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- Adolf Hausler
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1 HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN bioelisa SYPHILIS tests tests ELISA-Test der dritten Generation zur Bestimmung von IgG und IgM Antikörpern gegen Treponema pallidum in Humanserum oder -plasma. Zusammenfassung Die Syphilis ist eine von einem spiralförmigen Bakterium, das als Treponema pallidum bezeichnet wird, verursachte Krankheit, die normalerweise durch direkte sexuelle Kontakte übertragen wird. Allerdings kann sie über die Plazentaschranke vertikal von der Mutter auf den Fötus oder durch eine Bluttransfusion übertragen werden. Die serologische Diagnose der Syphilis wird durchgeführt, indem das Vorhandensein von signifikanten Niveaus von spezifischen Antikörpern gegen T. pallidum im Serum des Patienten nachgewiesen wird. Die Referenz-Methode ist der FTA-ABS-Test, eine Technik, die den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM ermöglicht. Allerdings ist seine Durchführung sehr arbeitsaufwändig und seine Interpretation kompliziert. Es gibt andere alternative Methoden, welche die serologische Diagnose vereinfachen: Reaktion mit Lipoid-Antigenen (Reaktionstests) oder Agglutination von mit spezifischen T. pallidum Antigenen beschichteten Erythrozyten (Hämagglutinationstests oder TPHA). Der TPHA ist der bevorzugte Suchtest, da er auch gleichzeitig IgG und IgM nachweist. Allerdings erhält man das Testergebnis durch eine subjektive Interpretation und er kann nicht in seiner Gesamtheit automatisiert werden. bioelisa SYPHILIS 3.0 ist ein Test, der auch IgG und IgM nachweist und den Krankheitsnachweis unter Verwendung der ELISA-Technik ermöglicht, eine kostengünstige Methode, die perfekt mit dem TPHA korreliert und in ihrer Gesamtheit automatisiert werden kann. Neben der Benutzung der immundominanten rekombinanten Antigene p15, p17 und p47 enthält dieser Test ein zusätzliches rekombinantes Protein (Patent angemeldet), das die Sensitivität erhöht. Prinzip bioelisa SYPHILIS 3.0 ist ein Enzymimmuno-Test der dritten Generation zur Bestimmung von IgG- und IgM-Anti-T. pallidum-antikörpern in Serum oder Plasma. Die zu analysierenden Proben werden in die mit rekombinanten Antigenen p15, p17 und p47 von T. pallidum beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die in der Probe vorhandenen spezifischen IgG- und IgM-Antikörper werden sich mit den Antigenen der Festphase kombinieren. Anschließend werden die Vertiefungen ausgewaschen, um die Restprobe zu beseitigen und es werden mit dem Enzym Peroxidase konjugierte, rekombinante T. pallidum p15, p17 und p47 Antigene hinzugegeben. Das Konjugat wird mit den spezifischen T. pallidum-antikörpern, die in der ersten Inkubation aufgenommen wurden, reagieren. Nach erneutem Auswaschen, um das ungebundene Material zu beseitigen, wird ein Enzymsubstrat, das zu einem Farbumschlag führt, hinzugegeben. Diese Lösung wird blaue Farbe annehmen, wenn die Probe Antikörper gegen T. pallidum aufweist. Die blaue Farbe wird gelb, nachdem die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt worden ist. Die Intensität der Farbe ist proportional zu der Konzentration der T. pallidum-antikörper. Bestandteile 1. MCPL MIKROTITERPLATTE: 12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinanten p15, p17 und p47 T. pallidum-antigenen. Einzeln trennbare Vertiefungen. 2. CONJ 51x KONZENTRIERTES KONJUGAT: Mit Peroxidase konjugierte, rekombinante p15, p17 und p47 T. pallidum-antigene. Enthält roten Farbstoff, Proteinstabilisatoren, 0,02% Thimerosal und 0,001% Gentamicinsulfat. Vor Gebrauch 1/51 mit dem Konjugatverdünnungsmittel verdünnen. 3. DIL CONJ KONJUGATVERDÜNNUNGSMITTEL: Tris-Puffer. Enthält gelben Farbstoff, Zusatzmittel, 0,02% Thimerosal und 0,001% Gentamicinsulfat. 4. DIL SAMP PROBENVERDÜNNUNGSMITTEL: Tris-Puffer der Zusatzmittel, 0,01% Thimerosal und purpurfarbenen Farbstoff enthält. Gebrauchsfertig. 5. WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG: Konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen. 6. SUBS BUF SUBSTRATPUFFER: Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid und 0,002% Gentamicinsulfat.
2 7. SOLN TMB CHROMOGEN: 3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Enthält roten Farbstoff. 8. CONTROL + H STARK POSITIVE KONTROLLE: Verdünntes Humanserum, das T. pallidum-antikörper enthält. Enthält < 0,1% Natriumazid, < 1,0% Triton X-100 und grünen Farbstoff. Gebrauchsfertig. 9. CONTROL + L SCHWACH POSITIVE KONTROLLE: Verdünntes Humanserum, das eine geringe Konzentration von T. pallidum-antikörpern enthält. Enthält < 0,1% Natriumazid, < 1,0% Triton X-100 und grünen Farbstoff. Gebrauchsfertig. 10. CONTROL NEGATIVE KONTROLLE: Verdünntes Humanserum, anti-t. pallidum-antikörper negativ. Enthält < 0,1% Natriumazid, < 1,0% Triton X-100 und blauen Farbstoff. Gebrauchsfertig. 11. H 2 SO 4 1N STOPPLÖSUNG (nur in dem Kit mit 1 Platte): 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. 12. SEALS HAFTFOLIE: Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen. 13. BAG FOLIENBEUTEL: Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen. Vorsichtsmassnahmen bioelisa SYPHILIS 3.0 ist ausschliesslich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal. Das hohe positive Kontrolle, niedrige positive Kontrolle und die negative Kontrolle enthalten < 0,1% Natriumazid und < 1,0% Triton X-100. Im Anschluss erscheinen die entsprechenden Risiko- (R) und Sicherheitssätze (S): R22 S46 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL. Das gesamte zur Herstellung dieses Produkts verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von HBsAg, HIV-1/HIV-2 und HCV Antikörpern getestet und für negativ befunden worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben: - Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden; bei Berührung mit reichlich Wasser auswaschen. - Handschuhe verwenden. - Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. - Nicht rauchen. - Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von Proben, Kontrollen, aspirierte Reagenzien und Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter gesammelt werden und eine Stunde bei 121 C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden. (Die Reste, die Säure enthalten können, müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorit neutralisiert werden). - Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden. Hinweise für die Handhabung: - Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund). - Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen. - Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. - Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine Änderung des Erscheinungsbilds beobachten. - Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination zwischen den Reagenzien zu vermeiden.
3 - Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden. - Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten diese darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen, mit reichlich destilliertem Wasser ausgespült und vor Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu verwenden. Lagerung und Stabilität Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8 C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8 C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel 3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar, wenn sie bei 2-8 C gelagert wird. Das Konjugat ist nach Verdünnung 15 Tage haltbar bei einer Lagerung zwischen 2 und 8 C. Das Chromogen vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil, deshalb sind die Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen. Packungsgrössen - Kit mit 1 Platte (96 Tests), REF Enthält: 1 Platte; 1 x 0,4 ml konzentriertes Konjugat; 1 x 15 ml Konjugatverdünnungsmittel; 1 x 30 ml Probenverdünnungsmittel; 2 x 50 ml konzentrierte Waschlösung; 1 x 14 ml Substratpuffer; 1 x 1,5 ml Chromogen; 1 x 2 ml stark positive Kontrolle; 1 x 2 ml schwach positive Kontrolle; 1 x 2 ml negative Kontrolle; 1 x 12 ml Stopplösung; 1 Folienbeutel und Haftfolien. - Kit mit 5 Platten (5 x 96 Tests), REF Enthält: 5 Platten; 1 x 1,5 ml konzentriertes Konjugat; 1 x 70 ml Konjugatverdünnungsmittel; 1 x 120 ml Probenverdünnungsmittel; 3 x 100 ml konzentrierte Waschlösung; 5 x 14 ml Substratpuffer; 1 x 1,5 ml Chromogen; 1 x 4 ml stark positive Kontrolle; 1 x 4 ml schwach positive Kontrolle; 1 x 4 ml negative Kontrolle; 1 Folienbeutel und Haftfolien. Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material - Destilliertes oder deionisiertes Wasser. - Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (50 µl, 100 µl, 1000 µl) und Einwegspitzen. - Inkubator bei 37 C 1 C. - Stoppuhr. - Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 oder 630 nm. - Manuelles oder automatisiertes Waschsystem. - Stopplösung (Kit mit 5 Platten): 1N Schwefelsäure. Es kann auch 2N oder 4N Schwefelsäure verwendet werden. Probenmaterial Frisches Serum oder Plasma (EDTA) benutzen. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben können 3 Tage lang bei 2-8 C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren werden (-20 C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann. Automatische Verarbeitung Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihre m Händler in Verbindung. DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf) Vorbereitung Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein (20-25 C). Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden. Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wird nicht die ganze Platte gebraucht, dann eine proportional entsprechende Menge der Lösung herstellen.
4 Das konzentrierte Konjugat mit dem Konjugatverdünnungsmittel gemäß Tabelle 1 1/51 verdünnen. Bei Verwendung der gesamten Platte 300 µl des konzentrierten Konjugats direkt in eine Reagenzflasche mit 15 ml des Konjugatverdünnungsmittel geben. Vorsichtig mischen. TABELLE 1 Erforderliche Streifen Verdünnungsmittel Konjugat ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Konzentriertes Konjugat µl Überwachung der Zugabe von Proben und Reagenzien Da die Pufferlösung der Proben einen Farbindikator enthält und alle Kontrollen und Reagenzien gefärbt sind, ist es möglich, ihre Zugabe in die Vertiefungen der Mikroplatte visuell oder mit einem spektralfotometrischen Lesegerät zu überwachen. Das Probenverdünnungsmittel hat violette Farbe, nach Zugabe der Probe wird es blau. Der Farbwechsel erscheint nach einigen Sekunden und seine Intensität ist je nach den verwendeten Proben unterschiedlich, doch immer wird eine Änderung sichtbar. Die verdünnten Proben oder andere Laborpräparate können keine Farbänderung hervorrufen. Um die Zugabe der Proben zu überwachen, kann die Extinktion der Vertiefungen bei 620 nm ohne Referenzfilter abgelesen werden. Das Arbeitskonjugat hat orange Farbe. Um seine Zugabe zu überwachen, wird die Extinktion bei 450 nm ohne Referenzfilter abgelesen. Das Arbeitssubstrat hat rosa Farbe. Die spektralfotometrische Kontrolle erfolgt bei 450 nm ohne Referenzfilter. Die Verwendung anderer Wellenlängen zur Überwachung ist nicht validiert. ANMERKUNG: jedes Labor muss seine eigenen Referenzbereiche festlegen. Wenn irgendeine Vertiefung nicht die vorgegebenen Spezifikationen erfüllt, kann dies auf Fehler bei der Verteilung hindeuten, die untersucht werden müssen. Versuchsprotokoll 1. Nur die für den Test benötigte Anzahl Streifen verwenden. 8 Vertiefungen für Leerwert und Kontrollen reservieren. 50 µl des Probenverdünnungsmittels auf die übrigen Vertiefungen dosieren. Anschließend 50 µl jeder Probe in die vorher bestimmten Vertiefungen dosieren. 100 µl von negativer Kontrolle auf 2 Vertiefungen dosieren, 100 µl von schwach positiver Kontrolle auf 3 Vertiefungen und 100 µl von stark positiver Kontrolle auf 2 Vertiefungen dosieren. KONTROLLEN NICHT VERDÜNNEN, SIE SIND SCHON GEBRAUCHSFERTIG. Eine Vertiefung für den Substratleerwert freilassen. 2. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken, vorsichtig mischen und 1 Stunde lang bei 37 C inkubieren. 3. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertiefungen herauspipettieren und diese vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirierung und Auswaschen weitere 3 Mal Stellen sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens 15 Sekunden einweicht, bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die Platte umgekehrt über saugfähigem Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsüberschüsse in den Vertiefungen zu beseitigen µl Konjugat auf jede Vertiefung übertragen, mit Ausnahme der für die Kontrolle des Substratleerwertes bestimmten Vertiefungen. Blasenbildung vermeiden. 5. Die Platte mit einer Haftfolie abdecken und 30 Minuten lang bei 37 C inkubieren. 6. Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten. Bei Verwendung der ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in die Reagenzflasche mit Substratpuffer (14 ml) einfüllen und gut mischen. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann die erforderliche Menge gemäß Tabelle 2 zubereiten. Die endgültige Lösung ist rötlich, bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. TABELLE 2 Erforderliche Streifen Substratpuffer ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Chromogen (TMB) µl
5 HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18 C liegt muss das Chromogen vor Gebrauch auf eine Temperatur von C gebracht und gut gemischt werden. 7. Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Die Platte wie unter Punkt 3 beschrieben aspirieren und waschen µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats. 11. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von nm. Qualitätskontrolle Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind: 1 Substratleerwert: der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein. 2. Negative Kontrolle: Extinktion nach Abzug des Leerwertes kleiner als 0, Schwach positive Kontrolle: keiner der einzelnen Extinktionswerte darf mehr als 30% vom Mittelwert der drei Werte abweichen. Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder höher als 0,120 liegen. 4. Stark positive Kontrolle: Extinktion nach Abzug des Leerwertes größer oder gleich 0, Verhältnis stark positive Kontrolle/schwach positive Kontrolle > 2,5. 6. Verhältnis negative Kontrolle/schwach positive Kontrolle < 0,5. Ergebnisse 1. Den Mittelwert der Extinktion der schwach positiven Kalibriersubstanz berechnen. Das Ergebnis ist der Schwellenwert. Schwellenwert = SCPKx 2. Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen. Positiv: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 1,0 Negativ: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 0,9 Zweifelhaft: Verhältnis Extinktion/Schwellenwert 0,9 1,0 Auswertung der Ergebnisse Ein positives Ergebnis zeigt T. pallidum-infektion an, entweder akut oder vergangen. Es muss der klinische Verlauf des Patienten berücksichtigt werden. Begrenzung der Methode Wie auch bei anderen serologischen Untersuchungen dienen die mit bioelisa SYPHILIS 3.0 ermittelten Resultate als Hilfe bei der Diagnose und müssen unter Berücksichtigung des klinischen Befunds des Patienten interpretiert werden. Bei zweifelhaften Ergebnissen wird empfohlen, den Test mit einer neuen Probe des Patienten zu wiederholen und mit einer anderen Methode zu testen. Für eine optimale Leistung des Kits sind die beschriebenen Anweisungen genauestens zu befolgen. Irgendeine Abweichung kann zu abwegigen Ergebnissen führen. Wie bei allen sehr empfindlichen Immuntests besteht die Möglichkeit positiver Resultate, die sich nicht Ein negatives Resultat schliesst die Möglichkeit einer Aussetzung oder einer Infektion mit T. pallidum nicht aus.
6 Erwartete Ergebnisse Das Auftreten von positiven Ergebnissen hängt von der getesteten Bevölkerung ab. Die Bevölkerung freiwilliger und altruistischer Blutspender liefert sehr niedrige positive Indizes. Bevölkerungsgruppen mit hohem Risiko wie Drogenabhängige, Prostituierte und Häftlinge liefern erhöhte Indizes für Positivität, da dieser Test sowohl kurz zurückliegende als auch vergangene Infektionen nachweisen kann. Im Vergleich mit RPR kann bioelisa SYPHILIS 3.0 unerwartete positive Befunde bei negativen RPR-Proben liefern. Dies liegt daran, dass bioelisa Treponema-Antikörper nachweist, die während des ganzen Lebens des Patienten Bestand haben. RPR liefert bei zurückliegenden Infektionen in der Regel negative Befunde, da er heterophile Antikörper nachweist, die nur in der Anfangsphase der Syphilis-Infektion auftauchen. Charakteristika des Tests Analytische Sensibilität Der Kit war dazu fähig, in zwei geprüften Chargen Konzentrationen von weniger als 0,030 le/ml des 1. Internationalen Standards für Syphilis-Serum der WHO (HS, 1958, NIBSC, Vereinigtes Königreich) nachzuweisen. Auswertungen Das Funktionieren des bioelisa SYPHILIS 3.0 wurde beim Test von in internen und geschäftlichen Panels als positiv eingestuften sowie von nach dem Zufallsprinzip bei Blutspendern und Krankenhauspatienten ausgewählten Proben bewertet. Sensitivität - Von 159 als positiv eingestuften Proben verschiedener Herkunft, die Proben aus verschiedenen Stadien der Syphilis beinhalteten, deckte der Kit 158 korrekt als positiv auf. Die ermittelte Sensitivität lag somit bei 99,4% (158/159). - Es wurde ein im Handel befindliches aus 25 eingestuften Proben bestehendes Panel BBI Syphilis Mixed Titer Performance panel PSS201 getestet. Der Kit wies korrekt die 25 Proben nach. Spezifität - Es wurde eine Spezifitäts-Evaluation durchgeführt, bei der 2883 Proben von Blutspendern in Barcelona, Spanien, getestet wurden. Von diesen Proben erwiesen sich in dem Versuch 17 als reaktiv. Von den 17 reaktiven, wurden 10 mit anderen Methoden als tatsächlich positiv bestätigt und 7 wurden als falsch positiv angesehen. Die ermittelte Spezifität betrug 99,8% (2876/2883). - Es wurden 200 Proben von Krankenhauspatienten getestet, von denen sich mit dem Kit 7 als reaktiv erwiesen. Alle 7 wurden mit anderen Methoden als tatsächlich positiv bestätigt. Die in dieser Studie ermittelte Spezifität war 100% (193/193). Präzision Intra-Assay Reproduzierbarkeit: Die erhaltenen Variationskoeffizienten für die Extinktionswerte einer positiven Probe, die 24 Mal repliziert wurde, lagen bei 4,8%, 4,0% und 6,2% bei drei untersuchten Chargen. Inter-Assay Reproduzierbarkeit: Drei positive Proben unterschiedlichen Niveaus wurden in 5 verschiedenen Tests getestet. Die erhaltenen Variationskoeffizienten für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Proben lagen bei 5,6%, 5,9% und 5,3%. Interferenzen In einer Studie über mögliche Interferenzen wurden 60 Proben mit einem potenziellen Risiko falsch positive Ergebnisse zu liefern getestet. Von besagten Proben waren 6 positiv für antinukleare Antikörper (ANA), 4 waren positiv für E. coli-antikörper und 50 waren von schwangeren Frauen. Alle Ergebnisse erwiesen sich als negativ. Kontrollierte Studien zeigten auch, dass das Funktionieren des Tests durch das Vorhandensein von Antikoagulations-Mitteln (EDTA) nicht beeinträchtigt wird.
7 bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 1. Kontrollen außerhalb der Validierung. 2. Keine oder nur schwache Färbung am Ende des Tests. 1a. Temperatur, Inkubation oder Pipettieren falsch. 1b. Unsachgemäße Vorbereitung der Reagenzien, falsche Verdünnung. Reagenzien nicht richtig durchgemischt. 1c. Kreuzkontamination zwischen Kontrollen. Sorgfältig pipettieren. Die Reagenzflascheverschlüsse nicht vertauschen. Den Test 1d. Falscher Lesefilter. Überprüfen, ob ein Lesefilter der Wellenlänge 450 nm eingesetzt ist. Wird kein Referenzfilter mit nm eingesetzt, dann erhöht sich die Extinktion um ca. 0,050. 1e. Interferenz in der Optik. Das Messgerät überprüfen. Den Grund der Vertiefungen reinigen oder trocknen. Prüfen, ob Luftblasen eingeschlossen sind. Die Ablesung 1f. Es wurden Komponenten aus unterschiedlichen Chargen verwendet. Keine Komponenten aus unterschiedlichen Chargen mischen, da diese spezifisch für jeden Chargen zusammengestellt sind. 1g. Reagenzien abgelaufen. Verfallsdatum des Kits prüfen. Ein abgelaufenes Kit nicht mehr verwenden. 2a. Ein Reagenz oder mehrere nicht oder in der falschen Reihenfolge hinzugefügt. 2b. Zu kalte Reagenzien. Die Reagenzien vor der Verwendung erst die Raumtemperatur erreichen lassen. 2c. Konjugat inaktiv: unsachgemäße Lösung oder Konservierung. 2d. Mikrotiterplatte inaktiv: unsachgemäße Konservierung. 2e. Substrat inaktiv: unsachgemäße Konservierung oder Verdünnung, der verwendete Behälter beeinträchtigt die Stabilität des Substrats, Kreuzkontamination mit der Stopplösung. Prüfen, ob es zu einer Kontamination gekommen ist. Die nicht verwendeten Streifen sind immer im verschließbaren Folienbeutel zusammen mit dem Trockenmittel aufzubewahren. Den Test Immer eine neu zubereitete TMB-Lösung im Substratpuffer verwenden. Einwegbehälter verwenden oder die Behälter mit Säure oder Ethanol auswaschen und mit desionisiertem Wasser ausspülen. Methode überprüfen. Den Test
8 bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung Problem Mögliche Ursachen Lösung 3. Zu starke Färbung in allen Vertiefungen der Mikrotiterplatte. 4. Schlechte Reproduzierbarkeit oder erhöhte Anzahl reaktiver Proben, die sich nicht 3a. Substrat kontaminiert, oxidiert oder unsachgemäß vorbereitet. 3b. Reagenzien kontaminiert oder unsachgemäß zubereitet. 3c. Waschlösung (1x) kontaminiert. 3d. Waschen ungenügend oder nicht konsistent: Füllmenge und/oder Aspirieren ungenügend oder nicht einheitlich, Anzahl der Waschzyklen ungenügend. Wascher kontaminiert. 3e. Es wurde Waschlösung von einem anderen Hersteller verwendet. 3f. Unsachgemäße Verdünnung der Proben. Prüfen, ob das vorbereitete Substrat rosa Farbe hat; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden. Vor Verwendung das TMB prüfen und sicherstellen, dass es vollkommen flüssig ist. Für eine vollständige Durchmischung des TMB im Substratpuffer sorgen. Einweg- Reagenzgläser oder Behälter verwenden oder diese mit Säure auswaschen. Den Test Auf Kontamination prüfen (Trübung). Verdünnungen prüfen. Den Test Die Qualität des destillierten/deionisierten Wassers zur Herstellung der Verdünnung prüfen. Den Test Wascher prüfen. Die Vertiefungen bis zum Rand befüllen und vollständig aspirieren. Die Anzahl der Waschzyklen und die Einweichzeit erhöhen. Die umgekehrte Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen. Den Test wiederholen Nur die Waschlösung von biokit verwenden. 4a. Probleme beim Waschen. Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetten schlecht kalibriert Nur kalibrierte Pipetten mit richtig oder Pipettenspitzen nicht eingesetzten Pipettenspitzen richtig eingesetzt. verwenden. Sorgfältig und ohne Unsachgemäße Blasen und Spritzer pipettieren. Pipettiertechnik. Den Test 4c. Reagenzien und Seren nicht auf Raumtemperatur oder vor Gebrauch nicht richtig gemischt. 4d. Mikrotiterplatten während der Inkubationen der Zugluft ausgesetzt. 4e. Zuviel Zeit bei der Zugabe von Proben und/oder Reagenzien. Inkonsistente Zeitintervalle. Luftblasen. 4f. Interferenzen in der Optik. Siehe 1e. Reagenzien und Seren auf Raumtemperatur bringen und vor Gebrauch gut mischen. Die Mikrotiterplatte vor Zugluft geschützt lagern. Eine einheitliche und konsistente Technik entwickeln.
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