Dipl. Natw. ETH EIDGENÖSSISCHEN. vorgelegt von. geboren am 20. April Auszüge dieser Arbeit wurden veröffentlicht in PHAGOZYTOSE-AUSLÖSER ZÜRICH
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- Catrin Judith Schneider
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1 Diss. ETH Nr NATTIRLICHERWEISE VORKOMMENDE ANTIKÖRPER GEGEN BANDE 3 PROTEIN ALS PHAGOZYTOSE-AUSLÖSER ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von ROLAND FLEPP Dipl. Natw. ETH geboren am 20. April 1956 von Zürich (ZH) und Disentis (GR) Angenommen auf Antrag von Prof. G. Semenza, Referent Dr. H.U. Lutz, 1. Koreferent Prof, P. Arese, 2. Koreferent Zürich 1986 Auszüge dieser Arbeit wurden veröffentlicht in J. Immunology 133 (1984) Seiten
2 -91- Zusammenfassung Antikörper gegen Bande 3 Protein, dem wichtigsten integralen Membranprotein menschlicher Erythrozyten, sind bis jetzt die einzigen natürlicherweise vorkommenden Antikörper gegen ein definiertes integrales Membranprotein. Als natürlicherweise vorkommend sind diese Antikörper deshalb zu betrachten, weil sie aus allen untersuchten Seren von gesunden, nicht mit dem entsprechenden Antigen immunisierten Einzelspender wie auch aus Sandoglobulin isoliert werden konnten. Anti-Bande 3 Antikörper banden auf Immunoblots hämoglobinfreier Membranen selbst bei ihrer geringen physiologischen Konzentration fast ausschliesslich an Bande 3 Protein, wobei deren Bindung durch andere Serum IgG nicht gehemmt wurde. Anti Bande 3 Antikörper waren gegen exoplasmatische aber schwer zu gängliche und transmembranäre Bereiche von Bande 3 Protein, die wenig oder gar nicht glykosiliert sind, gerichtet. Sie banden bis 7 Mal besser an denaturiertes als an natives Antigen. Antigenes Bande 3 Protein war sowohl in jungen wie in alten Erythrozyten vorhanden. Bei Konzentrationen, die wesentlich über der physiologischen lagen banden Anti-Bande 3 Antikörper an intakte Erythrozyten, wodurch die exoplasmatische Verfügbarkeit antigener Stellen auf intakten Erythrozyten bestätigt wurde. Die Bindung von Anti-Bande 3 Antikörpern konnte durch vor gängige oxidative Schädigung der Erythrozyten mit Diamid leicht erhöht werden. Derart modifizierte Erythrozyten wurden durch adhärente Monozyten, vermutlich über Fc-Rezeptoren, phago zytiert. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass natürlicherweise vorkommende Anti-Bande 3 Antikörper spezifisch an die Oberfläche intakter Erythrozyten binden und Phagozytose auslösen können. Anti-Bande 3 Antikörper besitzen somit funktionelle Eigenschaften. Die erhöhte Bindung von Anti-Bande 3 Antikörpern an Diamid-
3 -92- behandelte Erythrozyten und der weitere Verlauf der Bindungs kurven deuten darauf hin, dass eine oxidative Schädigung durch Diamid wenige Antigene, vermutlich durch Oligomerisierung, in eine hochaffine Form überführt, an die Anti-Bande 3 Antikörper bevorzugt binden können. Weil eine Antikörper-abhängige Phago zytose nur bei hohen Anti-Bande 3 Antikörperkonzentrationen beobachtet werden konnte, können Anti-Bande 3 Antikörper allein kaum für die in vivo Elimination alter Erythrozyten verantwort lich sein, wie früher postuliert worden war. Wir vermuten, dass sofern Anti-Bande 3 Antikörper an der Elimination alter Erythro zyten beteiligt sind, dies nur im Zusammenwirken mit Komplement- Faktoren möglich ist. Entsprechend wurden Diamid-behandelte Erythrozyten nach Opsonisierung in Vollserum bereits ohne sätzliche Anti-Bande 3 Antikörper phagozytiert. zu
4 -93- Summary Antibodies to band 3 protein, the major integral membrane protein of human red blood cells are presently the only one naturally occurring antibodies to a definded integral membrane protein. These antibodies are naturally occurring because they could be isolated from all tested sera of healthy donors not immunised with the corresponding antigen and from Sandoglobulin. Antibodies to band 3 protein bound even at their low physiological concentration almost exclusively to band 3 protein on immunoblots of erythrocyte ghosts. Their binding was not suppressed by other serum IgG. They were directed against exoplasmic but poorly accessible and membrane spanning regions of band 3 protein which contained no or only a few carbohydrates. Antibodies to band 3 bound up to 7 times better to denatured than to native antigen but bound equally well to band 3 protein of young and old red blood cells. At concentrations highly exceeding their physiological con centration antibodies to band 3 protein bound to intact red blood cells, confirming the accessibility of antigenic sites on intact cells. Binding of antibodies to band 3 protein to Diamid-treated cells was increased and their phagocytosis by adherent monocytes was induced. This was the first demonstration of naturally occurring antibodies to band 3 protein binding to the surface of intact red blood cells and inducing phagocytosis. Thus, antibodies to band 3 protein have functional properties. Increased binding of antibodies to band 3 protein to Diamid-treated red blood cells and their binding characteristics may lead to the hypothesis that oxidative damage by Diamid transforms some binding sites into "high affinity sites", probably by oligomerisation of band 3 protein, to which antibodies to band 3 protein bind more easily.
5 -94- As an antibody-dependent phagocytosis was induced only at high concentrations of antibodies to band 3 protein, these anti bodies can not be solely responsible for the elimination of old red blood cells in vivo as stated earlier. We think that antibodies to band 3 protein having a homeostatic function the selective elimination of old red blood cells in vivo is brought about by the help of complement factors. This hypothesis is confirmed by the fact, that Diamid-treated red blood cells opsonised in füll serum are phagocytosed without adding antibodies to band 3 protein.
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