission: 515 nm Temperatur: 30 C Auftragsvolumen: 20 µl Laufzeit: ca. 10 Minuten Wir empfehlen die Verwendung einer Vorsäule um die Säulenhaltbarkeit zu verlängern. 10. BEHANDLUNG DER TRENNSÄULE Nach der Analyse sollte die Trennsäule mit ca. 30 ml Aqua bidest bei einem Fluss von 1 ml/min gespült werden. Anschließend wird die Säule in 50% Methanol in Wasser gelagert (ca. 30 ml, Fluss 0,7 ml/min). Zur Wiederinbetriebnahme wird das ganze System mit ca. 30 ml Laufmittel äquilibriert. 9
11. AUSWERTUNG Berechnung gesamt Peakhöhe Probe x Konzentration des Kalibrators Peakhöhe Interner Standard der Probe x F = Konzentration Probe F = Peakhöhe Interner Standard des Kalibrators Peakhöhe Kalibrator reduziert Konzentration Probe (nmol/l) = Peakhöhe Probe x Konzentration des Kalibrators* Peakhöhe Kalibrator (* siehe Etikett) 10
Musterchromatogramm GSH-Gesamt 1,2 1 GSH Volt 0,8 0,6 Int. Standard 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minuten freies GSH 1 0,9 GSH 0,8 0,7 0,6 Volt 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minuten 11
12. EINSCHRÄNKUNGEN Seren und Plasmen zeigen sehr niedrige -Konzentrationen. Aus diesem Grund ist eine Differenzierung in oxidiertes und reduziertes in Serum und Plasma nicht möglich. Lipämische Proben sollten zur Messung nicht verwendet werden. 13. QUALITÄTSKONTROLLE Normbereich GSH total : 763 1191 µmol/l (n=50) GSH red. : 620 970 µmol/l GSH red./total : 81 93 % Wir empfehlen jedem Labor seinen eigenen Normalwerte-Bereich zu erstellen, weil Referenzbereiche stark von der Auswahl des Probandenkollektivs abhängig sind. Die Angabe des Normalbereichs für dient lediglich der Orientierung und kann von anderen publizierten Daten abweichen. Kontrollen Zur Überwachung der Qualität der Analyse sollten bei jedem Lauf Kontrollen mitgeführt werden. Wenn eine oder mehrere Kontrollen eines Laufs außerhalb ihres Bereichs liegen ist es möglich, dass auch die Patientenproben falsch ermittelt wurden. 14. TESTCHARAKTERISTIKA Präzision und Reproduzierbarkeit Intra-Assay VK: gesamt: 3,9 % (577 µmol/l) [n = 12] reduziert: 3,3 % (360 µmol/l) [n = 12] Inter-Assay VK: gesamt: 4,2 % (544 µmol/l) [n = 12] reduziert: 3,3 % (108 µmol/l) [n = 12] 12
Linearität gesamt: reduziert: bis 10 mmol/l bis 10 mmol/l Nachweisgrenze gesamt: reduziert: 6 µmol/l 6 µmol/l 15. ENTSORGUNG Das Laufmittel (MOPHA), Reduktionslösung (REDSOL), Reaktionspuffer (REABUF), Interner Standard (INT STD) und Derivatisierungslösung (DER) müssen als halogenfreier Lösungsmittelabfall entsorgt werden. Das Fällungsreagenz (PREC) kann mit Natronlauge neutralisiert und bei neutralem ph als Salzlösung entsorgt werden. Achtung: Wärmeentstehung! 16. MAßNAHMEN BEI STÖRUNGEN Problemstellung Mögliche Ursache Behebung Kein Signal Keine oder defekte Verbindung zur Signalkabel und Anschluss prüfen. Auswerteeinheit. Detektorlampe zu alt Ggf. Lampe erneuern Keine Peaks Injektor verstopft Injektor überprüfen Doppelpeaks Totvolumen an Fittings und / oder Säule Fittings und / oder Säule erneuern 13
Problemstellung Mögliche Ursache Behebung Störpeaks Injektor verunreinigt Injektor reinigen Kontamination am Säulenkopf Luft im System Autosamplergefäße verunreinigt Säule umdrehen und 30 min mit niedrigem Fluß (0,2 ml/min) Laufmittel spülen Pumpe entgasen Neue oder mit Methanol gespülte Autosamplergefäße verwenden Breite Peaks, Tailing Vorsäule / Säule zu alt Neue Vorsäule / Säule verwenden Veränderte Retentionszeit Temperaturdrift Säulenofen verwenden System noch nicht im Gleichgewicht Basislinie driftet Detektorlampe noch kalt Pumpe fördert ungenau Pumpe überprüfen, entlüften Detektorlampe zu alt System noch nicht im Gleichgewicht System mit mobiler Phase 15 min spülen Warten Ggf. Lampe erneuern System mit mobiler Phase 15 min spülen Pumpe fördert ungenau Pumpe überprüfen, entlüften Unruhige Basislinie Pumpe fördert ungenau Pumpe überprüfen, entlüften Detektorzelle Detektorzelle reinigen verschmutzt 14
17. LITERATUR Henning S.M., J.Z. Zhang, R.W. McKee, M.E. Swendseid, R.A. Jacob. blood levels and other oxidant defence indices in men fed diets low in vitamin C. American institute of nutrition, 1991, 1969-1975. Rajender K.C., F.W. Lewis, M.H. Kutner, D.M. Bate, R.G.B. Roy, D. Rudman. Plasma cysteine, cystin, and glutathione in cirrhosis. Gastroenterology 1984; 87; 770-776 Meister A. Mitochondrial changes associated with glutathione deficiency. Biochim Biophys Acta 1995; 35-42. 18. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST Dieser Kit wurde nach der IVD Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. Reagenzien dieser Testpackung enthalten organische Lösungsmittel. Berührungen mit der Haut oder den Schleimhäuten sind zu vermeiden. Sämtliche in der Testpackung enthaltene Reagenzien dürfen ausschließlich zur in-vitro-diagnostik eingesetzt werden. Die Reagenzien sollten nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden (Verfallsdatum siehe Testpackung). Einzelkomponenten mit unterschiedlichen Lot-Nummern aus verschiedenen Testpackungen sollten nicht gemischt oder ausgetauscht werden. Für die Qualitätskontrolle sind die dafür erstellten Richtlinien für medizinische Laboratorien zu beachten. Die charakteristischen Testdaten wie Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten und der Aufbereitung der Proben wurden firmenintern festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik AG übernimmt für direkt daraus resultierende Schäden und Folgeschäden keine Haftung. 15
Manual e HPLC Kit For the determination of e in EDTA-blood Gültig ab/valid from 02.03.2010 KC 1800 100 Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D 64625 Bensheim Phone: ++49 6251 70190-0 Fax: ++ 49 6251 849430 e.mail: Info@immundiagnostik.com www.immundiagnostik.com
HPLC-Application e 1. INTENDED USE The Immundiagnostik Assay is intended for the quantitative determination of glutathione in EDTA-blood. This assay is designed for in vitro diagnostic use only. 2. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST e (GSH) is an intracellular tripeptide common in all tissues, which protects the cells against oxidative processes. It has important functions in several metabolic pathways like activation or inhibition of enzymes, and transport of molecules and at the transport of amino acids. A very important function is stabilizing SH-groups in proteins and other molecules to maintain a reducing intracellular environment. Alterations in the glutathione status are involved in the pathogenesis of several diseases: Reperfusion damage, liver injury, cancer, diabetes mellitus, cataract, inflammatory diseases, chronic lymphatic oedema, radiation damages. Altered glutathione concentrations might also be due to pollution, cigarette smoke, side effects of drugs and aging. Most of the cellular glutathione is reduced (in EDTA-blood approx. 90 %), only a minor amount of 10 % is oxidized (GSSG). This steady state is maintained by the NADPH-dependent glutathione reductase. In case of oxidative stress GSH is needed for several reactions of the primary and secondary anti oxidative protection. 3. PRINCIPLE OF THE TEST The determination of glutathione starts by adding a dilution solution to the sample and dividing it in two aliquots. The measurement of the reduced fraction is performed by the addition of reaction buffer and derivatisation solution. After an incubation of 20 minutes, in which GSH is transformed into a fluorescent product, a precipitation solution is added to separate higher molecular substances. The measurement of the total glutathione is performed by the addition of the reduction solution, internal standard and derivatisation solution. After that, the sample is handled like the reduced fraction. Depending on the reduction solution all the glutathione (GSH and GSSG) is reduced to GSH. 17
HPLC-Application e 20µl of the supernatant are injected into the HPLC system. The separation via HPLC follows an isocratic method at 30 C using a reversed phase column in two runs. One run lasts 10 minutes. The chromatograms are recorded by a fluorescence detector. The quantification is performed with the delivered EDTA-blood calibrator; the concentration is calculated via integration of the peak height by the external standard method for the reduced fraction and the internal standard method for the total GSH fraction. For the measurement of the reduced fraction it is not possible to use the internal standard because of the production of mixed sulfides. The amount of oxidized glutathione can be calculated by subtraction of: e total e reduced Note that the obtained difference must be divided by two as oxidized glutathione (GSSG) is composed of two GSH molecules. Summary: Besides many other parameters the advantage of HPLC method lies in the simultaneous handling of many analytes in a single test. The HPLC system enables even laboratories without experience in high performance liquid chromatography to use this technique for clinical routine determination in a quick and precise manner. Unlike immuno assays with up to six calibrators per test, a one-point calibration is mostly sufficient to calibrate the test system. It is possible to automate the sample application and calculation of the results so that even higher numbers of samples can be handled nearly without control. 18
HPLC-Application e 4. MATERIAL SUPPLIED Catalogue No Content Kit Components Quantity KC 1800LM MOPHA Mobile phase 1000 ml KC 1800KA CAL Calibrator, lyophilized 8 vials KC 1800IS INT STD Internal standard 6 ml KC 1800RE RECSOL Reconstitution solution 5 ml KC 1800VL DIL Dilution solution 25 ml KC 1800RL REDSOL Reduction solution (lyoph. 1.2 ml) 1 vial KC 1800RB REABUF Reaction buffer 27 ml KC 1800DL DER Derivatisation solution 12 ml KC 1800FR PREC Precipitation solution 12 ml KC 1800KO CTRL 1 CTRL 2 Control 1 and 2, 250 µl lyophilized 2 x 3 vials HPLC column (KC 1800RP) as well as individual components can be ordered separately from Immundiagnostik. Please ask for the price list of the individual components. 5. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 1.5 ml reaction tubes (Eppendorf) Centrifuge Various pipettes HPLC with Fluorescence-detector Reversed phase C 18 -column Oven or water bath for heating at 60 C 19
HPLC-Application e 6. PREPARATION AND STORAGE OF REAGENTS Reconstitute calibrator (CAL) in 250 µl reconstitution solution (RECSOL). The content of one vial is intended for one examination. Discard remaining unused material. The concentration of glutathione might have minor changes from lot to lot. Reconstitute controls (CTRL1, CTRL2) in 250 µl reconstitution solution (RECSOL). Take the exact concentration from the product data sheet. Reconstitute reduction solution (REDSOL) in 1.2 ml reconstitution solution (RECSOL). The reconstituted reduction solution is stable for 3 months when stored at 2-8 C. The lyophilized reagents should be stored at 20 C. All other test reagents are stable at 2-8 C, up to the date of expiry stated on the label. 7. PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use only. Human materials used in kit components were tested and found to be negative for HIV, Hepatitis B and Hepatitis C. However, for safety reasons, all kit components should be treated as potentially infectious. Precipitation solution contains acid. Even diluted, it still must be handled with care. It can cause acid burns and should be handled with gloves, eye protection, and appropriate protective clothing. Any spills should be wiped out immediately with copious quantities of water. Do not breathe vapor and avoid inhalation. Reagents should not be used beyond the expiration date shown on the kit label. 8. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION EDTA-blood is suited for this test system. e is quite sensitive against oxidation. Samples should be transported at 2-8 C. Samples are stable for at least 2 days at 2-8 C or 2 weeks at 20 C. During longer storage, the content of oxidized glutathione increases. Note: Before analysis, lyse the erythrocytes by freezing and thawing in order to release glutathione. 20
HPLC-Application e 9. ASSAY PROCEDURE Procedural notes Quality control guidelines should be observed. Incubation time, incubation temperature and pipetting volumes of the components are defined by the producer. Any variation of the test procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the results of the test. Immundiagnostik AG can therefore not be held responsible for any damage resulting from wrong use. The assay should always be performed according the enclosed manual. 21
HPLC-Application e Sample preparation Pipette in a 1.5 ml reaction tube (e.g. Eppendorf): 100 µl Patient sample, calibrator (CAL) or control (CTRL1, CTRL2) + 200 µl dilution solution (DIL) mix Total-glutathione 50 µl diluted sample + 100 µl internal standard (INT STD) + 20 µl reduction solution (REDSOL) + 100 µl derivatisation solution (DER) Reduced glutathione 50 µl diluted sample + 100 µl reactions buffer (REABUF) + 100 µl derivatisation solution (DER) Mix well, incubate for 20 minutes at 60 C Add 100 µl precipitation solution (PREC), mix well Precipitate for 10 minutes at 2-8 C and centrifuge for 10 min at 10.000 g Add 200 µl supernatant to 200 µl reaction buffer (REABUF) in auto samplervials, mix well Inject 20 µl in the HPLC-system 22
HPLC-Application e Chromatographic conditions Column material: MZ Inertsil ODS-2; 5 µm MZ PerfectBond ODS-2; 5 µm Bischoff Prontosil Eurobond; 5 µm Column dimension: 125 mm x 4 mm Flow rate: 0.75-1.0 ml/min Detection : Fluorescence: Exitation 385 nm Emission 515 nm Temperature: 30 C Injection volume: 20 µl Running time: 10 min It is recommended that a guard column is used to extend column life. 10. TREATMENT OF THE COLUMN After analysis, the column should be flushed with 30 ml aqua bidest. (1 ml/min) and stored in 50% methanol in aqua bidest. (approx. 30 ml, flow 0.7 ml/min). Before use, the system should be equilibrated with ca. 30 ml eluent. 11. RESULTS Calculation Calculation of glutathion total Peak height sample x Concentration of the calibrator Peak height internal standard in the sample x F = Concentration sample F = Peak height internal standard in the calibrator Peak height calibrator Calculation of glutathione reduced Concentration sample (nmol/l) = Peak height sample x Concentration of the calibrator Peak height calibrator 23
HPLC-Application e Typical chromatogram GSH-total 1,2 1 GSH Volt 0,8 0,6 Int. Standard 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 minutes GSH-reduced 1 0,9 0,8 GS 0,7 0,6 Volt 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 minutes 24
HPLC-Application e 12. LIMITATIONS Do not use serum or plasma samples. The content of glutathione in serum and plasma is lower, and it is not possible to distinguish between the oxidized and reduced glutathione form. Do not use lipemic samples. 13. QUALITY CONTROL Expected values (n=50) GSH total : 763 1191 µmol/l GSH reduced : 620 970 µmol/l GSH reduced/total : 81 93 % It is recommended that each laboratory should establish its own normal range. Above mentioned values are only for orientation and may vary from other published data. Controls Control samples should be analyzed with each run. Results, generated from the analysis of control samples, should be evaluated for acceptability using appropriate statistical methods. The results for the patient samples may not be valid, if within the same assay one or more values of the quality control sample are outside the acceptable limits. 25
HPLC-Application e 14. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Precision and reproducibility Intra-Assay CV: GSH total : 3.9 % [n = 12] GSH reduced : 3.3 % [n = 12] Inter-Assay CV: GSH total : 4.2 % [n = 12] GSH reduced : 3.3 % [n = 12] Linearity Detection limit up to 10 mmol/l (GSH total and GSH reduced ) 6 µmol/l (GSH total and GSH reduced ) 15. DISPOSAL The MOPHA (mobile phase), REDSOL (reduction solution), INT STD (internal standard), and DER (derivatisation solution) must be disposed as nonhalogenated solvents. The PREC (precipitation solution) can be neutralized with NaOH to ph 7.0 and disposed as salt solution. Important: Reaction will produce heat, be careful! Please refer to the appropriate national guidelines. 26
HPLC-Application e 16. TROUBLESHOOTING Problem Possible reason Solution No signal No or defect connection to evaluation system 27 Check signal cord and connection Detector lamp is altered Change lamp No peaks Injector is congested Check Injector Double peaks Dead volume in fittings and / or column Renew fittings and / or column Contaminating peaks Injector dirty Clean injector Contamination at the head of the column Air in the system Auto sampler vials contaminated Broad peaks, tailing Precolumn / column exhausted Variable retention times Drift in temperature Baseline is drifting Baseline is not smooth Change direction of the column and rinse for 30 min at low flow rate (0.2 ml/min) with mobile phase Degas pump Use new vials or clean them with methanol Use new precolumn / column Use a column oven Pump delivers imprecise Check pump, degas the system System is not in steady state yet Detector lamp did not reach working temperature yet Detector lamp is too old System is not in steady state yet Rinse system mobile phase for 15 min Wait Renew lamp Rinse system mobile phase for 15 min Pump delivers imprecise Check pump, degas the system Pump delivers imprecise Check pump, degas the system Detector flow cell is dirty Clean flow cell
HPLC-Application e 17. REFERENCES Henning S.M., J.Z. Zhang, R.W. McKee, M.E. Swendseid, R.A. Jacob. blood levels and other oxidant defence indices in men fed diets low in vitamin C. American institute of nutrition, 1991, 1969-1975. Rajender K.C., F.W. Lewis, M.H. Kutner, D.M. Bate, R.G.B. Roy, D. Rudman. Plasma cysteine, cystin, and glutathione in cirrhosis. Gastroenterology 1984; 87; 770-776 Meister A. Mitochondrial changes associated with glutathione deficiency. Biochim Biophys Acta 1995; 35-42. 18. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE This assay was produced and put on the market according to the IVD guidelines of 98/79/EC. The test components contain organic solvents. Contact with skin or mucous membranes must be avoided. All reagents in the test package are for in-vitro diagnostic use only. Reagents should not be used beyond the expiration date shown on the kit label. Do not interchange different lot numbers of any kit component within the same assay. Quality control guidelines should be observed. Incubation time, incubation temperature and pipetting volumes of the components are defined by the producer. Any variation of the test procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the results of the test. Immundiagnostik AG can therefore not be held responsible for any damage resulting from wrong use. 28