HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an Beispielen von Weinen und Alkopops

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1 10. Knauer-HPLC-Work-Shop 2018: FZ Dresden-Rossendorf HPLC-Analytik von Kohlenhydraten und Ethanol an Beispielen von Weinen und Alkopops Manfred Gey a.d. (Hochschule Zittau/Görlitz) 1

2 Schwerpunkte 1. Ausgangspunkt und Einführung 2. Problematik der LC Trennung und Detektion von Kohlenhydraten 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für KH/EtOH 3.1 Historische Zuckertrennung 3.2 Aminophasen 3.3 HPAEC PAD 3.4 Ligandenaustausch LC 4. Ergebnisse der Wein und Alkopop Analytik 4.1 Problematik der Zuckergehalte 4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol 4.2 Weingenuss versus Alkohol Abusus 5. Kleines Resümee 2

3 1. Ausgangspunkt und Einführung Zucker sind ernährungsphysiologisch wichtig (Energiehaushalt) Andererseits sind Zucker oft Ursachen/ Mithelfer bei der Entstehung von Erkrankungen (Diabetes, Lactoseintoleranz u.a.) Glycane/Zuckersequenzen spielen eine wichtige Rolle in Glycoproteinen bei biochemischen Reaktionen/Zell Zell Erkennung Getränke mit hohem Zuckergehalt/Süßspeisen sind oft (Teil ) Ursachen für Übergewicht bereits bei Kindern und Jugendlichen Bei Verzehr von Lebensmitteln/Getränken sind vor allem hohe Zuckergehalte zu beachten! Alkopops und süße Weine sind kritisch und ggf. zu meiden! Analytische Methoden/HPLC sind sehr gut geeignet, monomere und dimere Kohlenhydrate sowie den Ethanolgehalt in diesen Produkten zu bestimmen. HPLC Trennmechanismen basierend auf LEC und HPAEC PAD sind dafür sehr gut geeignet 3

4 2. Problematik der LC Trennung und KH Detektion Hexosen (Glucose, Galactose, Mannose) annähernd gleiche Strukturen identische Molekulargewichte Zucker sind i.d.r. neutral/nicht ionisch Durch starke Basen Überführung in Oxianionen möglich Dann Trennung durch Ionenaustausch (IEC) gegeben Mono /dimere Kohlenhydrat Strukturen besitzen i.d.r. keine chromophoren Gruppen UV/VIS und Fluoreszenz wenig geeignet RI Detektion möglich wenig sensitiv PAD ist relativ speziell (Equipment/Detektor) MS nicht immer vorhanden 4

5 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.1 Historische Zuckertrennung C C OH OH HO HO B OH Kohlenhydrat Borsäure C C O O B OH OH H 2 O Anionischer Zucker-Borat- Komplex 5

6 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.1 Historische Zuckertrennung Zeit in Stunden! Anionenaustauscher : Aminex A-27,10 µm; Säule : 150 cm x 6,2 mm, Gradientenelution mit Boratpuffer, je 1 µmol jedes Zuckers, nach D. Scott, in "Modern Practice of Liquid Chromatography", J.J. Kirkland ed. 6

7 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.2 Aminophasen Rhamnose 3 Glucose 4 Cellobiose 5 Raffinose Zeit (min) Glassäule: 100 x 3,8 mm i.d. stat. Phase: Silasorb NH 2, dp = 5 µm mobile Phase: ACN/Wasser 75:25 V/V Flussrate: 1,7 ml/min Vordruck: 8 MPa Detektion: RI, 5 x 10 5 I.I.U. Inj. volumen: 20 µl. 7

8 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.3 HPAEC PAD High ph anion exchange chromatography pulsed amperometric detection dp = 5 µm sulfoniert SO 3 Latexpartikel dp = 0,1 µm Partikel der stationären Phase auf Styren-Divinylbenzen-Basis (S-DVB) + NaOH ph =

9 Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.3 HPAEC PAD High ph anion exchange chromatography pulsed amperometric detection Zeit (min) PAD-Response Fucose GalNAc GlcNAc Galactose Glucose Mannose NANA Säule: mm i.d., stationäre Phase: CarboPakPA100, mobile Phase: 21 mmol/l NaOH, Flussrate: 1,0 ml/min, Detektion: PAD (E 1 =50mV, E 2 = 650 mv, E 3 = 950 mv, t 1 = 300 ms, t 2 =60ms, t 3 =60ms), Injektionsvolumen: 20 µl. 9

10 3. Ausgewählte für Zucker 3.3 HPAEC PAD High ph anion exchange chromatography pulsed amperometric detection Zeit (min) Chromatogramm von (1 4) a D Glycanen (kurzkettige Amylose EX 1). Peak 1 50: DP 1... DP 50, Säule: mm i.d., stationäre Phase: HPIC AS6, mobile Phase: A: 150 mm NaOH und B: A mm NaAc (Gradienten Programm I), Flussrate: 1,0 ml/min, Detektion: PAD (E 1 = 100 mv, E 2 = 600 mv, E 3 = 800 mv, t 1 = 300 ms, t 2 = 120 ms, t 3 = 300 ms, Empfindlichkeit: 10 K na Injektionsvolumen: 50 µl. 10

11 3. Ausgewählte LC Trennsysteme für Zucker 3.4 Ligandenaustausch LC S-DVB S-DVB SO 3 - H 2 O SO 3 - Ca 2+ H 2 O H 2 O hydrophile WW OH-Glucose 11

12 Ligandenaustauschchromatographie 1 Glucose 2 Fructose 3 Glycerin 4 Ethanol Chromatographische Bedingungen: 5 sec. Butanol als innerer Standard 2 X 10-6 RIU 4 Start Säule: mobile Phase: Flussrate: Druck: Polyspher CHCA Wasser 0,4 ml/min 5,2 Mpa 3 30 min Time

13 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik Sample preparation?: is very easy! µl wine in 10 ml deionized or bidestilled water (1:100 V/V) - or 10 µl wine in 1 ml water, - or 1µl wine in 100 µl water, - Injection of 20 µl of such a sample solution in to a HPLC apparatus.

14 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.1 Problematik der Zuckergehalte Trockner Rotwein Glc: 1,4 g/l Fru: 2,5 g/l Süßer Weißwein Glc: 23,6 g/l Fru: 25,3 g/l 14

15 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.1 Problematik der Zuckergehalte Moselwein Glc: 6,4 g/l Fru: 36,6 g/l Süßer Weißwein Glc: 24,1 g/l Fru: 24,3 g/l 15

16 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.1 Problematik der Zuckergehalte Lemon Alcopop Glc: 24,4 g/l Fru: 24,5 g/l EtOH: 2,5 % Barcardi Alcopop Glc: 49,1 g/l Fru: 51,1 g/l EtOH: 9,8 % 16

17 Alcopops

18 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.1 Problematik der Zuckergehalte Rote Johanna (Likör) Glc: 88,8 g/l Fru: 83,3 g/l EtOH: 17,8 % Stephanie Likör Glc: 75,6 g/l Fru: 92,5 g/l EtOH: 4,9 % 18

19 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol (Metabolisierung findet in der Leber und im GIT statt) Abbau Vorgang: im Zytoplasma Ethanol H 3 C CH 2 OH Dehydrogenierung (Zytoplasma) NAD + Acetaldehyd H 3 C C O H Alkoholdehydrogenase Acetaldehyddehydrogenase NAD + + H 2 O H 3 C Acetat C O O H + NADH + H + NADH + H + 19

20 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.2 Biochemische Abbauvorgänge von Alkohol MEOS: mikrosomales ethanol oxidierendes System NADPH + H + NADP + NADPH + H + NADP + Ethanol H 3 C CH 2 OH MEOS (Endoplasmatisches Retikulum) O 2 2 H 2 O Acetaldehyd H 3 C C O H O 2 H 2 O H 3 C Acetat C O O H + 20

21 4. Ergebnisse der Wein und Alcopop Analytik 4.3 Weingenuss versus Alkohol Abusus Formel nach Widmar: M: Masse des getrunkenen Alkohols [g] Km: Körpermasse [kg] r: Reduktionsfaktor, Männer: 0,7/Frauen: 0,6 c: BAK in [ 0 / 00 ], Blutalkoholkonzentration in Promille M = Km. c. r c = M / c. r 21

22 Ein Gedanken Experiment!? in vino veritas Fall 1: M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol, 100 ml Alkohol = 80 g Alhohol) Km: 110 [kg] r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7 c: BAK in [ 0 / 00 ]?, c = M / Km. r = 80 g / 110 kg. 0,7 c = 80 g / 77 g [ 0 / 00 ] = 1,04 Promille 22

23 Ein Gedanken Experiment!? in vino veritas Fall 2: M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol, 100 ml Alkohol = 80 g Alhohol) Km: 60 [kg] r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6 c: BAK in [ 0 / 00 ]?, c = M / Km. r = 80 g / 60 kg. 0,7 c = 80 g / 36 g [ 0 / 00 ] = 2,22 Promille 23

24 Ein Gedanken Experiment!? in vino veritas Fall 2: Normal Typ M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol, 100 ml Alkohol = 80 g Alhohol) Km: 60 [kg] r: Reduktionsfaktor, Frau: 0,6 c: 2,22 Promille Alkohol Abbau: 0,15 Promille/Stunde: Die Frau ist nach 15 Stunden clean. 24

25 Ein Gedanken Experiment!? in vino veritas Fall 1: MEOS Typ M: 80 g (1 Liter Weißwein, 10% Alkohol, 100 ml Alkohol = 80 g Alhohol) Km: 110 [kg] r: Reduktionsfaktor, Mann: 0,7 c: 1,04 Promille Alkohol Abbau: 0,35 Promille/Stunde: Der Mann ist in 3 Stunden clean. 25

26 5. Ein kleines Resümee LEC ist für einfache Zuckertrennungen von Weinen und Alcopos gut geeignet. HPAEC PAD und MS sind für sensitive Zuckerbestimmungen prädestiniert. Vorsicht vor Alcopops, süßen Weinen und Zucker Likören! Bevorzugen Sie trockene Weine! In vino veritas Vielen Dank! 26

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